Determinación de Endotoxinas Bacterianas - MGA 0316 PDF

calentamiento de las soluciones en el capilar y por lo tant E. N. falta de reproducibilidad en los tiempos de miran anto, Does o Pi (cinético y de punto final), basado en el pertinente bajar la concentraci...

calentamiento de las soluciones en el capilar y por lo tant E. N. falta de reproducibilidad en los tiempos de miran anto, Does o Pi (cinético y de punto final), basado en el pertinente bajar la concentración del sistema amortiguador, es su st - llo de turbiedad después de la ruptura de un factible disminuir el voltaje aplicado para disminuir la "E TO EnCogeno. corriente generada. Cromogénico (cinético y de punto final), basado en el desarrollo de color después de la ruptura del complejo 8) Durante la separación la corriente generada debe de sintético péptido-cromógeno. r ermanecer constante con ! una variación entre 3 yy 1 10 HA En caso de duda o controversia, la decisión final se toma | Pp , durante toda la corrida. Si se emplea el mismo capilar y basándose en el Método A. Formación de un gel, a menos que electrolito soporte esta corriente será reproducible en cada hos indique algo diferente en la monografía del producto en análisis. Si la corriente cac a un valor cercano de cero, es análisis. necesario detener la corrida porque es indicio de algún problema como pudiera ser: MATERIAL Y EQUIPO Que algún vial tenga la tapa mojada o alguna solución presente Ne estable al calor. Debe estar libre de endotoxinas y burbujas, que el capilar está tapado o roto, que la posición de Cee con la prueba. Utilizar ciclos de los viales con electrolito soporte para la corrida no esté bien despir ogenización con calor seco a 250 *C por lo menos programado en el método, etc. e min o las condiciones establecidas durante la validación el proceso. 9) El lavado entre corridas es muy importante porque debe de Material ee Cuando se utilicen microplacas, puntas asegurar que la pared interna del capilar quede limpia y lista re. P mi ticas, jeringas, etc., demostrar que están para el siguiente análisis. Si las muestras son simples, un Pres Ce EnUataxinas: lavado con el mismo electrolito soporte es suficiente pero si REACTIVOS son complejas como extractos vegetales, fluidos biológicos, Nota: todas las soluciones utilizadas en la prueba deben estar será necesario lavar con agua, NaOH 0.1 M, agua y electrolito libres de endotoxina bacteriana. soporte. Este lavado es parte del desarrollo del método a fin de Control estándar de endotoxina (CEE). Preparación de garantizar la reproducibilidad del mismo. endotoxina de Escherichia coli caracterizada y estandarizada * La longitud del capilar al detector es menor a la longitud total cuando eontranna endotoxina de referencia que ha sido calibrada con se emplean detectores espectrofotométricos, tal y como se observa en» Tespecto al estándar internacional de endotoxina de la la figura 0312.5. Organización Mundial de Salud. Una Unidad Internacional (UT) + Comercialmente ya existen capilares adecuados de acuerdo al de endotoxina es equivalente " El Unidad de Edoremina (UE) tamaño molecular de los analitos que se desean separar. Tisado de amebocitos (LAL). a $ Este medio de separación es más fácil de preparar, ya que con Limulus es un extracto acuoso de células sanguíneas presión se llena la capilar neutro con la po. ón " (amebocitos) del cangrejo herradura (Limulus polyphemus), ,. N.. preparado y caracterizado reactivo. También para usarse como Ést | **Si es necesario, usar aditivos como glicerol, surfactantes, urea o de ob Tachvol. de ident. ti soluciones zwitteriónicas. Sin embargo, dependiendo de la € o mo. Jl mu. ESTA E he de Teac E se concentración empleada, la urea causa desnaturalización de retiere so amente al pro ucto manutacturado de acuerdo con proteínas. las regulaciones de la autoridad competente. (Nota: el reactivo de amebocitos de Limulus también reacciona con algunos B-glucanos. Hay disponibles Lisados de , amebocitos que no reaccionan con glucanos: Se prepara | MGA 0316. DETERMINACIÓN DE removiendo del Lisado el factor G que reacciona con los ENDOTOXIN ASB ACTERI AN AS glucanos o inhibiéndolo, de esta forma puede ser utilizado | para la prueba de endotoxina en presencia de glucanos). , ; Agua - libre de endotoxinas , (ALE). Es el ,diluyente de i i vas, son la causa mas Mod ei de imc e Po.a la contami , inación de elección y no debe reaccionar con el reactivo de LAL. común de reacciones tóxicas asociadas productos farmacéuticos y artículos médicos. Las endotoxinas PREPARACIÓN DE REACTIVOS ee apolisacaridos cuya actividad es mayor que la de otras Estándar de endotoxina. Para reconstituir y almacenar el E la N Eu diferente. : ¡liza el estándar, seguir las instrucciones del fabricante. La prueba para determinar o cuantificar ndo " A partir de esta solución concentrada preparar las diluciones i i ¡ eu.. e e. —— de amebocitos de Limulus polyphemus 0 1 act de prueba, para evitar pérdida de actividad por adsorción _—- usarlas en el menor tiempo posible a menos que las condiciones | ridentatus. y periodos de almacenamiento se validen. Existen dos métodos para esta determinación: Método A: Formación de un gel. Lisado de a Reconetitur el reacio con = y" de endotoxina (ALE) o solución amortiguadora, siguiendo las A Método B:. Fotométrico, Po, i que dependiendo de la fo rma de. instrucciones del fabricante. , Mezclar suavemente, evitando la cuantificación puede ser: Scanned ACE Scanner with ACE Scanned with —l.aUl_]ozo=< 981 i idos Mexicano 513.0 los Estados Unid 66 Farmacopea de - QSITIVOS MÉDICOS tituido en DISP ma dilución válida para dispositivos médicos se Almacenar el lisado recons La Nes ndo el límite de endotoxina entre la Sensibilidad formación de espuma” “ de acuerdo a las calcula dividie refrigeración o congelación, le del reactivo de LAL ulsilizado: a ¡ recomendaciones de el fabricante. , MDV = Límite de endotoxina ; e. (UE/dispositi vo)/7 k DE h LA MUE! STRA : Algunas : mi : PREPARACIÓN Disolver, diluir o ó xtraer la muestra usando ALL" cn para dispositivos médicos el límite de endotoxina NO es mayor " 5 se diluyen 0 extraen meyc * ara UE/dispositivo, excepto para dispositivos sustancias o preparaciones s ie la mezcla del lisado y en Contacto a 20.0 — falorraquídeo, en este caso el límite se otras soluciones acuosas. El p " 10 del intervalo especificado con el líquido ce 2.15 UE dispositivo solución de prueba debe estar e" co. entre 6.0 y 8.0, en considera no mayor a 2. Hhricante del lisado, usual ¡ón de por el fabricante E cin de ÍA de la solución d ; ñ caso necesario, ajustar el ajuste de Pjorhídrico, hidróxido de ESTABLECIMIENTO DE LÍMITES DE prueba, utilizar soluciones de ácido.. ¿ndada por el ENDOTOXINA S : A Comrespon dencia de ada ón la monografía sodio o la solución amortiguadora recomenda fabricante del reactivo de LAL. endotoxina de la muestra no está especificado, emplear la , sy a 2 L : Dispositivos médicos. Para artículos médicos emplear de 3 7 siguiente fórmula Límite de endotozina = K / M 10 muestras. Considerando el tamaño y forma de éstos enjuagar o remojar y agitar con ALE. Colectar el "E T de enjuague o extracción y determinar la o Do ¡er: de los mé “todos> xi por cualquiera endotoxina descritos. a, de onde:. do e dotos: Para dispositivos etiquetados como “catéter no pirogénico K = Dosis umbral pirogénica de En Ms SEN humanos por enjuagar las paredes internas del catéter con el líquido de kilogramo de peso corporal y es igua a /kg para cualquier extracción a una temperatura de 37 + 1.0 “C. Mantener el vía de administración, excepto para la intratecal, en donde K es líquido de extracción en contacto con la zona crítica del igual a 0.2 UE/kg. catéter por lo menos 1 h a temperatura ambiente controlada. M= Dosis máxima recomendada del producto en humanos por Si se considera apropiado, mezclar los extractos. kilogramo de peso corporal. Cuando el producto es inyectado a , , , intervalos frecuentes o de transfusión continua, M es la dosis DETERMINACIÓN DE LA MAXIMA DILUCIÓN total máxima administrada en un periodo de una hora. VALIDA (MDV) La máxima dilución válida es la dilución máxima permitida Para radiofármacos que no se administran por vía intratecal, el de una muestra en la que el límite de endotoxina puede límite se calcula mediante la siguiente fórmula: determinarse. Cuando el límite de endotoxina se expresa en volumen en la Límite de endotoxina = 175 / V monografía del producto, la MDV se calcula mediante la siguiente fórmula: Donde: MDV = Límite o de endotoxina/2 Y = Dosis máxi ax1ma recomendada por mililitro. ilili Donde: Para radiofármacos que se administran por vía intratecal, el mie e: endotoxina = Concentración máxima de endotoxina límite de endotoxina se calcula mediante la fórmula: "da en rastntón mí un producto, que no produ ce una respuesta clíni FT sc administra a la dosis indicada mi. - > ensioiidad del lisado indicada pr Límite de endotoxina = 14 /v Expresade en el marbete Y delel r :. P PU estándarT :En los05UEMm_, ensayos o cuantitativos, ensayos lacrantivos- concentración más baja de la Rm. cu Iva era formulaciones (por lo general productos oncológicos), u ini L e vote ministran por m” de superficie. corporal, la Cuando el límit € Tmula es: de endotoxina s - del product Ses 4 Se Expresa en la mo ao activo, 95 | 1a MDV e ST selrminos calcula demediante masa o unidad del pri Mografía Límite de endotoxina = K /M e la la Siguiente sio; o utipro fórmula: MDV = Límite de endotoxi Donde: Dond e: En K-25UERS M= (dosi E es Concentración del Sis 2 prod Máxima /m*/ hora x 1.80 m?/ 70 kg Producto reconstituj Producto en la Solución d marbete, expreco ido de Acuerdo a las in di Dispociss € prueba o del p Positivos médicos. E Sada en U 1Cacione ara disposit; de. Diológica. Emgo UE/Unidad de E... , ayor a20.0 da médicos el límite de endotoxina no es y vidad con lan: dispositivo excepto para dispositivos en contacto lqQuido cefalorraguí PA 2.15 UE/qi ora aquídeo donde el límite no es may : d dispositivo, Scanned with Scanned Scanner ACE Scanner with ACE |. LS EME COERESDE ANSeS TU El límite de o el E enjuague o final de la serie de diluciones empleadas. extracción se calcu a por la siguiente fórmula: f = Númerode réplicas. (KN) / () Donde 7 el resultado de la media geométrica se encuentra entre 0.5 y E Cantidad de endotoxina permitida por dispositivo. Ade la sensibilidad indicada en el marbete, el reactivo puede y = Número de dispositivos evaluados. utilizarse. Véase ejemplo en rabla 0316.1. y —- Volumen total del líquido de extracción o enjuague. Tabla 0316.1. Ejemplo. PRUEBAS PRELIMINARES Concentración de endotoxina La validez de los resultados de la prueba de endotoxinas por Sensibilidad = 0.125 UE/mL cualquiera de los métodos de formación de gel propuestos, Réplica 0.25 0.125 0.0625 0.031 ! requiere: UE/mL UE/mL UE/mL UE/mL e Verificar la sensibilidad del lisado. o?) (1) (052) (0254 e Demostrar la ausencia de factores que interfieran con la + + - - prueba en la muestra, en su solución, enjuague o Z " " - extracto. 3 * " L - 4 + + + - MÉTODO DE FORMACIÓN DE GEL Verificación de la sensibilidad del lisado. Efectuar la prueba Ze =log 0.125 + log 0.125 + log 0.0625 + log 0.0625 ' cada vez que se utilice un nuevo lote del reactivo y/o se 2e =(—0.9030) + (—0.9030) + (1.2041) + (—1.2041) modifiquen las condiciones experimentales. Le =-4.2142/4=-1.05353 A partir del control estándar de endotoxina CEE, preparar 4 aC AA diferentes concentraciones con un factor de dilución de dos La sensibilidad del reactivo se confirma ya que el resultado de equivalentes a 2; 1; 0.5 y 0.25 A y llevar a cabo por lo menos la media geométrica se encuentra entre 0.5 y 2 A. cuarro réplicas, incluir un control negativo (agua libre de endotoxina). Factores de interferencia. Son factores presentes en la En cada tubo de prueba mezclar volúmenes iguales muestra que pueden ocasionar resultados falsos positivos o (generalmente 0.1 mL) del reactivo de LAL y de la solución Deganvos: Repetir la prueba, siempre quese presenten + estrenan Cuando se usen tabs cone cambios en alguna de las condiciones que pudieran influir en reactivo de LAL liofilizado, añadir directamente la solución de El resultado esla a sma como por ejemplo, Ta Menta prueba. Incubar la mezcla E las condiciones señaladas por el reactivo, las condiciones ue MoncaCión del producto y/o fabricante (generalmente de 37 + 1 *C durante 60 = 2 min) condiciones experimentales, que incidan en los resultados de > > V la prueba. evitar vibraciones. Al finalizar el periodo de incubación, tomar cada tubo e Preparar las soluciones A, B, C y D como se indica en la tabla invertirlo 180* con un movimiento suave. Considerar una 0316.2. La solución de prueba se utiliza en una dilución prueba positiva cuando el gel permanezca integro al invertir el menor a su MDV que no contenga endotoxina detectable. tubo y una prueba negativa cuando no haya formación de un Llevar a cabo la prueba de acuerdo al procedimiento descrito gel firme. en la verificación de la sensibilidad del lisado, y diluir la La prueba se considera válida si: endotoxina en solución de prueba o en agua libre de * El agua libre de endotoxinas (control negativo) da un endotoxinas.. Alem resultado negativo. La prueba se considera válida si: * En la concentración más baja de CEE el resultado en * En las soluciones A y D la reacción es negativa. todas las réplicas es negativo. * El resultado en la solución C confirma la sensibilidad El punto final se define como el último resultado positivo en la del lisado indicada en el marbete. serie de diluciones de endotoxina... Se considera que la muestra no contiene factores de Cálculos. Calcular la medía geométrica de las concentraciones» interferencia si el resultado de la media geométrica en la del punto final de la siguiente manera: solución B se encuentra entre 0.5 y 2 A. En caso contrario repetir la prueba utilizando una dilución M= antilog [O e)/ f ] mayor sin exceder a la MDV y/o el uso de un lisado con mayor sensibilidad. Para eliminar o disminuir los factores de Donde: interferencia en la muestra, se pueden emplear métodos como: M= Media geométrica de la concentración del punto final. dilución, ultrafiltración, ajuste de pH, calentamiento, diálisis, Ye = Suma de logaritmos de las concentraciones del punto adición de agentes dispersantes o tensoactivos. Scanned with Scanned with ACE ACE Scanner. icanos 13.0 368 Farmacopea de los Estados Unidos Mexican ión de soluciones par: , Tabla 03162. PrEpracióden SOLE dogo, ¡ón luciones de solucior para la prueba de Tabla 0316.3. Preparac ———— para la prueba límite, Coneentración—— TT Solución U. E Réplicas Concentración endotoxina Solución final de Réplicas A Solución de prueba ——— ; net ——— B Solución de prueba 2% 2 A Solución de prueba — 4 C Agua libre de endotoxina 2X 2 B Solución de prueba 2 N 4 D Agua libre de endotoxina === 2 ! 4 0.5X “ ión d b 0.25» 4 Solución A = Solución e prueba que no exceda la MD y ———ámáeke 2 2 Solución B = Control positivo del producto. Solución de (e o ón a 2 prueba conteniendo endotoxina a una concentración fina] e uu S — 052 2 de 22. 0 25 X 2 Solución C = Control positivo de agua. aa Ca Solución D = Control negativo de agua. Agua li — — — ue — MÉTODO 2. Método de formación de gel (Prueba Solución A = Solución de prueba que no exceda la MDV libre semicuantitativa). Preparar las soluciones A, B, C y D como de endotoxina detectable. se muestra en la tabla 0316.4. Realizar la prueba de acuerdo al Solución B = Solución de prueba adicionada de endotoxina. procedimiento descrito en la verificación de la sensibilidad del Solución C = Control de sensibilidad del lisado. lisado. Solución D = Control negativo de agua para la prueba de La prueba se considera válida si: endotoxina. — * Los resultados de la solución D son negativos. DETERMINACIÓN DE ENDOTOXINAS * Los resultados de la solución B son positivos. MÉTODO 1. Método de formación de gel (Prueba límite) Preparar las soluciones A, B, C y D indicadas en la rabla. - media Aga de la concentración del punto final de la 03 16.3. Llevar a cabo la prueba de acuerdo al procedimiento Orución C, se encuentra en el intervalo de 0.5 a 27. —. en la verificación de la sensibilidad del lisado. La _ se considera válida si: Tabla 0316.4. Preparación de soluciones para la prueba - _ ra en la solución D son negativos. semicuantitativa. as soluci uciones B y C los resultados son positivos. “ _—————_XX——0e————[—— Solució Factor — Concentración La muestra cumple con la prueba, si las réplicas de |.. ea de 5 dan resultado negativo. final de Repuicos PICs de la solución A Soluci 4 muestra no cumple co dilución endotoxina resultados positivo _ ar e ndo Se obtienen olución de l ” 2 1Cas de la prueba la prueba cuando se obtiene un result. 1á solución A. Repetir... Solución de 2 — y, determinación de la solución A y meo Positivo para una prueba Plica, Téplica. LaL- muestra En análisis cump| un result “do negativo y para la Solución de 4 En la repetición SE obtienen re l ple con la prueba, cuando erueba. ? determinaciones de la solució sultados negativos en ambas Solució la prueba sí se obtiene y, v A. La muestra N0 cumple con o Pe de 8 _ 2 determinacio y nes repetidas., Tesultado positivo prueba de 1......, Si la muestra no cu - de la solución A. Para unaq ambas Br Sam bn ei e a 8 Solución de l 22 2 la MDV, repti 1, > Tepetir la prueba € COMem la ! prueba a una 41, prueba NO excede [a MDV una dilución Picando una dilución menor d e Er —h———— Agua libre de 1 21 2 En caso de sospechar l Mayor que Endotoxina Serie de diluci 4 presencia de end , 2 1A 2 | 0 ot 2 excedan | LES con un factor de diluc; OxXIna, efectuar una 4 2 Mpy Y Proceder de " Nución de dos que no 0.5% uerdo aj método 2, D 8 0.25% 2 Agua libre de Na E 2 Scanned ACE Scanner with ACE Scanned with  METODOS GENERALES DE ANÁLISIS — 369 cáleulos- La concentración de endotoxina en la muestra se L determina multiplicando la dilución en el punto final “ ) para cada seriei de réplic a cda se lleva a cabo a la temperatura y tiempo de ¿poli as. Véase : : la para el la fórmu in ió ación recomendada por el fabricante del lisado cálculo de la media geométrica en la verificación de la ormalmente 37 + | O). ensibilidad del lisado. Si la muestra se diluyó, calcular la Método cromogéni , conce “utipntrac licanión endottado do elde resul soluc oxinapor enla ladiluc ión original, liberado de Bemico. En este método se mide el cromóforo ión. Inendoton un péptido cromogénico, al reaccionar el lisado con e - a ina. si ninguna de las diluciones de la Muestra es positiva, en una El método de punto final. se b ió itati prueba válida, informar la concentración de endotoxina como Entre la concentració Cendutos ón atE menor al valor de A (si se analizó una muestra diluida cromóforo ls si de endotoxina y la cantidad de ua o > r i ; del periodo de incubación. 4 informar como menor que A multiplicado por el factor de El método mp no:. , ide el t ba , deió : dilución más bajo de la muestra). Si todas las diluciones son alcanzar una absorbancia ia positivas, la concentración de endotoxina se informa como desarrollado. E : igual o mayoravor q que la mayor diluciónE: multiplic — plicada por 2. La prueba se lleva a cabo en las condiciones recomendadas por La muestra cumple con los requerimientos de la prueba si la el fabricante del lisado (normalmente 37 + 1 C ). concentración de endotoxina en ambas réplicas es menor a la especificada en la monografía individual. PRUEBAS PRELIMINARES Dispositivos médicos Antes de llevar a cabo los métodos fotométricos es necesario: ei * Asegurar | iteri á En el caso de detectarse endotoxina en la prueba límite, a Que la solución de e la a — calcular la concentración de acuerdo a la siguiente fórmula: prueva NO MECLSTErS un E CIA Criterios para la curva estándar. La prueba debe realizarse a UE/DiDisp sp ositivo = (4(4 xx V/V/N)N) x Factor or de de diluc dilucióión EP de la soluc contro cada lote de reactivo de LAL. A partir ión l Donde: estándar de endotoxina (CEE), preparar una curva estándar N= Número de dispositivos evaluados utilizando al menos tres diluciones por triplicado. Efectuar la y - Volumen total del líquido de extracción o enjuague prueba de acuerdo a las recomendaciones del fabricante del - lisado (relación de volumen, tiempo, temperatura de Los dispositivos que no puedan ser analizados por el método incubación, pH, etc.). de endotoxina bacteriana por no cumplir con la prueba de Si el intervalo deseado es mayor de 2 log en los métodos factores de interferencia deben cumplir con la prueba de cinéticos, se deben incluir estándares adicionales para que cada piróggenos. enos aumento logarítmico esté comprendido en el intervalo de la a ándar. | coeficiente d Solución A. Solución de prueba a una dilución que no exceda curva end ENTE ase delcocfiaento de. la MDV vaa la cual c 16 con latoruieba de fuétores de correlación, r, debe ser mayor o igual a 0.980 para el intervalo E 7 ha o P _ de concentraciones de endotoxina utilizadas. interferencia. Las diluciones subsecuentes de la solución de prueba no deben exceder la MDV. Utilizar agua libre de Determinación de factores de interferencia. Seleccionar una endotoxina para preparar la serie de diluciones de 4 tubos concentración de endotoxina igual o cercana a la mitad de la conteniendo la solución de prueba bajo análisis a las curva estándar. concentraciones de 1, 1/2, 1/4, y 1/8 con respecto a la Preparar las soluciones A, B, C y D como se muestra en la concentración utilizada en la prueba para factores de tabla 0316.5. Realizar la prueba en las condiciones interferencia. Si se considera apropiado pueden utilizarse otras recomendadas por el fabricante del lisado (volumen del lisado diluciones mayores a la MDV. y de la solución de prueba, tiempo, de incubación, etc.). Solución B. Control positivo del producto. Solución A La prueba es válida si se cumplen las siguientes condiciones: conteniendo endotoxina estándar a una concentración final de |. El valor absoluto del coeficiente de variación de la curva 2%. estándar generada utilizando la solución C es mayor o igual a Solución C. Dos réplicas de agua para la prueba de endotoxina 0.980. "a de el límite del val conteniendo concentraciones de estándar de endotoxina 2. El resultado de la solución D ño excede e ímite del valor correspondientes a 2, 1, 0.5 y 0.25 X. del blanco requerido en la descripción del lisado empleado Solución D. Control negativo de agua para la prueba de como reactivo o es menor que el límite de detección de :. endotoxina ndotoxina del lisado empleado como reactivo...o. a Calcular la recuperación media de la endotoxina agregada MÉTO É D E restando la concentracióniÓ me dia de endotoxina en la soluci , ón, Mé Me FOT dimétrico de punto si la hubiera (solución A, tabla 0316.5), de la que contiene la todo turbidimétOME TRICOS rico. El método turbidimétrico de p. ión B, véase tabla 0316.5) fi , MA. ; tre la endotoxina agregada (solución B, vease tabla 3). gal se basa en la relac ión cuant itati va que existe entre Si lae solución e de prueba está libre. de factor Ne es de interf erenci Lo a, concentració i ¡edad (absorbancia o transmi mu. Ce endamina ye e AA de un periodo la concentración de la endotoxina adicionada ala solución de o. de la mezcla de reacción a prueba está entre 50 y 200 % de la concentración de El a “.. ,. : e la endotoxina adicionada, después de restar cualquier cantidad UD ( det mminada o de endotoxina detectada en la solución a la cual no se adicionó mezcl a de reacc ión e alcance una absorbancia predete L , endotoxina. €l grado de turbiedad desarrollada. Scanned with Scanned with ACE Scanner ACE Scanner  MGA 0321. DETERMINACIÓN DE. está fuera del intervalo Cuando el recobro de endotoxina EPINEFRINA que la soluci ón de prueba Le especificado, se considera la La ue este caso se debe repetir factores de interferencia. En El Iríe Una solución de epinefrina, al adicionar una solución de que no exceda la MDV utilizando una dilución mayor ado, desarrolla un también podra sulfato ferroso y UN amortiguador adecu factor de interferencia de la solución de prueba color azul-rojizo. La reacción de color es específica para eliminarse con un tratamiento validado como Por ejemplo. poseen grupo s fenólicos en posiciLaón orto , o. E Ao compuestos que epinefrina-ión fono filtración, neutralización. diálisis o calentamient ormándose un complejo el tratam iento elegid o elimina la interferencia establecer que ha absorbancia de esta solución se determina a una longitud rina: de sin pérdida de endotoxina, realizar la valoración quere medid a de la cantidad de epinef ala Viral se DE onda de 530 nm y es una preparación a examinar anteriormente usando la a una riormente el color varía con el pH de la solución8.5.y alcanz agregado endotoxina estándar y se ha sometido poste intens idad máxim a a un pH de 8.0a al tratamiento seleccionado. iliz r ítrica. Preparelar mí se dev ae liza día que 1 y de sulfato forroso on _. i er NAS POR LOS DETERMIN ACIÓN DE ENDOTOXI MÉTODOS FOTOMÉTRICOS cual se le ha adicionado 1.0 mL de ácido clorhídrico diluido ver 500 mg de citrato rabla 0316.5- (1:12) y 1.0 g de bisulfito de sodio. yDisol mezclar. Preparar las soluciones como se indica en la de sodio en 10 mL de esta soluc ión concen tració n de endoto xina de cada Cálculos. Calcular la matraz volumétrico de ar (solución C). Solución amortiguadora. Mezclar en un réplica de la solución A utilizando la curva estánd 50 mL, 4.2 g de bicarbonato de sodio, 5.0 g de bicarbonato La prueba se considera válida si: de potasio y 18 mL de agua (no se disuelven todos los sólidos). e el e El resultado obtenido en la solución D no exced agua, 3.75 g de ácido fabric ante del lisado Por separado adicionar, en 18 mL de limite del valor especificado por el xido de amonio aminoacético y 1.7 mL de solución de hidró o es menor que el límite de detección del lisado solución al matraz 6 N, mezclar y disolver, transferir esta otra mezala. Diuieal empleado. 50 mL que conti ene la estándar (solución volumétrico de e Los resultados obtenidos en la curva ón sea la volumen con agua y mezclar hasta que la soluci C) cumplen con los requerimientos definidos en completa. validación. e La concentración de endotoxina determinada en la Preparación de referencia. Pesar de 18 mg de la SRef de solución B, después de restar la cuantificada en la bitartrato de epinefrina y transferir a un matraz volumétrico de solución A, debe estar en el intervalo entre 50 y 200 %. 100 mL con ayuda de 20 mL de solución de bisulfito de sodio de no _ Ne aun o d =- e “ hr La muestra cumple con la prueba si la concentración media. E Na E : mL, tomar diluir al volumen o endotoxina de las réplicas de la solución A, después de on solución de bisulfito de sodio (1 en 500) la correc ción por diluci ón y conce ntrac ión, es menor en cuenta y mezelar, SN. del límite de endotoxina especificado en la monografía del Nota: hacer la dilución final al efectuar la prueba. producto. Esta solución tiene una concentración de bitartrato de Tabla 0316.5. Preparación de soluciones para la prueba de epinefrina de aproximadamente 18 ng/mL.. interferencia en los métodos fotométricos. Preparación de la muestra. Transferir un volumen —— e eo — KR — exactamente medido equivalente a 500 ug de epinefrina a un solución n de Réplicas matraz volumétrico de 50 mL, diluir al volumen con —- gt “E —— (1 en 500) de bisulfito de sodio y mezclar. my la concentración final de bisulf ito de sodio es de 14 O UT mg/mL, tomar en cuent a cualq uier otro bisulfito presente en u e Solución de e B prueba media de la curva ETA me" pi r Transferir: a cada uno de tres matraces E" Agualibre de — Al menos tres E alícuotas de 20 mL de la preparación de referencia, de la C—— endotoxinas — concentraciones la E q El ens00)r. Mao y ala sue ar de - —Más bajes concentración en: 00) respectivamente. A cada matraz añadir 200 pl oo solución ferrocítrica de sodio y 2 mL de la solución gua Jibre de —— ntración -— mezclar y dejar reposar las soluciones durante "O : un minar las absorbancias Solución A = Solució a exceder la MDV, En un espectrofotómetro adecuado, deter Solución B = Solución - _ de las soluciones en celdas de 5 cma la longitud de onda de una concentración igual o cercana pi de endotoxina a estándar (controles positivos) enla (ene Calcular la cantidad o la " : muestra, cor 1 " 0) En me por mE Solución D - utilizadas en la validación del to » Con la siguiente fórmula: endotoxina ontrol negativo de agua para la pru ebate de - (183.21 / 333.29) (0.05 C / V) (Am / Aref) Scanned with Scanned with ACE Scanner ACE Scanner