Secuenciación Masiva y Técnicas Moleculares

Proceso que utiliza la autorradiografía para identificar la secuencia de una molécula. La secuencia se determina observando el orden de las bandas en las cuatro calles del gel, leyéndose de abajo hacia arriba, de 5' a 3'.

Métodos que utilizan enzimas para detener la polimerización de una cadena de ADN durante la secuenciación. Se usan ddNTPs, que carecen del grupo -OH en el carbono 3', lo que impide la unión de otros nucleótidos.

Método original para secuenciar cadenas cortas de ADN monocatenario, basado en la terminación de cadena. Consiste en cuatro etapas: reacción de polimerización, electroforesis en gel, autorradiografía y análisis de resultados.

Separación de los fragmentos marcados con radiactividad por tamaño, con una resolución de un solo nucleótido. Los productos de las cuatro reacciones se corren en paralelo en un gel.

El último nucleótido añadido a cada fragmento es el ddNTP correspondiente al tubo. La secuencia se determina leyendo las bandas desde abajo hacia arriba, la lectura corresponde a la hebra complementaria a la hebra molde.

En lugar de marcar el cebador, se pueden marcar los dNTPs o los ddNTPs. La marca puede ser radiactiva o fluorescente.

Método de secuenciación basado en la terminación de cadena de Sanger, pero utiliza cuatro fluoróforos diferentes como marcadores. Los secuenciadores automáticos permiten realizar la electroforesis en gel o capilar y la detección de las bandas.

Técnica que utiliza cebadores fluorescentes para identificar la secuencia de ADN. Se utilizan cuatro tubos separados, cada uno con un cebador marcado con un fluoróforo distinto y un ddNTP específico. Se asocia un color a cada fluoróforo.

Se utiliza un cebador marcado en 5' con un fluorocromo. Cada tubo contiene todos los fragmentos posibles marcados con el fluorocromo en 5'. Los productos de las 4 PCR se mezclan en un tubo y se cargan en el secuenciador.

Los instrumentos automáticos se diferencian por el sistema de electroforesis que utilizan: - En gel: Geles planos de poliacrilamida, ultraf finos (<200 μm). Hasta 96 muestras. 200 bases/hora x muestra. - Capilar: Capilares de sílice con polímero soporte. 500 bases/horas. Recargas

El ADN marcado alcanza la ventana de lectura, un láser excita y el fluoróforo emite fluorescencia a una longitud de onda determinada. Se capta por un detector y se refleja como un pico de fluorescencia. Se hace un electroferograma. A verde, T rojo, G negro, C azul.

Si se utiliza un cebador forward, la secuencia coindice con la cadena 5'→3' del ADNds. Si se utiliza un cebador reverse, la secuencia obtenida es la complementaria en sentido inverso de 5'→3' de ADNds.

Los secuenciadores de 1ª generación utilizan sistemas electroforéticos, que permiten secuenciar fragmentos de hasta 1000 bases en un única reacción. La secuenciación a gran escala permite secuenciar fragmentos mucho mayores de 1000 bases e incluso genomas completos. Combinación de técnicas de secuenciación con clonación.

El genoma se digiere parcialmente y se clona completo para obtener una biblioteca genómica. Se secuencia un clon, y se utiliza el extremo de su secuencia para hacer una sonda que localice un clon que solape con la secuencia del clon anterior

Se fragmenta aleatoriamente el genoma. Estos fragmentos se clonan en bacterias. Se secuencian todos los clones de manera independiente. Se ensambla la secuencia usando un software.

Estudios genéticos que determinan la paternidad de un individuo comparando su ADN con el del supuesto padre.

Identifica la presencia de dos o más poblaciones de células genéticamente distintas en un organismo.

Un método de secuenciación genética que permite determinar la secuencia de bases de ADN de manera rápida y eficiente.

El proceso inicial de la secuenciación masiva, que implica la fragmentación del ADN y su preparación para la secuenciación.

Método para fragmentación del ADN en la secuenciación masiva.

Método para amplificar el ADN molde en la secuenciación masiva.

Técnica de amplificación del ADN que utiliza microesferas para aislar y amplificar fragmentos de ADN.

Un proceso que une covalentemente los fragmentos de ADN al soporte sólido para realizar la secuenciación.

Técnica de secuenciación que utiliza la incorporación de un dNTP a la cadena de ADN y bloquea la polimerización, permitiendo luego la eliminación del fluoróforo y el bloqueante para iniciar un nuevo ciclo.

La secuenciación masiva se basa en un software que identifica las repeticiones y solapamientos en las secuencias obtenidas, permitiendo la reconstrucción de la secuencia completa de ADN.

Un método de secuenciación masiva que utiliza la bioluminiscencia para detectar la incorporación de nucleótidos durante la síntesis de ADN.

En la pirosecuenciación, se utiliza un solo tipo de dNTP a la vez para que se una a la cadena de ADN en crecimiento.

La incorporación de un dNTP en la pirosecuenciación produce bioluminiscencia detectable, que es proporcional al número de nucleótidos añadidos.

En la pirosecuenciación, se repiten ciclos con los cuatro dNTPs para determinar la secuencia completa del ADN.

La pirosecuenciación produce un gráfico llamado pirograma que representa la intensidad de la luminiscencia en cada ciclo, dando información sobre el número de nucleótidos incorporados.

La secuenciación de tercera generación es una técnica de secuenciación de ADN que se basa en la detección de cambios en la corriente eléctrica a través de un nanoporo cuando una molécula de ADN pasa a través de él.

En la secuenciación por nanoporos, se utiliza un biosensor formado por una membrana que contiene un nanoporo. Cuando una molécula de ADN pasa a través del poro, la corriente eléctrica se altera, permitiendo identificar los nucleótidos.

La secuenciación de tercera generación es más rápida que la de segunda generación porque la polimerización del ADN es continua, no se detiene en cada nucleótido.

La secuenciación de ARN se puede realizar mediante métodos directos, que utilizan enzimas para obtener ADNc a partir del ARN, y métodos indirectos, que primero obtienen ADNc y luego lo secuencian.

El método de secuenciación de Sanger es un método enzimático directo que utiliza terminadores de cadena para obtener fragmentos de ADNc de diferentes longitudes. Estos fragmentos se separan por electroforesis y se analiza su secuencia.

En el proceso de Secuenciación Masiva (NGS), la preparación del ADN molde implica la creación de múltiples copias de cada fragmento de ADN, unidos a un soporte sólido como esferas o clusters. Esto facilita la lectura de miles de secuencias al mismo tiempo.

El método de secuenciación por terminación reversible cíclica utiliza dNTPs que están marcados con fluorocromos y bloqueados para impedir la unión de más nucleótidos. Estos dNTPs actúan como terminadores de cadena, y la marca fluorescente permite identificar el nucleótido incorporado.

En la secuenciación por terminación reversible cíclica, la lectura de la secuencia de ADN se realiza en ciclos, donde se incorporan los dNTPs fluorescentes, se lee la fluorescencia y luego se eliminan los bloqueos y el fluorocromo para que pueda seguir la polimerización. Este proceso se repite hasta obtener la secuencia.

La secuenciación masiva (NGS) se basa en dos técnicas principales: la terminación reversible cíclica y la pirosecuenciación. Ambas técnicas son cíclicas, no electroforéticas y utilizan la fluorescencia o bioluminiscencia para la detección.

Durante la preparación del ADN molde en NGS, se realiza una reacción de PCR en fase sólida o PCR puente, donde los cebadores universales se unen a una superficie y el ADN de la biblioteca se ancla también a la superficie, permitiendo la síntesis de nuevas cadenas complementarias.

Una vez que el ADN molde se inmoviliza en un soporte sólido, como esferas o clusters, se realizan las reacciones de secuenciación para determinar la secuencia de los fragmentos de ADN.

La pirosecuenciación es un método de secuenciación que detecta la incorporación de cada nucleótido mediante la emisión de luz. Cada nucleótido se añade secuencialmente y la producción de luz indica la incorporación del nucleótido correspondiente.

La secuenciación masiva (NGS) se utiliza en diversas aplicaciones, como el diagnóstico de enfermedades, la investigación de enfermedades genéticas, la secuenciación de genomas completos y la identificación de nuevas especies.