Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos PDF

# Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos ## Secuenciación de AN - Es el proceso de determinación de la secuencia de nt que componen una molécula de ADN/ARN y se representa por las iniciales de las bases. - Consiste en determinar el orden (secuencia) de los NT. - La secuencia de la cadena sie...

# Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos ## Secuenciación de AN - Es el proceso de determinación de la secuencia de nt que componen una molécula de ADN/ARN y se representa por las iniciales de las bases. - Consiste en determinar el orden (secuencia) de los NT. - La secuencia de la cadena siempre se da 5' 3' tanto para ANss como para ANds (la cadena 3' 5' es la complementaria). ## Secuenciación de AN - En un principio la secuenciación se realizó en ARN, pero desde 1980 se desarrolló más rápido en ADN. - En un principio se desarrollaron técnicas manuales basadas en reacciones químicas y métodos enzimáticos. - Posteriormente con la PCR y la electroforesis capilar, los métodos enzimáticos fueron mas eficientes, y dieron lugar a procesos de secuenciación automatizados de primera generación. - Perfeccionamiento de métodos automatizados, y diseño de nuevas metodologías enzimáticas como la pirosecuensación, dan lugar a métodos de segunda generación. - En la actualidad hay equipos de tercera generación, capaces de secuenciar una única molécula de ADN. - Todo esto, junto con potentes programas informáticos de análisis de datos (tratar muchos datos, rápido y eficaz) y estrategias de secuenciación de grandes moléculas, han permitido secuenciar genomas enteros de numerosas especies. ## Método químico Maxam y Gilbert - Se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas. - Permite la secuenciación de fragmentos cortos de ADN. - Necesarias cantidades elevadas de ADN purificado. ### Fases 1. **Preparación ADNss.** Marcaje de uno de los extremos de la molécula con isótopo 32P. - Se elimina el primer P en 5' con fosfatasa alcalina. - Se fosforila con polinuleotido kinasa +ATP marcado con 32P 2. **Reacciones de modificación química de las bases nitrogenadas** - Modificación de nº pequeño de NT en c/molécula, debido a la concentración de los reactivos y las condiciones en las que se hace la reacción. - Se divide la muestra en 4 alícuotas. - En cada tubo se modifica un NT específico con un tipo de reacción diferente. 3. **Electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución (10-20%)** - Condiciones desnaturalizantes. - Separa por tamaños diferentes que hay en cada tubo. - Los productos de las 4 reacciones se corren en paralelo. 4. **Autorradiografía en gel** - Proporciona una secuencia de bandas oscuras en cada una de las 4 calles , corresponden a los fragmentos marcados obtenidos en cada tubo. 5. **Análisis de la autorradiografía** - Permite descifrar la secuencia de la molécula en estudio según el orden escalonado de bandas en las 4 calles. - La secuencia se lee de abajo a arriba 5'3' ## Métodos enzimáticos de terminación de cadena - Métodos enzimáticos basados en reacciones de polimerización de cadenas complementarias a la que se quiere secuanciar. - A la mezcla de reacción se le añaden desoxinucleótidos trifosfato (NTP) + didesoxinucleótidos triifosfato (ddNTP). - ddNTP carecen de -OH en 3', por lo que no puede unirse a otro NT. - Cuando se añaden a la cadena en crecimiento se detiene la síntesis, porque no se pueden añadir más NT. - Terminadores de cadena. ### Método de Sanger - El método original para secuanciar cadenas cortas de ADN monocatenario. 4 fases: - Reacción de polimerización. - Electroforesis en gel. - Autorradiografía. - Análisis de resultados. - 4 alícuotas de la mezcla, para una reaccion de polimerización en c/u por cada BN. Cada tubo tiene: - ADN molde + Cebador marcado con 32p. - ADN pol. - 4 dNTP. - 1 ddNTP para cada reacción. - La ADNpol extiende el cebador marcado, sintetizando la cadena complementaria de la hebra molde. - Por azar incorpora un ddNT, lo que detiene la elongación. ### Electroforesis - Electroforesis de alta resolución. - Los fragmentos marcados se separan con un resolución de un solo NT. - Los productos de las 4 reacciones se corren en paralelo. ### Análisis de autorradiografía - En c/calle elúltimo NT (3')que se añadió es el ddNT del tubo correspondiente. - Se puede determinar la secuencia escalonando las 4 bandas. - La lectura es la hebra complementaria a la hebra molde se lee de abajo a arriba 5'3'. - La hebra molde es la. ## Métodos enzimáticos de terminación de cadena - En lugar de marcar el cebador se puede marcar: dNTPs o ddNTPs. - Marcaje radiactivo o fluorescente ## Secuenciación automática de 1ª generación - Se basa en el método enzimático de terminación de cadena de Sanger y en el uso de 4 fluoróforos como marcadores. - Utiliza secuenciadores automáticos☐, electroforesis en gel o capilar y detección de bandas y análisis. - PCR proporciona dos ventajas: - Requiere menor cantidad del ADN que se quiere secuenciar. - Se puede amplificar a partir de mezcla compleja de ADNds. ### Secuenciación con cebador fluorescente - Cuatro tubos separados. - Cada tubo con el mismo cebador pero marcado con fluoróforo distinto. - Cada tubo con el ddNTP correspondiente, se asocia con un color a cada uno. - Cada tubo tiene todos los fragmentos posibles marcados con el fluorocromo en 5'. - Los productos de las 4 PCR se mezclan en un tubo. - Se cargan en el secuenciador. ### Secuenciación con terminador fluorescente - Se hace una única PCR en un tubo. - 4 ddNTPs marcados con fluorocromo distinto. - Cebador sin marcar. - El tubo contiene una mezcla de todos los fragmentos posibles con el ddNTP 3' fluorecente. - Se cargan en el secuenciador. ### Secuenciación automática de 1ª generación - Los instrumentos automáticos se diferencian por el sistema de electroforesis que utilizan: - En gel: - Geles planos poliacrilamida. - Ultrafinos (<200μm) - Hasta 96 muestras. - 200 bases/hora x muestra. - Capilar: - Capilares de sílice. - Con polímero soporte. - 500 bases/horas. - Recargas ### Secuenciación automática de 1ª generación - ADN marcado alcanza la ventana de lectura, un láser excita y el floróforo emite fluorescencia a una longitud de onda determinada. - Se capta por un detector y se refleja como un pico de fluorescencia. - Se hace un electroferograma. - A verde - T rojo - G negro - C azul ### Secuenciación automática de 1ª generación - Si se utiliza un cebador forward, la secuencia coindice con la cadena 5'→3' del ADNds. - Si se utiliza un cebador reverse, la secuencia es obtenia es la complemententaria en sentido inverso de 5'→3' de ADNds. ## Secuenciación a gran escala - Los secuenciadores de 1ª generación utilizan sistemas electroforéticos, que permiten secuenciar fragmentos de hasta 1000 bases en un única reacción. - La secuenciación a gran escala permite secuenciar fragmentos mucho mayores de 1000 bases e incluso genomas completos. - Combinación de técnicas de secuenciación con clonación. ### Paseo cromosómico - El genoma se digiere parcialmente y se clona completo para obtener una biblioteca genómica. - Se secuencia un clon, y se utiliza el extremo de su secuencia para hacer una sonda que localice un clon que solape con la secuencia del clon anterior ### Método shotgun - Se fragmenta aleatoriamente el genoma. - Estos fragmentos se clonan en bacterias Biblioteca genómica. - Se secuencian todos los clones de manera independiente. - Se ensambla la secuencia usando un software. ## Otros análisis con secuenciador ### Análisis de fragmentos - Fragmentos de PCR se generan con cebador fluorescente y sistema automático de PCR. - Detección de deleciones e inserciones. - Identificación de individuos. - Estudios de paternidad - Detección de quimeras - pacientes con trasplante de médula ósea. ## Secuenciación masiva - Surge de la necesidad de secuenciar genomas completos individuales en poco tiempo. - Secuenciación de 2ª generación NGS. ### Secuenciación masiva - Automatización de todo el proceso. - 1. Preparación del ADN molde - 2. Secuenciación - 3. Análisis de datos ### Preparación del ADN molde - Fragmentación al azar del genoma. - Métodos físicos o enzimáticos. - Unión a los extremos dos adaptadores universales. - Se obtiene una biblioteca con extremos universales. - Se puede amplificar toda la biblioteca con un solo juego de cebadores complementarios a los adaptadores. - Una vez seleccionados los fragmentos de la biblioteca que tienen tamaño adecuado para secuenciación 200-250pb. - Se inmovilizan sobre una superficie. ### Preparación del ADN molde - Inmovilización de ADN molde de cadena única. - Unión covalente de uno de los cebadores universales a la superficie del soporte. - Los fragmentos de la biblioteca se desnaturalizan e hibridan con los cebadores unidos al soporte y queda anclados. - La ADN pol. puede extender el cebador cuando se le une el ADN molde desnaturalizado. ### Preparación del ADN molde - Unión covalente de los fragmentos de ADN molde a la superficie del soporte sólido. - Posteriormente se hibridan con un cebador universal para comenzar la reacción de secuenciación. ### Preparación del ADN molde - Amplificación clonal del ADN molde. - Se pretende aumentar el nº de copias de cada fragmento sin que se mezclen con otros. - PCR en emulsión: emPCR. - Se utilizan microesferas recubiertas con uno de los cebadores universales. - Los fragmentos de una biblioteca, se desnaturalizan y se capturan sobre las esferas por hibridación con el cebador. - Cada esfera captura un fragmento de ADN molde. ### Preparación del ADN molde - Las esferas con el ADN molde se introducen en un tubo ependorf con una mezcla de PCR que conteien el segundo cebador universal (en fase acuosa) y se recubre con aceite. - Luegp se hace una emulsión de ambas fases, donde se forman pequeñas gotas acuosas recubiertas con aceite. - Dentro de cada gota (microreactor) hay: - Una esfera con un único fragmento de ADN, el otro cebador universal y toda la mezcla de PCR. ### Preparación del ADN molde - En estos microrreactores se lleva a cabo una PCR convencional, al final, cada esfera queda recubierta por múltiples fragmentos de ADN molde idénticos anclados a la superficie. ### Preparación del ADN molde - Una vez finalizada la PCR se elimina la emulsión. - Las esferas se fijan a la superficie o de depositan en micropocillos individuales: Placa Picotiter. ### Preparación del ADN molde - PCR en fase sólida o PCR puente. - Se realiza sobre una superficie sobre la que se fijan ambos cebadores universales con una alta densidad: - Se desnaturaliza el ADN de la biblioteca y las cadenas individuales se anclan también a la superficie, garantizando distancia entre ellas. Cada hebra queda rodeada de múltiples cebadores universales. - El conjunto se inunda con una mezcla de PCR sin primers. ### Preparación del ADN molde - En cada ciclo de PCR ocurre: - Fase de hibridación: El adaptador del extremo libre de cada fragmento de ADN molde hibrida con el cebador universla más próximo, formando un puente. - Fase de extensión: se sintetiza una nueva cadena complementaria. - Fase de desnaturalización: del ciclo siguiente, ambas cadenas se separan, permaneciendo ancladas y muy próximas. ### Secuenciación masiva - Una vez inmovilizadas las moléculas de ADN molde sobre un soporte: MICROESFERAS O CLUSTERS se procede con las reacciones de secuenciación. ### Secuenciación masiva - Dos de los más utilizados: Terminación reversible cíclica y Pirosecuenciación - Tienen en común: Cíclicas, no electroforéticas, basados en fluorescencia o bioluminiscencia. ### Secuenciación masiva - Terminación reversible cíclica. - Se basa en la utilización de dNTPs marcados con fluorocromo y bloqueados para impedir que se puedan unir más nucleotidos, actúan como terminadores de cadena. - Todos los dNTPS están marcados, cada uno con el fluorocromo diferente. - La unión con el fluorocromo y el agente bloqueante es reversible, se puden eliminar, para poder seguir incorporando dNTP a la cadena. - Se usa con soporte de ADN molde de molécula única o con ADN de clusters. ### Secuenciación masiva - Terminación reversible cíclica. - Los ciclos se desarrollan en 3 fases: - Incorporación de un terminador reversible marcado: se inunda el soporte con una solución de ADN pol y los 4 dNTP marcados y bloquedos. La ADN pol se une al híbrido e incorpora el primer nT de la nueva cadena. - Lectura de la fluorescencia del soporte: se lavan los dNTP no incorporados, se exita el soporte con láser y se registra la fluorescencia en cada punto del soporte, que coincide con la posición ocupada por cada molñecula de ADN. ### Secuenciación masiva - Terminación reversible cíclica. - Eliminación del fluoróforo y del agente bloqueante mediante una reacción química: en el sigueinte ciclo se puede incorporar un nuevo NT a la cadena. ### Secuenciación masiva - Terminación reversible cíclica. - Se incorpora un dNTP a la cadena, no puede seguir polimerizando por el bloqueo. - Se elimina el fluoróforo y el bloqueante y se hace nuevo el ciclo. ### Secuenciación masiva - Un software ordena todas las secuencias basándose en repeticiones y solapamientos. ### Secuenciación masiva - Pirosecuenciación. - Se basa en la producción de bioluminiscencia mediante reacciones enzimáticas acopladas a la incorporación de NT a la cadena en crecimiento. - Se usa con PCR en emulsión y placas picotiter. - Se sitúan las microesferas en los pocillos de las placas de picotiter, se uno de los cebadores universales a los ADN mold y se inician grupos de 4 ciclos de secuenciación, cada uno con 3 fases: ### Secuenciación masiva - Pirosecuenciación. - 1. Se incuba la placa con un único dNTP y la ADN polimerasa. Si el primer NT complementario es el que se añadió, se unirá a 3' del cebador (si hay 2, 3, 4... seguidos, pues se unirán). ### Secuenciación masiva - Pirosecuenciación. - 2. Producción y medida de bioluminiscencia: La incorporación de 1 NT libera un pirofosfato (Ppi) lo que inicia una cadena de reacciones enzimáticas catalizadas por luciferasa y sulfurilasa que finalmente produce bioluminiscencia. - Se obtiene una matriz de puntos claros y oscuros correspondiente a los pocillos del picotiter. Los pocillos que incorporaron NT la intensidad depende del nº que se incorporó. ### Secuenciación masiva - Pirosecuenciación. - 4. Se elimina el exceso de dNTP no incorporado y se hacen tres ciclos iguales con los otros tres NT que faltan. - Se repite el proceso en grupos de 4 ciclos (uno por c/NT) hasta terminar la secuenciación. ### Secuenciación masiva - Pirosecuenciación. - Al final del proceso, el software del secuenciador genera un gráficade c/pocillo (pirograma)que representa la intensidad de la luminiscencia en c/ciclo. - La altura de c/línea indica el nº NT que hay seguidos en un ciclo. - El software ensambla las secc. Parciales y obtiene una secuencia completa del genoma. ### Secuenciación de 3ª generación - No suelen usar detectores ópticos para establecer la secuencia. - Evita el uso de marcajes fluorescentes. ### Secuenciación de 3ª generación - Secuenciación ion torrent. - Detecta microvariaciones del pH producidas por una reacción de polimerización. - El ADN que se va a secuanciar, unido a un cebador y una Adn pol se inmoviliza en un micropocillo que contiene un sensor de pH. - Se van inundando los pocillos con cada dNTP, con ciclos de lavado para eliminar los no fijados. - Cuando un NT se incorpora se libera un ión H (H+). - Esta variación de pH se detecta por el sensor del pocillo. - Se analiza con un software. - Mucho más rápido que los de 2º generación, la polimerización es continua. ### Secuenciación de 3ª generación - Secuenciación por nanoporos. - Método de secuenciación en tº real sin reacción de polimerización y sin marcajes, basado en biosensores. ### Secuenciación de 3ª generación - Biosensor formado por una membrana bicapa atravesada por un nanoporo formado por proteínas. - La membrana es atravesada por un flujo de electrones. - Por el poro pasa una de las cadenas de ADN, la corriente eléctrica se altera en función de la molécula que lo atraviesa. - Así se pueden identificar los NT. ### Secuenciación de ARN - Métodos enzimáticos directos. - Método de terminación de cadena de Sanger - Se utiliza una mezcla de dNTP y ddNTP (terminadores de cadena). - El ARN actúa de molde y se obtieen ADNc por acción de la retrotranscriptasa. - Marcaje radiactivo o fluorescente. - Se pueden marcar los cebadores o los ddNTPs. - Los fragmentos generados se separan por electroforesis y los geles se analizan por autoradiografía o luz UV. - La secuencia es la de ADNc, complementaria a la del ARN. ### Secuenciación de ARN - Métodos indirectos de secuenciación: - Se obtienen el ADNc mediante transcripción inversa. - Se secuencia con cualquiera de los métodos de secuenciación del ADN y la secuencia obtenida se traduce a ARN.