Secuenciación Masiva y Técnicas Moleculares

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Questions and Answers

¿Cuál es el propósito principal de la secuenciación masiva?

Determinar la estructura de las proteínas

Identificar mutaciones genéticas en un solo gen

Analizar la expresión de genes en un tejido específico

Secuenciar el genoma completo de un individuo en un tiempo relativamente corto (correct)

En la preparación del ADN molde para la secuenciación masiva, ¿qué proceso se utiliza para asegurar que cada fragmento de ADN se amplifique por separado y no se mezcle con otros?

Cromatografía de afinidad

PCR en emulsión (emPCR) (correct)

Electroforesis en gel

Hibridización con sondas específicas

En la técnica de emPCR, ¿qué elemento se utiliza para capturar y aislar cada fragmento de ADN molde?

Microesferas recubiertas con cebadores universales (correct)

Cristales de ADN

Tubo de ensayo

Plásmidos bacterianos

¿Cuál de los siguientes NO es un paso en la preparación del ADN molde para la secuenciación masiva?

Hibridización con sondas específicas (B) Signup and view all the answers

¿Cuál es la función de los adaptadores universales en la preparación del ADN molde?

Permitir la amplificación de toda la biblioteca con un solo juego de cebadores (A) Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes técnicas se utiliza para detectar quimeras en pacientes con trasplante de médula ósea?

Secuenciación masiva (B) Signup and view all the answers

¿Qué ventajas ofrece la secuenciación masiva para la detección de quimeras?

Todas las anteriores (D) Signup and view all the answers

¿Qué tipo de ADN se utiliza generalmente para los estudios de paternidad?

ADN nuclear (B) Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes opciones describe correctamente el proceso de secuenciación automática de 1ª generación?

Se realiza una única PCR con 4 ddNTPs marcados con fluorocromo distinto, se genera un tubo con una mezcla de todos los fragmentos posibles con el ddNTP 3' fluorescente y se cargan en el secuenciador. (D) Signup and view all the answers

¿Cuál es la técnica de secuenciación a gran escala que utiliza el método shotgun?

El método shotgun se basa en la fragmentación aleatoria del genoma, la clonación de estos fragmentos en bacterias y la secuenciación de todos los clones de manera independiente. (B) Signup and view all the answers

¿Cuál es la principal diferencia entre la secuenciación con terminador fluorescente y la secuenciación automática de 1ª generación?

La secuenciación con terminador fluorescente utiliza una mezcla de todos los fragmentos posibles con el ddNTP 3' fluorescente, mientras que la secuenciación automática de 1ª generación utiliza 4 reacciones separadas con cada ddNTP marcado. (A) Signup and view all the answers

En el contexto de la secuenciación automática de 1ª generación, ¿qué provoca la emisión de fluorescencia en el secuenciador?

La exposición del ADN a un láser provoca la excitación del florocromo en el ddNTP, lo cual genera la emisión de fluorescencia. (C) Signup and view all the answers

¿Cuál es la función del cebador en la secuenciación automática de 1ª generación?

El cebador proporciona un punto de partida para la replicación del ADN durante la PCR (C) Signup and view all the answers

¿Cuál es el papel del método paseo cromosómico en la secuenciación a gran escala?

El paseo cromosómico utiliza la secuenciación de clones individuales para ensamblar secuencias largas y obtener un mapa del genoma. (D) Signup and view all the answers

En la técnica de secuenciación automática de 1ª generación, ¿qué permite a los científicos identificar la secuencia de nucleótidos?

El color del fluorocromo usado para marcar cada base. (C) Signup and view all the answers

¿Cuál es el factor que limita la longitud de los fragmentos que se pueden secuenciar utilizando la secuenciación automática de 1ª generación?

La capacidad de los secuenciadores de 1ª generación. (B) Signup and view all the answers

¿Cuál es el principal mecanismo de detección de la secuencia de nucleótidos en la secuenciación por nanoporos?

El cambio en la corriente eléctrica a través de un nanoporo al pasar una molécula de ADN. (B) Signup and view all the answers

En la secuenciación de ARN por métodos enzimáticos directos, ¿qué molécula se utiliza como molde para la síntesis de ADNc?

ARN (D) Signup and view all the answers

¿Qué característica distingue a la secuenciación de tercera generación de la secuenciación de segunda generación?

La secuenciación de tercera generación es más rápida y no requiere una reacción de polimerización, mientras que la de segunda generación sí. (D) Signup and view all the answers

¿En qué consiste el método de secuenciación de ADN por terminación de cadena de Sanger?

Se utiliza una mezcla de dNTP y ddNTP para detener la replicación del ADN, generando fragmentos de diferentes longitudes que se separan por electroforesis. (B) Signup and view all the answers

¿Cuál es el principal objetivo de la secuenciación de ARN?

Analizar la expresión de genes y determinar la abundancia de diferentes ARN. (C) Signup and view all the answers

¿Cuál es la función de los didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTP) en la secuenciación de ADN?

Detener la síntesis de ADN al ser incorporados. (A) Signup and view all the answers

En el método de Sanger, ¿qué se utiliza para producir la cadena complementaria?

ADN polimerasa junto con cebador y dNTP. (D) Signup and view all the answers

¿Cómo se determina la secuencia de ADN después de la autorradiografía?

Escalando las bandas en la dirección 5' a 3'. (D) Signup and view all the answers

En la secuenciación automática de primera generación, ¿cuál es la ventaja de la PCR?

Permite amplificar ADN a partir de mezclas complejas. (B) Signup and view all the answers

¿Qué método se usa para separar los fragmentos de ADN marcados en la electroforesis?

Electroforesis en gel de alta resolución. (C) Signup and view all the answers

En el análisis de autorradiografía, ¿qué se identifica en la banda correspondiente a cada reacción?

El último nucleótido añadido, que es un ddNT. (B) Signup and view all the answers

¿Cuál es una característica de los métodos enzimáticos de terminación de cadena?

Se basan en la polimerización de cadenas complementarias. (B) Signup and view all the answers

¿Qué tipo de marcaje se puede usar en los ddNTPs para la secuenciación?

Marcaje radiactivo o fluorescente. (D) Signup and view all the answers

¿Qué proceso ocurre primero en cada ciclo de PCR durante la preparación del ADN molde?

Fase de hibridación (D) Signup and view all the answers

En la terminación reversible cíclica, ¿qué función cumplen los dNTPs marcados?

Impidan la incorporación de más nucleótidos (B) Signup and view all the answers

¿Cuál es la principal característica que comparten la terminación reversible cíclica y la pirosecuenciación?

Ambas son cíclicas y utilizan fluorescencia o bioluminiscencia (A) Signup and view all the answers

Durante la fase de incorporación en la terminación reversible cíclica, ¿qué se hace para leer la fluorescencia del soporte?

Se lavan los dNTP no incorporados (D) Signup and view all the answers

¿Qué tipo de soporte se utiliza en la secuenciación masiva?

Microesferas o clusters de ADN (D) Signup and view all the answers

¿Qué técnica de secuenciación masiva utiliza marcadores fluorescentes para identificar nucleótidos?

Terminación reversible cíclica (B) Signup and view all the answers

¿Qué ocurre con las cadenas de ADN durante la fase de desnaturalización en cada ciclo de PCR?

Se separan las cadenas ancladas (A) Signup and view all the answers

En la preparación del ADN molde, ¿cuál es el objetivo de fijar los cebadores universales a una alta densidad en la superficie?

Aumentar la especificidad de hibridación (C) Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes técnicas de secuenciación masiva se basa en la detección de cambios en el pH durante la polimerización?

Secuenciación de ion torrent (A) Signup and view all the answers

¿En cuál de las siguientes técnicas de secuenciación masiva se utiliza bioluminiscencia para identificar la incorporación de nucleótidos?

Pirosecuenciación (C) Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes opciones describe la técnica de secuenciación de tercera generación?

No suele utilizar detectores ópticos para establecer la secuencia. (C) Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes técnicas de secuenciación masiva se caracteriza por un proceso cíclico de incorporación de nucleótidos, terminación reversible y eliminación de fluoróforos?

Secuenciación de terminación reversible cíclica (B) Signup and view all the answers

En la técnica de pirosecuenciación, ¿qué función cumple la ADN polimerasa?

Cataliza la unión de un nucleótido a la cadena creciente de ADN. (B) Signup and view all the answers

En el contexto de la secuenciación masiva, ¿cuál de las siguientes funciones desempeña el software?

Organiza las secuencias individuales en un orden coherente. (B) Signup and view all the answers

¿Cuál de las siguientes opciones describe la técnica de secuenciación de tercera generación en relación a la secuenciación de segunda generación?

Evita el uso de marcajes fluorescentes. (D) Signup and view all the answers

¿Cómo se obtiene la secuencia completa del genoma utilizando la técnica de pirosecuenciación?

El software del secuenciador genera un gráfico para cada pocillo (pirograma) que representa la intensidad de la luminiscencia en cada ciclo. (C) Signup and view all the answers

Study Notes

Métodos de Secuenciación de Ácidos Nucleicos

La secuenciación de ácidos nucleicos (AN) es el proceso para determinar el orden de los nucleótidos (nt) en una molécula de ADN o ARN.
La secuencia se representa por las iniciales de las bases (A, C, G, T, U).
La secuencia de la cadena siempre se presenta de 5' a 3'. Esto es válido para ADN de cadena sencilla (ANss) y de cadena doble (ANds). La cadena 3' a 5' es la complementaria.
Inicialmente, la secuenciación se realizó en ARN, pero desde 1980, el ADN se secuenció con mayor rapidez.
Los métodos iniciales fueron manuales, basados en reacciones químicas y métodos enzimáticos.
Más tarde, la PCR y la electroforesis capilar llevaron a métodos automatizados de primera generación.
Actualmente, existen equipos de tercera generación capaces de secuenciar una sola molécula de ADN.
La automatización, junto con potentes programas informáticos de análisis, permitió secuenciar genomas completos de muchas especies.

Método Químico Maxam y Gilbert

Este método se basa en la modificación química específica de las bases nitrogenadas.
Permite la secuenciación de fragmentos cortos de ADN.
Requiere cantidades elevadas de ADN purificado.
Las fases del método son:
- Preparación de ADN de cadena sencilla y marcado de uno de los extremos con isótopo 32P.
- Reacciones de modificación química de las bases nitrogenadas (reacciones específicas para cada base).
- Electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución.
- Autorradiografía en gel.
- Análisis de la autorradiografía para descifrar la secuencia.

Métodos Enzimáticos de Terminación de Cadena

Estos métodos se basan en reacciones de polimerización de cadenas complementarias a la cadena que se desea secuenciar.
A la mezcla de reacción se añaden desoxinucleótidos trifosfato (NTP) y didoxinucleótidos trifosfato (ddNTP). Los ddNTPs carecen de -OH en el carbono 3', lo que impide que se unan a otros nucleótidos, deteniendo la síntesis de la cadena.

Método de Sanger

Es el método de secuenciación de ADN más utilizado.
Consiste en 4 fases:
- Reacción de polimerización
- Electroforesis en gel
- Autorradiografía
- Análisis de los resultados

Reacciones de Polimerización

Se necesita una mezcla para cada base nitrogenada (A, C, G y T)
Cada mezcla contiene:
- ADN molde
- cebador marcado con 32P
- ADN polimerasa
- dNTPs
- ddNTP específico (ddATP, ddCTP, ddGTP, o ddTTP)

Reacciones de secuenciación en primera generación

Se basa en el método de Sanger
Utiliza 4 fluoróforos como marcadores.
Emplea secuenciadores automáticos, electroforesis en gel o capilar, y detección de las bandas obtenidas.
- Reacciones de polimerización con PCR
  - PCR convencional con dos cebadores para amplificar el fragmento deseado.
  - PCR de secuenciación con un solo cebador y ADN molde los amplicones de la 1ª PCR.
Cuatro tubos separados, cada tubo con un cebador y ddNTP específico.
Electroforesis con detección automatizada de fluorescencia en el gel o electroforesis capilar.
- Electroforesis de alta resolución - Separación de los fragmentos marcados
- Análisis de los resultados
- Interpretación de los resultados: Se utiliza un software para ordena las secuencias basándose en la intensidad de la fluorescencia en cada lectura.

Secuenciación a gran escala

Los secuenciadores de 1ª generación se utilizan para secuenciar hasta 1000 bases.
Para secuenciar genomas completos se utiliza una combinación de técnicas de secuenciación con clonación.
- Paseo cromosómico: El genoma se digiere parcialmente, se clona completo y se secuencia un clon.
  - Se utiliza el extremo de su secuencia para hacer una sonda que localice un clon que solape con la secuencia del clon anterior.
- Método shotgun: Fragmenta y clona aleatoriamente el genoma. Se secuencian todos los clones de manera independiente, y se ensambla utilizando software. (Conexión de trozos de secuencia)

Análisis con secuenciador

Medicana forense (huellas genéticas)
Identificación de individuos
Estudios de paternidad
Detección de quimeras en pacientes con trasplante de médula ósea.

Secuenciación masiva (NGS)

Automatiza la preparación del ADN molde, la secuenciación y el análisis de datos.
Proceso:
- Preparación del ADN molde
  - Fragmentación al azar del genoma
  - Unión a adaptadores universales
  - Selección fragmentos de tamaño apropiado
  - Inmovilización sobre una superficie
  - Amplificación clonal
- Secuenciación
  - Utilización de diversos métodos
- Análisis de datos

Reacciones de secuenciación masiva (NGS)

Terminación reversible cíclica
- Utilización de dNTPs marcados con fluorocromo y bloqueados como terminadores.
- Unión con el fluorocromo y el agente bloqueante es reversible.
- Se usa con soportes de ADN molde de una sola molécula.
Pirosecuenciación
- Se basa en la producción de bioluminiscencia al incorporar NT a la cadena.
- Se usa con PCR en emulsión y placas picotiter. Se genera una reacción de secuenciación con 3 fases.
- Al final se lee la fluorescencia en cada pocillo y se obtiene una secuencia completa.

Secuenciación de 3ª generación

No utiliza detectores ópticos.
- Secuenciación ion torrent: detecta microvariaciones del pH producidas por una reacción de polimerización, a partir de iones H más (+)
- Secuenciación por nanoporos: basado en biosensores.
- Pasa una cadena de ADN por un nanoporo donde la corriente cambia en función de la molécula.

Secuenciación de ARN

Métodos directos: Usan el mismo principio del método de Sanger
- Retrotranscripción (ARN a ADN)
- Secuenciación del ADN
- Traducción del ADN a ARN
Métodos indirectos: obtener el ADNc del ARN para su posterior secuenciación.

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Description

Este cuestionario explora los conceptos y técnicas relacionados con la secuenciación masiva de ADN, incluyendo la preparación del ADN molde y la detección de quimeras. A través de diversas preguntas, se evaluará tu comprensión sobre los métodos utilizados en estos procesos moleculares. Ideal para estudiantes o profesionales en biología molecular.