Molekularbiologie: SecYEG-Komplex und Calmodulin

Der isoelektrische Punkt (IEP oder pI) eines Proteins ist der pH-Wert, an dem die positive und negative Ladung des Proteins im statistischen Mittel ausgeglichen sind.

Die Kationenaustauschchromatographie nutzt eine stationäre Phase mit negativer Ladung, um Proteine mit positiver Nettoladung bei dem gewählten pH-Wert zu binden.

Die Anionenaustauschchromatographie nutzt eine stationäre Phase mit positiver Ladung, um Proteine mit negativer Nettoladung bei dem gewählten pH-Wert zu binden.

Membranproteine sind Proteine, die in biologischen Membranen eingebettet sind und wichtige Funktionen in der Zelle übernehmen.

Integrale Membranproteine sind in die Membran eingebettet und haben Transmembranbereiche, die die Membran durchqueren.

Periphäre Membranproteine sind nicht fest in die Membran integriert, sondern assoziieren mit der Membranoberfläche.

Die Protein Data Bank (PDB) ist eine Datenbank, die dreidimensionale Strukturen von Proteinen speichert.

Transporter, Rezeptoren und Enzyme sind wichtige Beispiele für Membranproteine, die als Zielmoleküle für Medikamente dienen.

Membranproteine, die nur durch nicht-kovalente Wechselwirkungen mit integralen Membranproteinen an die Membran gebunden sind.

Transmembranproteine, die die Zellmembran ein- oder mehrmals durchspannen.

Eine rechtsgängige Helixstruktur, die in vielen Proteinen vorkommt.

Hydrophobe α-Helices, die in die Zellmembran eingebettet sind.

β-Faltblattstrukturen, die häufig in Proteinen vorkommen.

Proteine, die eine β-Barrel-Struktur bilden und als Poren in Zellmembranen dienen.

Detergenzien sind amphipatische Moleküle mit einem polaren Kopf und einem unpolaren Schwanz. Sie ermöglichen die Dispersion von wasserunlöslichen Stoffen in wässrigen Lösungen.

Detergenzien bilden bei hohen Konzentrationen Micellen, die thermodynamisch stabile, kolloidale Aggregate aus Detergenzmonomeren sind.

Die kritische Mizellenkonzentration (CMC) ist die Konzentration, ab der sich Micellen bilden. Sie hängt von Faktoren wie der Temperatur, dem pH-Wert und der Ionenstärke ab.

Detergenzien können nach ihrer Kopfgruppe klassifiziert werden: ionisch, nicht-ionisch und zwitterionisch.

Ionische Detergenzien sind oft stark und können die Proteinstruktur verändern. Nicht-ionische Detergenzien sind milder und halten die Proteinstruktur eher intakt.

Zwitterionische Detergenzien sind weniger denaturierend als ionische Detergenzien und haben keine Nettoladung. Sie sind besonders effizient bei der Unterbrechung von Protein-Protein-Interaktionen.

Integrale Membranproteine sind fest in die Membran eingebettet. Sie können nur mit Hilfe von Detergenzien gelöst werden.

Periphäre Membranproteine sind nicht fest in die Membran integriert. Sie lassen sich durch alkalische Carbonat-Extraktion entfernen.

Trition X-114 ist ein Detergenz, das bei verschiedenen Temperaturen unterschiedliche Eigenschaften aufweist. Es kann genutzt werden, um integrale und periphere Membranproteine zu trennen.

Detergenzien mit hohen CMC-Werten zeigen eine schwächere Bindung an Membranproteine und sind leichter wieder zu entfernen.

Nanodiscs sind künstlich erzeugte Membranvesikel, die eine einzelne Lipiddoppelschicht einschließen. Sie dienen zur Rekonstitution von Membranproteinen in einer kontrollierten Umgebung.

Die TAP-Fusion (Tandem-Affinity Purification) ist eine Technik zur Isolierung und Reinigung von großen Proteinkomplexen. Es werden zwei Affinitäts-Tags verwendet, um den Komplex aus Zellen anzureichern.

Protein A ist ein Oberflächenprotein aus Staphylococcus aureus, das an die Fc-Region von Antikörpern bindet.

Calmodulin ist ein intrazelluläres Calcium-bindendes Protein, das an verschiedene Proteine bindet und an Calcium-regulierten Prozessen beteiligt ist.

Die TAP-Fusion bietet Vorteile wie hohe Reinheit und Erhalt der nativen Proteinkomplex-Struktur. Nachteil ist die mögliche Veränderung der Komplexaktivität durch die Tags.

Die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) ist eine Technik zur Messung der Bindung von Molekülen, die auf der Änderung des Brechungsindexes basiert, die durch die Bindung auftritt. Dabei wird ein Lichtstrahl auf eine dünne Goldschicht gerichtet. Durch die Bindung an der Oberfläche der Goldschicht ändern sich die Eigenschaften der Plasmonen, und dies führt zu einer Änderung des Resonanzwinkels des reflektierten Lichts.

Microscale Thermophoresis (MST) ist eine Technik zur Messung der Bindung von Molekülen, die auf der Änderung der Bewegung von Molekülen in einem Temperaturgradienten basiert. Dabei wird ein Infrarot-Laser verwendet, um einen definierten Temperaturgradienten zu erzeugen. Die Bewegung von Molekülen im Temperaturgradienten wird durch die Fluoreszenz eines markierten Bindungspartners beobachtet.

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist eine Technik zur Messung der Bindung von Molekülen, die auf der Änderung der Wärmemenge basiert, die durch die Bindung freigesetzt oder absorbiert wird. Dabei werden die Bindungspartner in einer Zelle titriert, und die Wärmeänderungen werden durch einen Sensor gemessen.

Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) ist eine Technik zur Messung der Bindung von Molekülen, die auf der Änderung der Deuterium-Austauschraten von Proteinen basiert. Dabei wird eine Probe mit deuteriertem Wasser inkubiert, und das Deuterium tauscht sich mit den Wasserstoffatomen in der Proteinstruktur aus. Die Austauschraten werden mit Massenspektrometrie gemessen.

Detergenzien müssen über der kritischen Micellen Konzentration (CMC) verwendet werden, da sie in einem Gleichgewicht zwischen Monomeren und Micellen vorliegen. Unterhalb der CMC würden Membranproteine inaktiviert werden.

Ionische Detergenzien können mit Ionenaustauschern reagieren, indem sie Proteinladungen maskieren. Dadurch wird die Bindung an die stationäre Phase schwächer.

Detergenzien können die Größe von Proteinen verändern, indem sie Micellen bilden die das Molekulargewicht des Proteins erhöhen. Dies kann die Trennung bei der Größenausschlusschromatographie beeinflussen.

Detergenzien können die Detektion von Proteinen in der Chromatographie stören, indem sie die Absorption des Lichts beeinflussen.

Amphiphile, auch als Amphipole bekannt, sind Polymere mit einem stark hydrophilen „Backbone“ und mehreren hydrophoben Ketten. Sie sollen eine hohe Affinität zur hydrophoben Proteinoberfläche haben und dadurch eine stabile Umgebung um das Protein schaffen.

Der Sec61-Komplex ist ein Protein-Translokator am endoplasmatischen Retikulum (ER). Er ermöglicht den Transport von Proteinen durch die ER-Membran.

Die Rekonstitution des Ribosomen-Nascent-Ketten- Komplexes (RNC) in Detergenz ermöglicht die Untersuchung des Translokationsmechanismus des Sec61-Komplexes im Labor.

Der Sec61-Komplex ist von einer gemischten Lipid-/Detergenz-Micelle umgeben. Es wird untersucht, ob der Translokator unter diesen Bedingungen wirklich aktiv ist.