Genética Forense: Biologia Molecular PDF

Genética Forense Mestrado Biologia Molecular e Genética 2024/2025 Filipa Tavares nº57515 1 Table of Contents Enquadramento Jurídico...........................................................................................................

Genética Forense Mestrado Biologia Molecular e Genética 2024/2025 Filipa Tavares nº57515 1 Table of Contents Enquadramento Jurídico............................................................................................................................... 4 Regime Jurídico das Perícias Medico-Legais e Forenses............................................................................................................ 4 Organizaçao Medico-Legal em Portugal.............................................................................................................................................. 5 Genoma Humano............................................................................................................................................. 6 Nucleotidos........................................................................................................................................................................................................ 6 Cromossomas.................................................................................................................................................................................................... 6 Genoma Humano............................................................................................................................................................................................. 6 DNA Extranuclear.......................................................................................................................................................................................... 6 DNA Codificante e Nao Codificante........................................................................................................................................................ 7 Utilizaçoes em Areas Diferentes............................................................................................................................................................... 7 Locus, Homologia e Alelos.......................................................................................................................................................................... 7 Marcadores Geneticos.................................................................................................................................................................................. 7 Nomenclatura dos Marcadores................................................................................................................................................................. 7 DNA Inter-Indivíduos.................................................................................................................................................................................... 8 Variaçao de DNA.............................................................................................................................................................................................. 8 Variaçao de Sequencia.................................................................................................................................................................................. 8 Variaçao de Comprimento........................................................................................................................................................................... 8 DNA Repetitivo................................................................................................................................................................................................. 9 Transposoes..................................................................................................................................................................................................... 9 DNA Nao-Repetitivo....................................................................................................................................................................................... 9 Recombinaçao Genetica.............................................................................................................................................................................10 Mutaçoes............................................................................................................................................................................................................10 Transmissao da Informaçao Genetica................................................................................................................................................10 Marcadores Genéticos................................................................................................................................. 10 Perfil Genetico................................................................................................................................................................................................10 Marcadores Autossomicos.......................................................................................................................................................................11 Short Tandem Repeats (STRs)................................................................................................................................................................11 Tipos de STRs............................................................................................................................................................................................... 12 Criterios de Seleçao de STRs................................................................................................................................................................... 13 Paineis de STRs..............................................................................................................................................................................................13 1ª Geraçao..................................................................................................................................................................................................... 13 2ª Geraçao..................................................................................................................................................................................................... 13 CODIS.............................................................................................................................................................................................................. 13 ESS.................................................................................................................................................................................................................... 14 Analise de um Painel de STR................................................................................................................................................................... 14 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).......................................................................................................................................14 Insertion Deletion Polymorphisms (InDels)...................................................................................................................................15 Cromossoma Y................................................................................................................................................................................................15 2  Cromossoma X................................................................................................................................................................................................17 Amostras Forenses e Métodos Laboratoriais....................................................................................... 18 Amostras Estudadas em Contexto Forense.....................................................................................................................................18 Amostras de Referencia............................................................................................................................................................................ 18 Amostras-Problema................................................................................................................................................................................... 18 Cadeia de Custodia.......................................................................................................................................................................................19 Metodos Laboratoriais...............................................................................................................................................................................19 Observaçao e Descriçao Previa das Amostras................................................................................................................................... 20 Pre-Tratamento de Amostras (Amostras Osseas)............................................................................................................................ 20 Extraçao de DNA.......................................................................................................................................................................................... 21 Quantificaçao de DNA................................................................................................................................................................................ 22 Amplificaçao de DNA................................................................................................................................................................................. 22 Sequenciaçao................................................................................................................................................................................................ 23 Deteçao de Produtos Amplificados....................................................................................................................................................... 24 Valorizaçao dos Resultados Laboratoriais.......................................................................................................................................... 24 Analise Estatística dos Resultados Obtidos........................................................................................................................................ 24 Elaboraçao do Relatorio Pericial............................................................................................................................................................ 25 Identificação de Desconhecidos............................................................................................................... 25 Identificaçao Humana.................................................................................................................................................................................26 Imperativos Eticos, Morais e Humanitarios....................................................................................................................................... 26 Imperativos Sociais, Civis e Forenses................................................................................................................................................... 26 Imperativos Forenses e Criminais......................................................................................................................................................... 26 Metodos de Identificaçao..........................................................................................................................................................................26 Identificaçao Visual Direta....................................................................................................................................................................... 26 Identificaçao Lofoscopica......................................................................................................................................................................... 27 Identificaçao Odontologica...................................................................................................................................................................... 27 Identificaçao de Casos Nao Identificaveis........................................................................................................................................... 27 Antropologia Forense.................................................................................................................................................................................28 Descriçao Geral do Esqueleto................................................................................................................................................................. 29 Perfil Biologico............................................................................................................................................................................................. 29 Identificaçao Genetica................................................................................................................................................................................34 Bases de Dados de DNA.............................................................................................................................................................................34 3 Enquadramento Jurídico Regime Jurídico das Perícias Medico-Legais e Forenses Lei nº 45/2004 estabelece o regime jurídico das perícias medico-legais e forenses. Artigo 2º (Realização de perícias) - As perícias medico-legais sao realizadas, obrigatoriamente, nas delegações e gabinetes médico- legais do INML (Instituto Nacional de Medicina Legal) - Excecionalmente, podem ser realizadas por entidades terceiras - As perícias solicitadas podem ser efetuadas em serviço universitario ou de saude, por falta de peritos no Instituto Artigo 3º (Requisição/Pedido de Perícias) As perícias medico-legais sao ordenadas por despacho de autoridade judicial. Pedido deve ser acompanhado de informaçoes clínicas disponíveis. Artigo 5º (Responsabilidade por perícias) As perícias sao realizadas por peritos designados pelos serviços do INML. Estes gozam de autonomia e sao responsaveis por perícias, relatorios e pareceres. Artigo 6º (Obrigatoriedade) Ninguém se pode recusar a ser submetido a qualquer exame médico-legal, desde que seja ordenado por autoridade judiciaria competente. No regime jurídico das perícias existem varias secçoes:  Secçao II: Exames e Perícias no Ambito da Tanatologia Forense  Secçao III: Exames e Perícias no Ambito da Clínica Medico-legal e Forense  Secçao IV: Exames e Perícias no Ambito da Genetica, Biologia e Toxicologia Forenses  Secçao V: Exames e Perícias no Ambito da Psiquiatria e Psicologia Forenses Secção IV, Artigo 2º 1. Os exames de genetica, biologia e toxicologia forenses sao obrigatoriamente solicitados à delegação do instituto da área do tribunal ou autoridade que os requer 2. O disposto no numero anterior nao se aplica a exames do ambito da criminalística biologica que tambem podem ser solicitados a PJ. Secção IV, Artigo 25º Apos a realizaçao do exame pericial de vestígios, produtos biologicos ou peças anatomicas, o perito procede a recolha, acondicionamento e selagem de uma amostra que sera testada. A amostra fica no serviço médico- legal durante 2 anos, apos o qual pode ser destruída. Secção IV, Artigo 30º O acesso a informaçao genetica bem como o tratamento de dados associados sao regulados em legislaçao especifica. Lei da Proteção de Dados Pessoais Artigo 2º - O tratamento de dados pessoais deve processar-se no respeito pela reserva da vida privada Artigo 3º - entende-se por dados pessoais qualquer informação relativa a uma pessoa singular identificada Artigo 6º - o tratamento de dados pessoais so pode ser efetuado se o seu titular tiver dado o seu consentimento 4 Organizaçao Medico-Legal em Portugal Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses 1. Instituto Público, sob tutela do Ministerio da Justiça 2. Tem a qualidade de instituição nacional de referência no ambito da medicina legal e ciencias forenses 3. Tem jurisdiçao sobre todo o território nacional Missao: assegurar prestaçao de serviços periciais medico-legais e forenses, a coordenaçao científica da atividade no ambito da medicina legal e de outras ciencias forenses, bem como promoçao da formaçao e da investigaçao em medicina legal e ciencias forenses Tem sede em Coimbra, e constituída por 3 delegações (Norte, Centro e Sul) e contem vários gabinetes medico-legais e forenses. Dentro das delegaçoes existem varios serviços disponíveis:  Serviço de clínica e patologia forenses: realizaçao de exame e perícias em pessoas: Clínica Forense i) Para descrição e avaliação dos danos provocados na integridade psicofísica, nos diversos domínios do Direito, designadamente no ambito de Direito penal, civil e do trabalho ii) De natureza psiquiátrica e psicológica forenses iii) Outros atos nestes domínios, designadamente avaliaçoes de natureza social Patologia Forense i) Realizaçao de autópsias médico-legais ii) Exames de anatomia patológica forense iii) Outos atos neste domínio, designadamente perícias de identificação de cadáveres e de restos humanos, de embalsamentos e de estudo de peças anatomicas iv) Perícias em areas especificas  Serviço de tecnologias forenses e Criminalística: assegura a pesquisa, registo, colheita e tratamento de vestígios, e a realizaçao de perícias nas diferentes areas das ciencias forenses nao enquadraveis nas competencias dos restantes serviços tecnicos, designadamente e entre outras, no ambito da analise de escrita e documentos, balística e física  Serviço de Química e Toxicologia Forenses: assegura a realizaçao de perícias e exames laboratoriais químicos e toxicológicos  Serviço de Genetica e Biologia Forenses: assegura a realizaçao de perícias e exames de identificaçao, nomeadamente os de investigação biológica de parentesco de identificaçao individual, de criminalística biológica ou outras Gabinetes Médico-Legais e Forenses i) Realizaçao de exames e perícias em pessoas, para descriçao e avaliaçao dos danos provocados na integridade psicofísica, nomeadamente, no ambito do Direito penal, civil e do trabalho, bem como realizaçao de perícias de psiquiatria e psicologia forenses ii) Realizaçao de autópsias médico-legais respeitantes a obitos ocorridos nas comarcas (area geografica sob jurisdiçao de um tribunal) integradas na sua area de atuaçao, bem como de outros atos neste domínio, designadamente de antropologia forense, de identificaçao de cadaveres e de embalsamentos iii) Colheita de amostras para exames complementares laboratoriais e, excecionalmente de outros exames no âmbito das atividades médico-legais e forenses. Lei nº5/2008 Aprova a criaçao de uma base de dados de perfis de ADN para fins de identificaçao civil e criminal. 5 Genoma Humano Nucleotidos O DNA e composto por nucleotidos, com 4 alternativas, diferindo na base azotada (A,C,T,G). A adenina e a guanina sao purinas, possuindo um anel duplo de carbono-hidrogenio. A citosina e a timina (e o uracilo) sao pirimidinas e possuem apenas um anel. Formam cadeias ao criar ligaçoes uns com os outros, sendo que a adenina forma ligaçoes com a timina (ou o uracilo em RNA, formando duas pontes de hidrogenio e a guanina forma ligaçao com a citosina, estas formando tres pontes de hidrogenio. Estas cadeias sao antiparalelas e complementares. Cromossomas Por sua vez, o DNA compacta-se em cromossomas, sendo uma forma de organizaçao do mesmo para ser contido no nucleo da celula, compactando milhoes de pares de bases. Em todas as celulas encontra-se presente o DNA. As celulas sao semelhantes, havendo algumas diferenças entre diferentes tipos de tecidos. O material genetico e o mesmo em todos os indivíduos, sendo universal, apesar de poder haver algumas diferenças entre diferentes tecidos e orgaos, podendo ser arquiteturais ou de morfologia, mas a estrutura da celula mantem-se para todas as celulas. A informaçao genetica no DNA é igual em todas as células do mesmo individuo e diferente de indivíduo para indivíduo em certas zonas. Genoma Humano Como sabemos, o DNA compacta-se em cromossomas, com numero variavel de especie para especie. O ser humano tem 23 pares de cromossomas, sendo 22 autossómicos e o 23º par o que se denomina de cromossomas sexuais, onde nestes se encontra a informaçao que ira determinar o sexo biologico do individuo. Se forem dois cromossomas X, o sexo biologico e feminino, e se for um X e um Y, o sexo sera masculino (podem existir algumas situaçoes em que tal nao acontece, mas consideram-se exceçoes). O ser humano e um organismo diploide, em que para cada informaçao genetica existente, cada individuo tem duas versões, uma de via materna e outra de via paterna, que codificam para a mesma estrutura e funçao, mas com informaçao, ou alelos diferentes. Assim, recebemos 50% de informaçao genetica de via materna e os outros 50% de via paterna. DNA Extranuclear No entanto, isto apenas acontece no DNA nuclear. Mas o material genetico de um individuo e composto tambem por genoma extranuclear, que tambem inclui o DNA mitocondrial, que se encontra na mitocondria das celulas e codifica para algumas funçoes e estruturas e tem a particularidade de ser sempre herdado pela via materna. Da mesma forma, a linhagem do cromossoma Y tambem se da apenas por via paterna. 6 DNA Codificante e Nao Codificante As moleculas de DNA tem zonas codificantes, ou seja codificam para uma determinada estrutura e funçao. Mas existe tambem DNA não codificante, que representa cerca de 95% de todo o nosso genoma, que nao modificam para nenhuma funçao. Assim, de todos os milhoes de pares de bases que o nosso genoma contem, apenas 5% são DNA codificante, ou seja, a maior parte do nosso genoma nao tem qualquer funçao. Utilizaçoes em Areas Diferentes A genetica medica foca-se essencialmente no DNA codificante, onde havendo alguma alteraçao ou mutaçao na sequencia, ira provocar doença. Por outro lado, a genética forense foca-se no DNA não codificante uma vez que este nao contem qualquer informaçao para estruturas ou funçoes, sendo utilizado para apenas fins forenses e e colocado em bases de dados. Assim, os marcadores estarão localizados no DNA não codificante tambem. Locus, Homologia e Alelos Existem termos largamente utilizados em genetica. Por exemplo, um locus (pl. loci) refere-se ao local onde um determinado gene ou marcador genetico está localizado. Cromossomas homólogos indicam um par de cromossomas, um proveniente de via materna e o outro de via paterna que codificam para as mesmas estruturas e funções. E alelos representam versões recebidas de cada via. Por exemplo, a via materna dava um alelo para olhos castanhos e a via paterna o alelo de olhos azuis. Codificam para a mesma estrutura e funçao, mas sao versoes diferentes. Um alelo e homozigótico quando as duas versões são iguais, e heterozigótico quando sao diferentes. O genótipo e o conjunto de informações genéticas para determinados marcadores e o perfil genético e o conjunto de informaçao genetica para um grupo de marcadores e que irá individualizar uma pessoa. Marcadores Geneticos Nomenclatura dos Marcadores Quando falamos de marcadores geneticos, existe uma nomenclatura que deve ser utilizada. Um exemplo: 7 Neste marcador genetico o ‘D’ significa que e um marcador de DNA; o ‘S’ significa que e um marcador de single strand. Os numeros indicam o numero do cromossoma e da posiçao, respetivamente. Um exemplo da nomenclatura mais antiga que ainda se usa, nomeadamente nos primeiros marcadores geneticos que ainda se encontram a ser utilizados nos dias de hoje, e por exemplo o marcador TH01, que representa uma regiao do gene da Tirosina Hidroxilase. DNA Inter-Indivíduos Como dito anteriormente, 95% do nosso genoma e nao codificante. Na especie humana, as sequencias sao essencialmente iguais entre indivíduos, sendo apenas diferente em 0,3% no seu total. Sera assim com base nestes 0,3% de DNA diferente de individuo para individuo que os marcadores genéticos se irão focar. Estes marcadores irao permitir dar informaçao para um individuo como se fosse um ‘codigo de barras’, sendo unica para tal, nao existindo outro individuo com exatamente aquela informaçao. Variaçao de DNA Existem assim variaçoes de DNA de individuo para individuo. Existem dois tipos de variação de DNA:  Diferença/variaçao/polimorfismo de sequencia  Diferença/variaçao/polimorfismo de comprimento Variaçao de Sequencia A variaçao de sequência refere-se a uma diferença na base azotada localizada numa determinada posiçao. No exemplo, e possível ver que o individuo 1 tem uma citosina e uma guanina, e o individuo 2 tem uma timina e uma adenina na mesma posiçao. Variaçao de Comprimento Em termos forenses, as diferenças de comprimento sao as variaçoes mais utilizadas. Na representaçao acima, observa-se a rosa uma adenina e 4 guaninas a seguir, por exemplo, sendo cada conjunto considerado um bloco. O individuo 1 tem 4 repetições deste bloco, e o individuo 2 tem 5 repetições. Considera-se alelo 4 e alelo 5, respetivamente. Assim, o polimorfismo de comprimento e o número de repetições diferentes no genoma de um individuo. Este DNA repetido tambem pode ser variável ou nao entre indivíduos. A isto chama-se DNA satélite, que sao sequencias de DNA compostas por repetições perfeitas ou quase perfeitas, sendo na maior parte das vezes uma repetiçao perfeita, em que as unidades de repetiçao estao dispostas em tandem, podendo tambem ser designadas por VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Este DNA representa 3-10% do genoma humano e dependendo da dimensao, pode ser classificado como: Minissatelite: quando a unidade de repetiçao e grande, 10 a 100 bp e pode repetir-se de 5 a 1000 vezes. Microssatelite: tem uma unidade de repetiçao de 2 a 5 bp e repete-se 2 a 40 vezes. Tambem pode ser designado por STR (Short Tandem Repeats) 8 STRs são a base da identificação no ambito da genetica forense para casos medico-legais e forenses. DNA Repetitivo Existem outros tipos de DNA repetitivo, que nao sao por norma utilizados. A grande diferença e que ao inves do DNA satelite, em que a unidade de repetiçao se repete justapostamente, ou em tandem, aqui a unidade de repetiçao encontra-se dispersa. Transposoes Transposões sao sequencias de DNA repetitivo que se encontram dispersas pelo genoma, onde a transposiçao e mediada por uma transcriptase reversa. Transposiçao e a passagem do fragmento que se repete (ou a copia) e a duplicaçao para outro sítio. Representam cerca de 45% do genoma humano e subdividem-se em duas classes:  LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) - Sao maiores, com sequencia de 6-8 kbp - Podem incluir genes que codifiquem para determinadas proteínas, como as que catalisam a transposiçao - Representam 21% do genoma humano  SINEs (Short Intersperced Nuclear Elements) - Sao menores, com uma sequencia de 100-300 bp - Nao codificam para proteínas, normalmente localizadas em regioes extragenicas ou introes - Representam cerca de 13% do genoma humano - A maior parte delas sao elementos do tipo Alu - Sequencias Alu: o Sao sequencias bipartidas, com uma regiao central rica em A, e com duas regioes laterais o Na extremidade 3’ possuem cauda poli-A De uma forma resumida, a imagem acima representa os diferentes tipos de DNA repetitivo. DNA Nao-Repetitivo Este DNA representa 95% do genoma humano, e e neste DNA que ocorre variaçao entre indivíduos sem haver alteraçao na estrutura e funçao de proteínas. E nesta variabilidade que permite que cada individuo seja unico e e esta variabilidade que sera utilizada para identificaçao genetica individual. As principais fontes de variabilidade sao: 9   Recombinaçao genetica – ocorre na divisao celular  Mutaçoes Recombinaçao Genetica Na recombinaçao genetica, existe, pela proximidade de cromossomas homologos, troca de fragmentos ou segmentos do cromossoma, o que ira permitir alterações no DNA. Mutaçoes Existem varios tipos de mutaçoes:  Inserçoes – inserçao de bases  Deleçoes – deleçao de bases  Inversoes – inversao de uma parte do segmento  Translocaçoes – troca de segmentos entre sequencias Para contextos forenses, as mutaçoes de maior importância sao as inserções e deleções. Transmissao da Informaçao Genetica Cada individuo produz gâmetas para a sua reproduçao, em que cada uma leva 50% do seu material genético nuclear. No caso da mulher, qualquer gameta levara um cromossoma sexual X, e no homem pode ser X ou Y. Depois da junçao destes 2 gametas, volta-se a ter o mesmo numero de cromossomas: 22 autossomicos e 1 sexual. No entanto, existe tambem outro DNA, o DNA mitocondrial que e sempre recebido por via materna. A razao para este acontecimento e que apesar dos espermatozoides tambem terem material genetico mitocondrial, no momento da fecundaçao, a maquinaria da celula feminina (ovulo) seletivamente destroi todo o material genetico mitocondrial do espermatozoide, daí a transmissao ser estritamente por via materna. Marcadores Geneticos Perfil Genetico Como ja falado anteriormente, o perfil genético e o conjunto de informação relativa a constituiçao ou caracterização genética no número mínimo de marcadores ou loci do genoma. Esses marcadores utilizados obedecem a determinados requisitos legais e científicos, sendo materias bem definidas. Um perfil genetico pode ser individualizante ou de linhagem. Por exemplo, um perfil genetico contruído com base em informaçao localizada no cromossoma Y é um marcador de linhagem, ou um perfil genetico de linhagem, 10 ou seja, todos os indivíduos dessa linhagem paterna terao exatamente o mesmo perfil. Da mesma forma, uma sequencia de DNA mitocondrial tambem nao e individualizante mas de linhagem, neste caso por via materna. Um perfil individualizante e aquele que nao e de linhagem materna ou paterna, mas de individuo. Marcadores Autossomicos Relativamente a marcadores geneticos que permitem a construção de um perfil genético individualizante, falamos apenas de marcadores autossómicos, ou seja, presente nos 22 cromossomas autossomicos. Existem tres grandes categorias de marcadores geneticos que sao utilizados em contexto forense:  Short Tandem Repeats (STRs)  Single Nucleotide Polymorphism (SNPs)  Insertion/Deletion Polymorphism (InDels) Short Tandem Repeats (STRs) Um STR e classificado como um microssatélite e uma zona de DNA repetitivo. Marcadores STRs sao os mais utilizados e recomendados na genetica forense para definiçao de perfis geneticos individuais a nível mundial. Atualmente, milhares de STRs do genoma humano encontram-se descritos, e STRs representam aproximadamente 3% do genoma. Encontram-se distribuídos pelo mesmo, estimando-se que ocorrem a cada 100 mil nucleotidos. Enquanto uns exibem variabilidade entre indivíduos, outros mantem-se iguais. Ou seja, existem certos STRs em que todos os indivíduos terao por exemplo o alelo 4, em que temos 4 repetiçoes. Este tipo de STRs nao tem interesse para fins forenses uma vez que nao irao individualizar. Assim, do ponto de vista medico-legal e forense, os STRs de maior interesse serao aqueles que exibem variabilidade entre indivíduos, em que por exemplo num marcador D16, o individuo 1 tem 4 repetiçoes, o 2 tem 7 repetiçoes, o individuo 3 tem 31, o individuo 4 tinha 11. 11 Um STR pode ter uma unidade de repetiçao variavel, podendo ser do tipo di-, tri-, tetra-, penta- ou hexanucleotídica. Para identificaçao humana, os tetranucleotídicos (4) sao os mais utilizados. A unidade de repetição, por norma encontra-se completa, mas em alguns casos surge aquilo a que se designa de microvariantes. As microvariantes representam-se sempre pelo numero do alelo seguido de quantos nucleotidos tem ‘extra’. No 3º exemplo, depois de completar uma unidade de repetiçao duas vezes, existem mais dois nucleotidos, sendo que o alelo sera o 2.2. As microvariantes não são comuns mas existem em alguns marcadores geneticos. Tipos de STRs Uma STR pode ser classificada atendendo ao padrao da unidade de repetiçao, dividindo-se em STRs simples, compostos e complexos. STR Simples Nos STRs simples, todas as unidades do bloco de repetiçao tem o mesmo comprimento e a mesma sequência. Estes sao os STRs utilizados para fins forenses. STRs Compostos Em STRs compostos, existem dois tipos diferentes de unidades de repetição, em que cada uma dessas unidades tem o mesmo comprimento e sequência. Para fins forenses, existe a possibilidade de as vezes STRs compostos serem utilizados, mas nao e comum. 12 STRs Complexos No caso de STRs complexos, o bloco de repetiçoes tem vários tipos de unidades de repetição diferentes e cada uma tem comprimentos e sequências diferentes. Devido a sua grande variancia, estes STRs nao sao utilizados para fins forenses. Criterios de Seleçao de STRs Para serem utilizados, os marcadores STRs devem cumprir alguns requisitos. O mais importante de todos e apresentarem heterozigotia igual ou superior a 70%. Heterozigotia significa que serao alelos diferentes, o que significa que existira mais variabilidade e polimorfismos, sendo mais individualizante numa populaçao. Outro requisito e a localização cromossómica entre diferentes STRs, devendo ser tao distantes quanto possível, preferencialmente em cromossomas diferentes. Os marcadores STRs escolhidos tambem devem ter uma taxa de mutação reduzida, de modo a evitar falsos positivos ou negativos devido a mutaçao e nao uma variabilidade da sequencia. Paineis de STRs 1ª Geraçao Em 1994, surgiu o primeiro grupo de STRs que foi designado como Painel Multiplex de 1ª Geração, sendo composto por 4 STRs: TH01, FES/FPS, vWA e F13A1 (e possível observar que a nomenclatura destes marcadores nao e a atualmente utilizada). Este conjunto de marcadores tinha uma probabilidade de coincidencia de perfis obtidos de 1 em 10 000, logo nao era individualizante o suficiente. 2ª Geraçao Em 1996, surge o painel de 2ª geração, com 6 marcadores (TH01, vWA, D8S1179, D18S51, D21S11), em que a probabilidade de coincidencia de perfis obtidos era de 1 em 50 000 000 indivíduos, o que ainda nao era individualizante o suficiente. CODIS Em 1997, surge o painel de marcadores conhecido internacionalmente e usado a nível mundial CODIS, lançado pelo FBI dos Estados Unidos, que e composto por 13 marcadores (TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51, D21S11, CSFIPO, TPOX, D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317 e D16S539). Com estes 13 loci, as probabilidades de coincidencia de perfis geneticos disparam para 1 em 10 000 000 000 000, que e bastante superior a populaçao mundial (7 000 000 000). Assim, este painel de marcadores e individualizante para qualquer individuo. Observando a sua distribuiçao, observa-se que estao separados em cromossomas diferentes. 13 ESS Em 1999, a Uniao Europeia lança um sistema semelhante ao CODIS, o European Standard Set (ESS), que contem 7 marcadores geneticos (TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51, D21S11, D3S1358). Este painel foi revisto em 2009, denominado o Novo ESS, agora com 12 loci (TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51, D21S11, D3S1358, D2S441, D10S1248, D22S1045, D1S1656 e D12S39). A probabilidade de coincidencia dos perfis obtidos com 12 loci e identica a do CODIS, sendo este painel agora individualizante para qualquer individuo. Atualmente, são utilizados 17 marcadores em Portugal, sendo a probabilidade de coincidencia de perfis extremamente superior a populaçao mundial. Analise de um Painel de STR Observando o exemplo em baixo, podemos ver que para o marcador D8S1179, temos dois alelos diferentes: um alelo 14 e um 15, o que significa que o individuo e heterozigota para este marcador, tendo recebido um alelo do pai e outro da mae. No marcador D2S11, observa-se uma microvariante, uma vez que o numero obtido e 34.2. No marcador D13S317, temos um exemplo de homozigotia, onde so se observa um alelo, quando o individuo recebe sempre dois, um de cada pai, ou seja, ambos os pais tinham o mesmo alelo. Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Em certas situaçoes, para alem do uso de STRs, recorrem-se a outros marcadores a título complementar. Um destes marcadores sao SNPs. SNPs sao marcadores bi-alélicos, o que significa que apenas existem dois alelos possíveis na populaçao. Sao muito polimórficos e por isso nao sao utilizados como marcadores de eleiçao, mas como marcadores complementares. Encontram-se descritos milhoes de SNPs no genoma humano e tem novamente apenas dois alelos por marcador. Uma vantagem destes marcadores e o tamanho do seu produto de amplificação, que e bastante menor, tendo no máximo 100 bp, ao contrario de STRs, que pode ter milhares de bp. Numa amostra antiga ou degradada, STRs longos podem ser mal detetados ou nem sequer serem detetados, e por isso, nestes casos, recorre-se tambem ao uso de SNPs. 14 Ao analisar paineis de SNPs, nao estamos a observar o numero de repetiçoes, mas sim a base azotada numa determinada posição. Temos a localizaçao e a base azotada que encontramos. Na posiçao 27, por exemplo, encontramos guanina/guanina (27G), mas na 1 temos citosina/timina (1C/1T). Insertion Deletion Polymorphisms (InDels) Existe um terceiro grupo de marcadores, tambem utilizado a nível complementar, semelhante a SNPs, que sao os marcadores do tipo InDel, em que o que observamos sao deleções ou inserções na sequência. No exemplo, podemos observar um alelo de inserçao em D70, um alelo de deleçao em D77, e simultaneamente, um alelo de deleçao e inserçao em D67. Em 2002, ja se encontravam descritos cerca de 2000 InDels do genoma. Tal como em SNPs, sao marcadores bialelicos e tambem tem produtos de amplificaçao relativamente pequenos, cerca de 160 bp. Sao necessarios 40-60 loci InDel para ter um poder de discriminaçao equiparavel a 13 STRs. Cromossoma Y Se um perfil genetico for obtido com base em marcadores autossomicos, e um perfil unico para esse individuo. Se for com base em marcadores do cromossoma Y, sera um perfil de linhagem, mais 15 especificamente de linhagem paterna. Todos os indivíduos aparentados pela linha paterna terao o mesmo perfil genetico de Y. Da mesma forma, se em vez de STRs autossomicos, estudassemos DNA mitocondrial, iríamos novamente obter um perfil de linhagem, em que seria possível individualizar uma linha materna. No entanto, como e apenas um perfil de linhagem, não irá individualizar uma pessoa. Se por exemplo, fosse encontrado um perfil de cromossoma Y numa zaragatoa vaginal, nao sabemos se o agressor foi o indivíduo, ou o seu irmao, ou pai, ou tio, ou avo, uma vez que todos eles tem o mesmo perfil de Y. Por isso, preferencialmente querem-se perfis de STRs autossomicos, uma vez que estes individualizam uma pessoa singular. Assim, para alem dos marcadores autossomicos existem marcadores de linhagem, que sao os do cromossoma Y e de DNA mitocondrial, que vem da linha paterna e materna, respetivamente. Utilizam-se estes marcadores porque ambos são pequenos, o cromossoma Y sendo o mais pequeno do genoma humano, tendo o seu DNA mais protegido, podendo ser encontrado em amostras degradadas ou fragmentadas. A semelhança dos STRs autossomicos, existem diferentes painéis de STRs do cromossoma Y. Sao também DNA satélite, que e DNA repetitivo, com o bloco de repetiçao em tandem, em DNA nao codificante. O primeiro painel criado para STRs de cromossoma Y chamava- se o Painel de Haplótipo Mínimo que era constituído por 9 marcadores de STRs. Neste caso, a nomenclatura para se referir a cromossomas sexuais e DY ou DX para referir ao cromossoma Y ou X, respetivamente. Apos este painel, surgiu o Haplótipo Estendido, e depois o Haplótipo Completo, mas atualmente utilizam-se paineis com muitos mais marcadores. Ao aumentar o numero de marcadores, a semelhança dos marcadores autossomicos, ira aumentar o poder de discriminaçao entre grupos de indivíduos. 16  Tal como em STRs autossomicos, ao observar a representaçao de um gel de agarose, observamos o numero de repetiçoes. Neste caso, como se trata apenas de marcadores do cromossoma Y, apenas iremos observar um alelo por marcador, uma vez que apenas a linha paterna e que passa a informaçao deste cromossoma sexual. E importante nao esquecer que estes resultados nao deixam de ser um perfil de linhagem, uma vez que os marcadores autossomicos e que individualizam uma pessoa, no entanto, ao ter mais marcadores, e possível ‘afunilar’ essa linhagem para se chegar mais facilmente ao indivíduo em questao. Cromossoma X Relativamente ao cromossoma X e a marcadores STR para o cromossoma X, tambem tem utilidade no ambito forense, mas para utilizaçoes diferentes: nao tem tanta utilizaçao para casos de Criminalística Biologica, mas principalmente para casos de parentesco biológico. Mais regularmente, sao casos constituídos por um trio: a mae biologica, a criança e o suposto pai. Mas pode haver algumas variantes em que ha lapsos da geraçao estudada mas e necessario ver se existe parentesco ou nao. Tem as mesmas características basicas dos STRs autossomicos e STRs do cromossoma Y. No entanto, a transmissao da informaçao pode-se dar de forma diferente. Um individuo do sexo masculino recebe um cromossoma X da sua mae, que tem 2. Por isso, esse indivíduo recebe 50% do genoma do cromossoma X da mae, mas esses 50% serao 100% dos marcadores de cromossoma X que o filho tera, daí os 100% nos marcadores X. De mae para filha, tendo 2 cromossomas X, recebe um da mae e outro do pai, sendo 50% de cada um. Agora do pai para um filho, o pai da o seu cromossoma Y, pelo que o filho nao recebe nenhum X do pai. 17 No caso de avos, existe um lapso de uma geraçao. No caso de um avo e a sua neta, por exemplo, como de pai para filha ela 100% dos marcadores do pai, o lapso de uma geraçao nao altera esse valor. Os marcadores de cromossoma sao raramente utilizados, apenas em casos especialmente complexos ou com lapsos de geraçoes entre indivíduos. Amostras Forenses e Metodos Laboratoriais Amostras Estudadas em Contexto Forense Existem dois tipos de amostras que chegam para estudo a um laboratorio de genetica forense. Esta distinçao e sempre feita nao so por uma questao de organizaçao, mas tambem para o estudo destas amostras. Assim as amostras podem ser ou amostras de referência ou amostras-problema. Em termos de estudo laboratorial, estes dois tipos de amostras não podem ser estudados ao mesmo tempo, sendo necessario ter salas ou espaços separados e estuda-las em tempos diferentes. Amostras de Referencia Amostras de referência, em contexto medico-legal e forense, sao todas as amostras recebidas no laboratorio que sao provenientes de um individuo identificado de forma inequívoca. Sao tambem amostras em que e possível confirmar sempre a existência e a manutenção da cadeia de custódia, apesar de tambem existir uma cadeia de custodia para amostras-problema. Para alem disso, sao amostras em que a quantidade e qualidade do DNA recolhido e elevada. Alguns exemplos de amostras de referencia sao raspados da mucosa oral, sangue total (mais antigamente) ou em mancha de sangue (pratica atual). No entanto, existem outros tipos de amostras que sao consideradas amostras de referencia, por exemplo em cadáveres, em que se recolhem fragmentos de orgaos de um cadaver bem identificado, ou tambem peças dentárias ou ósseas. Amostras-Problema Por outro lado, as amostras-problema sao amostras biologicas provenientes de um individuo não identificado, ou seja nao sabemos de quem sera aquele perfil genetico. Podem tambem ser amostras de indivíduos identificados, mas onde o material recolhido não será exclusivamente de uma só pessoa. Por exemplo, num caso de uma vítima de agressao sexual, uma zaragatoa vaginal que e recolhida sera da vítima, 18 que estara inequivocamente identificada, no entanto, a amostra trara nao so o perfil da vítima mas tambem uma componente nao identificada do agressor. Por causa dessa componente nao identificada, a amostra sera considerada uma amostra-problema. Em amostras-problema, o DNA recolhido tambem costuma não ter a qualidade e quantidade elevada das amostras de referencia, e costuma ser recolhido no local do crime. Existem tambem amostras-problema recolhidas de indivíduos presencialmente, logo sabe-se inequivocamente de quem e a amostra, e tem-se elevada quantidade e qualidade de DNA, mas o individuo encontra-se indocumentado, pelo que para todos os efeitos, a amostra recolhida nao pode ser de referencia. Em muitos casos, e utilizada uma luz chamada luz forense, que tem um comprimento de onda específico, onde e possível ver fluidos corporais, como saliva ou sémen, quando esta luz e irradiada em roupas ou superfícies, emitindo fluorescência. Cadeia de Custodia A cadeia de custódia e um conjunto de procedimentos e formalismos de documentos que asseguram exatamente a quem foi recolhida a amostra, por que indivíduos e que esta passou, com informaçao das horas e condiçoes de transporte e todos os passos pelo meio. Quer amostras de referência, quer amostras- problemas têm de assegurar uma cadeia de custódia, senao os exames periciais podem nao ser aceites em tribunal como prova, uma vez que se a cadeia for quebrada, pode haver a possibilidade de ter ocorrido adulteraçao da amostra, introduçao de algo na amostra ou ter sido retirado algo que ira alterar o resultado dos exames periciais feitos. Assim, a cadeia de custodia garante a identidade e integridade das amostras forenses. Da-se pela verificação e confirmação previa, mediante documentos oficiais, da identificação de qualquer individuo a quem sejam recolhidas amostras para estudo forense, bem como existe o registo pormenorizado, escrito e fotografico, de toda a informaçao possível, sobre o local de obtençao de amostras. Tambem sao dadas informaçoes sobre o transporte e acondicionamento de amostras em condiçoes de preservaçao adequadas (uma vez que se nao forem transportadas da forma correta, pode levar a degradaçao e perda de qualidade da amostra), os métodos e técnicas validados, idealmente em serviço acreditado, e tambem a utilizaçao de controlos negativos e positivos em todos os ensaios. Utilizam-se a para registo de toda esta informaçao referente a cada amostra. Para esta verificaçao, todos os peritos que trabalham no Instituto de Medicina Legal tem todo o seu perfil genetico feito, quer autossomico, quer sexual, quer mitocondrial, para no caso de haver alguma contaminaçao do laboratorio, ser possível ver na base de dados e ser possível retirar esses resultados e conseguir a mesma ter a amostra acreditada em tribunal. Metodos Laboratoriais Os principais metodos laboratoriais utilizados no ambito forense sao bastante semelhantes a metodos utilizados na area da biologia molecular e genetica molecular. Existem no entanto, alguns procedimentos que sao exclusivos da genetica forense. Assim, quando uma amostra chega a um laboratorio de genetica forense, segue uma serie de passos no seu tratamento: 19  1) Observaçao e Descriçao Previa das Amostras 2) Pre-Tratamento de Amostras (p/ Amostras Osseas) 3) Extraçao de DNA 4) Quantificaçao de DNA 5) Amplificaçao de DNA 6) Sequenciaçao 7) Deteçao de Produtos Amplificados 8) Valorizaçao dos Resultados Laboratoriais 9) Analise Estatística dos Resultados Obtidos 10) Elaboraçao do Relatorio Pericial Observaçao e Descriçao Previa das Amostras O primeiro passo e a observação e registo fotográfico de todas as amostras recebidas. Todas as amostras sao observadas numa câmara de segurança biológica. Apesar da observaçao nao ser um metodo laboratorial, e feito em ambiente laboratorial e por isso tem de ser feito numa camara, uma vez que sao amostras das quais nao se sabe a sua origem e outras informaçoes, existindo a possibilidade de virem contaminadas com vírus, bacterias ou parasitas. Assim, para diminuir o risco para o operador, todas as amostras sao observadas, fotografadas e registadas em camaras de segurança biologica. No entanto, se a amostra tiver dimensoes superiores a da camara, e necessario manter a segurança dos operadores. E entao utilizada proteçao individual, designadamente oculos ou viseira, mascara, luvas, fato macaco de corpo inteiro. Neste passo tambem e utlizada a luz forense, que e emitida por uma lanterna com um determinado de onda, que ao incidir em materiais onde tenham existido fluidos biológicos, que normalmente perdem a cor ao secar, como a saliva e o semen, que irao emitir fluorescência, sendo depois essas zonas de fluorescencia recortadas e onde vao ser realizados os ensaios. Pre-Tratamento de Amostras (Amostras Osseas) Este passo nao ocorre na maior parte das amostras forenses, sendo um pre-tratamento específico de amostras ósseas. Se a amostra for, por exemplo, um femur, este nao cabera dentro de um tubo de ensaio para um estudo de biologia molecular. Aí, e necessario um pre-tratamento especial, onde sao utilizadas ferramentas semelhantes a ferramentas de ferreiro, como um torno de ferro, esterilizado para ser usado na camara. Usa-se tambem uma serra eletrica, como as usadas em operaçoes de ortopedia, para cortar o osso. E tambem usado um aspirador, uma vez que ao utilizar a serra, sao soltos fragmentos de osso que podem ser aspirados pelos operadores e pode ser perigoso. E entao cortado um pequeno fragmento, que e depois cortado em fragmentos muito reduzidos. Utiliza-se a extremidade dos ossos longos, preferencialmente a extremidade mais distal. Seguidamente, e necessario pulverizar estes fragmentos. Esta pulverizaçao e feita dentro de ampolas, que tem na sua extremidade peças metalicas. Dentro destas ampolas e colocado um êmbolo tambem em ferro, dentro de uma maquina denominada criotriturador. 20 O criotriturador utiliza dois princípios: o frio, com o auxílio de azoto líquido, a -80ºC, ficando o osso a uma temperatura muito baixa, necessaria pois neste intervalo de temperaturas, o osso torna-se muito fragil, facilitando a sua pulverizaçao. O outro princípio e o eletromagnetismo, em que o embolo ira de uma extremidade para a outra da ampola devido as peças metalicas nas pontas. O resultado e o osso completamente pulverizado, pronto para o procedimento seguinte. Este passo e necessario apenas quando o corpo se encontra completamente esqueletizado e e antigo o suficiente para ja nao ter tecidos moles. Para este passo, sao preferidos ossos grandes como o femur e dentes tambem, uma vez que os dentes tem esmalte, que nao se decompoe, mantendo a polpa intacta, dando uma boa amostra de DNA apos pulverizaçao. Extraçao de DNA A extraçao de DNA consiste em destruir tudo o que forem estruturas membranares, proteínas, e numa fase final, fazer uma separaçao de restos proteicos e restos membranares de acidos nucleicos. Podem-se utilizar metodos enzimaticos, químicos ou físicos. Métodos Enzimáticos Metodos enzimaticos utilizam enzimas para destruição de membranas e estruturas proteicas. A maioria dos metodos enzimaticos utiliza uma enzima chamada proteinase K, que realiza a destruiçao de todas as estruturas, ficando apenas acidos nucleicos. Métodos Químicos Para este tipo de metodos utilizam-se tampões de lise, detergentes ou substancias semelhantes que provocam a destruiçao de estruturas membranares e desnaturação de proteínas. Uma substancia muito utilizado o DTT, que e um detergente que cria uma fase de acidos nucleicos e outra com proteínas e estruturas membranares destruídas Métodos Físicos O principal metodo físico que se utiliza e o calor. Sao aplicadas temperaturas próximas da ebulição que promovem a destruição e desnaturação de proteínas. No entanto, as temperaturas nao podem ser demasiado elevadas, por intervalos de tempo prolongados, pois pode levar a destruiçao dos acidos nucleicos juntamente com as proteínas. Quando se estuda material vegetal, tambem se pode usar a maceraçao das amostras. A seguir, e necessaria a purificação e separação das 2 fases distintas: a dos acidos nucleicos, e a dos restos proteicos. 21 A separaçao e feita atualmente por metodos automatizados, recorrendo a diferentes tecnicas que permitem a purificaçao e separaçao do DNA. A maior parte dos metodos recorrem a sílica. A sílica retém os ácidos nucleicos, que tem tropismo para a sílica, ficando agarrados a mesma, sendo que todos os restos proteicos são removidos atraves de uma lavagem. Existem tambem beads, designadamente beads magnéticas, que funcionam de forma semelhante a sílica, ‘agarrando’ os acidos nucleicos, sendo passada uma soluçao de lavagem, ficando apenas as beads com os acidos nucleicos. A fase de separaçao e purificaçao e bastante importante, uma vez que se quer o DNA tão puro quanto possível, ate porque para os metodos que irao ser aplicados seguidamente, se existirem contaminantes no DNA, a maior parte deles podem atuar como inibidores nas quantificaçoes e amplificaçoes de DNA. Alem disso, se a separaçao e purificaçao nao for bem-sucedida, a quantidade de material recolhida nao sera suficiente para a PCR ter qualidade. Quantificaçao de DNA Em casos forenses, e comum ter amostras antigas, complexas e/ou degradadas, sendo necessario quantificar o DNA obtido. A quantificaçao faz-se com dois objetivos: a quantidade de DNA total e a fraçao de DNA masculino, ou seja, o fragmento de cromossoma Y existente, obtido atraves de STRs desse cromossoma. Esta fraçao e relevante em casos de, por exemplo, zaragatoas vaginais, se for detetada uma fraçao de DNA masculino, sera do agressor. Existe tambem outro indicador mais recente, que e o fator de inibição. Quando este índice e elevado mas a fraçao de DNA total e uma boa quantidade, devem-se repetir os metodos de purificaçao sucessivamente, de modo a obter DNA mais puro. Amplificaçao de DNA O metodo de amplificaçao mundialmente utilizado e o PCR. O PCR ira amplificar as sequencias onde temos os STRs, utilizando primers específicos para o painel de STRs em estudo. O PCR e composto por tres passos: 1. Desnaturaçao da Cadeia Dupla 2. Annealing 3. Extensao Desnaturação da Cadeia Dupla O primeiro passo consiste na abertura da dupla cadeia de DNA, atraves da desnaturaçao do DNA para se obterem cadeias simples, que irao emparelhar com os primers. Este passo ocorre a 93-94ºC sem passar dos 100ºC, temperatura em que o DNA sera degradado, o que nao e o objetivo. Annealing 22 O annealing consiste na ligação de primers específicos, neste caso para STRs a zonas especificas do DNA onde existe compatibilidade com os primers. Este passo ocorre entre 45-60ºC, temperatura em que os primers, que sao oligonucleótidos de 15-20 bp conseguem emparelhar-se com as regioes homólogas. Extensão Ocorre a ~72ºC mas pode depender das enzimas utilizadas, que sao polimerases. A polimerase mais frequente e utilizada a nível mundial e a Taq polimerase. Este passo levara a produção de cópias dos fragmentos. Utilizam-se marcadores de STRs autossomicos e de cromossomas sexuais X e Y, bem como o estudo de DNA mitocondrial. Para o DNA mitocondrial, nao existindo STRs do mesmo, e necessaria a sequenciaçao da molecula. Sequenciaçao A sequenciaçao utilizada ate ha 10- 15 anos atras era somente a sequenciação de Sanger. Atualmente, em complemento de Sanger, e utilizada NGS (Next Generation Sequencing), tambem chamada de MPS (Massive Parallel Sequencing), ou seja, faz a sequenciação em paralelo de milhares de fragmentos em simultaneo. Para alem disso, a sequenciaçao de Sanger estuda fragmentos entre 200-800 bp, nao podendo estudar por exemplo, o genoma mitocondrial (~20 000 bp). O tempo que a sequenciaçao de Sanger demora e tambem muito superior a MPS, que por sequenciar o genoma em simultaneo, demora muito menos tempo. A sequenciaçao de Sanger consiste em PCRs sucessivas utilizando oligonucleótidos marcados com cores diferentes (cada nucleotido com uma cor diferente). A inserção de cada nucleotido marcado interrompe a cadeia, tendo no fim da cadeia a cor da base azotada a que corresponde. Sao assim sucessivas amplificaçoes que sao sempre interrompidas pela integraçao de um nucleotido marcado. Esta sequenciaçao e extremamente especifica, uma 23 vez que iremos obter a sequencia nucleotido a nucleotido, ao contrario da MPS, em que por sequenciar milhares de vezes em simultaneo, pode ter erros de leitura. Deteçao de Produtos Amplificados O metodo de deteçao em genetica forense e diferente do normalmente utilizado em biologia molecular. Ao passo que a biologia molecular deteta os produtos amplificados em gel de agarose, a genetica forense tem um PCR multiplex, em que sao amplificados vários marcadores, logo sao amplificadas varias regioes em simultaneo. Se fosse feita a deteçao em gel de agarose, esta nao teria poder de resoluçao suficiente para ver todos os marcadores amplificados. Desta forma, em genetica forense, utiliza-se a eletroforese capilar, que e feita em tubos capilares, muito finos, por onde corre o produto de PCR, em que no seu interior tem uma substancia semelhante a agarose, sendo a mesma uma matriz que permite a corrida e separaçao de fragmentos de DNA. Numa determinada zona do capilar, existe uma zona que e atravessada por um feixe de laser que verifica em cada momento que cor e emitida, correspondente a cada primer específico para cada STR. As cores vao sendo detetadas mas, ao contrario do gel de agarose, em que se observavam bandas, na eletroforese capilar, observa-se num computador os picos e o que e detetado em cada regiao. Valorizaçao dos Resultados Laboratoriais A valorizaçao dos resultados laboratoriais tem grande importancia em termos forenses, em que o que se pretende e dizer se os resultados obtidos podem ser aceites ou não. Em todos os PCRs sao utilizados dois controlos: o controlo positivo e o controlo negativo. O controlo negativo corresponde ao poço onde se encontram todos os reagentes utilizados, mas sem a amostra que esta a ser estudada, onde o resultado que se deve obter e negativo, não obter qualquer sinal de amplificação. Se por exemplo, numa zaragatoa vaginal, se obter algum perfil genetico, os resultados tem de ser excluídos. E muito raro tal acontecer. No entanto, existe a possibilidade destes resultados serem aprovados. Como ja mencionada, todos os operadores que tratam amostras tem os seus perfis geneticos, quer autossomicos, quer sexuais, quer mitocondriais, numa base de dados. Se o perfil genetico obtido no controlo negativo for de algum desses operadores, e apenas aparecer no controlo e nao for o mesmo perfil que aparece nas outras amostras, entao e possível valorizar estas amostras, uma vez que se sabe de quem foi a contaminaçao. O controlo positivo corresponde a um fragmento de DNA conhecido em que se espera obter um sinal específico na eletroforese. Se nao aparecer sinal, novamente, as amostras terao de ser excluídas, porque significa que o PCR nao funcionou corretamente. Analise Estatística dos Resultados Obtidos Para a analise estatística elaboram-se um conjunto de cálculos e determinação de uma série de parâmetros estatísticos. Esta analise e feita por programas, nomeadamente eletroprogramas. 24 Elaboraçao do Relatorio Pericial Existem tres principais tipos de relatorios: parentesco biologico, criminalística e identificaçao de desconhecidos. Parentesco Biológico Começa com a informaçao da entidade requisitante, que por norma e um tribunal, mas pode ser uma entidade particular com autorizaçao. Neste tipo de relatorios sera investigada a paternidade, maternidade, filiação ou outra relação familiar. Tem informaçao dos ensaios laboratoriais realizados, com as datas da sua realizaçao. Seguidamente, tem-se os intervenientes, que e o pretenso pai, um parente do pretenso pai (em casos em que o pretenso pai morreu ou nao e encontrado), a mãe e a criança/filho. Tambem sao especificados os tipos de amostra usados, que normalmente sao manchas de sangue ou zaragatoas bucais, mas tambem podem ser amostras osseas ou de dentes. Para parentesco biologico, e sempre preferida a linha reta e direta (ex: paifilho; avôpai) e sem lapsos de geraçao (ex: avofilho; bisavôpai) porque dara os resultados mais conclusivos. Nos procedimentos, e explicito o procedimento efetuado, com detalhes sobre a amostra e seu tratamento e equipamentos utilizados. No fim, tem-se um quadro com os resultados obtidos, tendo-se uma coluna com os marcadores STRs usados, que atualmente sao do sistema CODIS e mais alguns marcadores, com informaçao do numero de repetiçoes. No fim, tem-se as conclusões do relatório, em que pelo estudo de polimorfismos, pode-se chegar a dois tipos de conclusoes: ou o individuo e excluído quando ha incompatibilidade numa serie de marcadores, em que se afirma que nao sera, por exemplo, o pretenso pai. Ou entao, diz-se que nao pode ser excluído o individuo e apresenta-se uma valorização estatística de perfis genéticos, como o valor do índice de paternidade (IP) e possibilidade de paternidade. Identificação de Desconhecidos E semelhante ao relatorio de parentesco biologico, mas com identificação de restos cadavéricos em que se pretende identificar o cadáver. O corpo do relatorio e semelhante, com o tipo de amostras, procedimentos e resultados de marcadores discriminados. A conclusao diz se o que estamos a identificar e o presumível individuo ou nao. Em vez de se fazerem índices de paternidade (IP), fazem-se os calculos da Razão de Verossimilhança (LR – Likelihood Ratio), que indica a probabilidade do perfil genético em estudo ser do individuo que se esta a procurar. Criminalística Biológica Neste tipo de relatorio, teremos uma vítima e o suspeito ou arguido, ou interveniente acidental. As amostras tambem serao diferentes. Normalmente, tem-se zaragatoas vaginais, peças de roupa, pelos, laminas, facas, peças de roupa, unhas ou cabelos. Os metodos utilizados sao os mesmos dos outros tipos de relatorios. Na conclusao, utiliza-se novamente o LR para dizer que o perfil genetico das amostras e o do suspeito do crime. Nestes casos, encontra-se muitas vezes uma mistura de perfis genéticos, normalmente da vítima e do agressor. As conclusoes tambem especificam se o material e semen, sangue ou saliva, e indicam se o perfil e do arguido. Pode tambem ser excluído o arguido, por incompatibilidade de resultados. Identificaçao de Desconhecidos A maior parte dos exames periciais de identificação de desconhecidos acontece em cadáveres. Quando este entra nos serviços medicos e autopsiado, sendo que o primeiro objetivo da autópsia, que e muitas vezes esquecido, e a identificação do cadáver. O medico nao consegue começar uma autopsia antes de identificar o cadaver, apenas depois seguir para a determinaçao da causa e circunstancias da morte. 25 Identificaçao Humana A identificaçao humana faz-se por imperativos diferentes:  Imperativos eticos/morais/humanitarios  Imperativos sociais/civis/forenses  Imperativos forenses/criminais Imperativos Eticos, Morais e Humanitarios Mortos, por exemplo, em guerras, ou usando um exemplo em Portugal, os carbonizados nos incendios de Pedrogao Grande, ou seja, questões humanitárias e morais, mas que sao simultaneamente eticas. Em Portugal e países desenvolvidos, o enterramento ou inumaçao de um cadaver so pode ser executada com um cadaver identificado inequivocamente, sendo lei e imperativo. Imperativos Sociais, Civis e Forenses Tudo o que diz respeito a recolha, tratamento e conservação de dados pessoais de modo a individualizar alguem, ou seja, um determinado conjunto de dados que permitem individualizar uma pessoa como um ser unico no mundo. E tambem necessario para libertaçao de heranças ou patrimonios aos descendentes, que sao procedimentos que nao podem ser avançados sem certidao de obito. Imperativos Forenses e Criminais Quando a morte pode ter sido resultado de homicídio ou outro crime, e necessario saber os detalhes para se proceder aos devidos resultados legais. Na Declaraçao Universal dos Direitos do Homem, feita a 10 de dezembro de 1948, todos os indivíduos tem o direito inalienavel a sua dignidade e reconhecimento, segundo o Artigo 6º: Quer o indivíduo esteja vivo ou morto, tem direito à sua identificação. Metodos de Identificaçao Identificaçao Visual Direta A identificação visual e um metodo científico e e tambem o mais comum (utiliza-se em 95% dos cadaveres). Permite a identificação de ‘cadáveres frescos’, que sao cadaveres que mantem um aspeto semelhante aquele que era o individuo quando era vivo. Por comparaçao com uma fotografia, documento de identificação ou reconhecimento por familiares e considerado uma identificaçao visual direta. 26 Identificaçao Lofoscopica Quando nao e possível identificar o cadaver pela cara, por nao ser um cadaver fresco, nao manter a face intacta ou ate por decapitaçao, utiliza-se a identificação por lofoscopia, que consiste no estudo das impressões digitais. As impressoes digitais sao “marcas que imprimem as pontas dos dedos sobre qualquer superfície lisa ou sobre papel, quando se encontram sujas com tinta, suor, gordura ou outra substancia.” Estas marcas sao devido a presença de uma série de sulcos e cristas cuja distribuição origina variados padrões e figuras. Este metodo e tambem um metodo de identificaçao medico-legal científico e pode ser utilizado devido a varias características da lofoscopia:  Perenidade  Inalterabilidade  Variabilidade  Possibilidade de Classificaçao, Arquivo e Consulta – Comparaçao Perenidade Desde o nascimento ate a morte do individuo, este tem sempre impressões digitais. Inalterabilidade A impressao de um individuo não é alterada, mantendo-se a mesma do nascimento até à morte, exceto quando o individuo sofra uma queimadura ou corte. Variabilidade Nao existem dois indivíduos na populaçao humana com a mesma impressao digital, sendo uma forma de identificação inequívoca de uma pessoa. Possibilidade de Classificação, Arquivo e Consulta – Comparação E possível, e existe em Portugal e varios países desenvolvidos, ter um registo central de impressões digitais associadas ao documento de identificaçao. Esta característica torna este metodo de identificaçao bastante simples e barato. Identificaçao Odontologica Quando nem a identificaçao visual nem lofoscopia e possível, utiliza-se a medicina dentária forense. Apesar do numero de dentes num humano ser fixo, existem varias nuances que tornam este um metodo de identificaçao: a posição relativa entre os dentes, o tipo de restauros que pode ter, a existencia de próteses dentárias. Este conjunto de características da origem ao perfil dentário, que e único para cada individuo e que permitira a sua identificaçao se existir registo medico dentario previo a morte. Este metodo e a semelhança dos anteriores relativamente pouco dispendioso e rapido. Identificaçao de Casos Nao Identificaveis Quando o corpo se encontra muito deformado, degradado ou muito antigo, pode nao ser possível utilizar nenhum dos metodos de identificaçao anteriores. Isto acontece em corpos ja completamente esqueletizados em que a identificaçao visual e lofoscopia nao e possível; quando o perfil dentario nao se encontra presente na sua totalidade; ou quando os corpos sao muito antigos, como no exemplo abaixo, em que e um cadaver esqueletizado de um soldado da Guerra do Ultramar, que precede a existencia de perfis dentarios. 27 Nestes casos, recorre-se a genetica forense, atraves do perfil genetico e de marcadores STR. No entanto, antes da intervençao da genetica forense, recorre-se a outra especialidade, a Antropologia Forense. Antropologia Forense “E o estudo dos restos osseos esqueleticos, a fim de conseguir a identificaçao pessoa, averiguar a causa da morte, a data da morte, a idade, raça, sexo e estatura do sujeito, marcas profissionais, lesoes osseas antigas, estudo da cavidade bucal, e todos os dados possíveis para proporcionar informaçao [...] sobre a identificaçao do sujeito.” Reverte, 1999 “E a reconstruçao da biografia biologica de um individuo a partir dos restos osseos, incluindo a reconstruçao dos seus antecedentes ate ao momento da morte.” Iscan, 1986 Quando nao existe nenhuma informaçao sobre o cadaver, nao ha qualquer informaçao sobre o sexo, idade, raça, estatura, etc.. Neste caso, a Antropologia Forense intervem como forma de ‘afunilar’ o número de indivíduos que podem corresponder ao cadaver em estudo. Assim, a Antropologia Forense consegue fazer e identificar:  Uma descrição geral do esqueleto, incluindo alterações tafonómicas (alteraçoes decorrentes das condiçoes climatericas e ambientais que atuam num cadaver desde a sua morte ate a altura em que este e encontrado)  Uma definiçao do perfil biológico, incluindo sexo, idade a morte, estatura e robustez, ancestralidade  Fatores de individualização A Antropologia Forense obtem uma identificação de presunção, sendo que depois aplicados os metodos de genetica forense sera obtida uma identificaçao positiva. 28 Descriçao Geral do Esqueleto A descriçao geral do esqueleto e uma observação macroscópica inicial, em que se observa a cor, textura e forma do cadaver esqueletizado, bem como o efeito que as condiçoes climatericas e ambientais possam ter tido neste desde o momento da morte ate ser encontrado e trazido para investigaçao medico-legal. Perfil Biologico As principais características de um perfil biologico sao:  Sexo do Individuo  Idade a Altura da Morte  Estatura e Robustez  Afinidades Populacionais Sexo do Individuo Atraves do estudo de ossos específicos, nomeadamente o osso da bacia e complementarmente os ossos do crânio, e possível determinar o sexo do individuo. A principal diferença entre os ossos da bacia da mulher e do homem, e que devido a capacidade e preparaçao do corpo para um potencial parto, a bacia do sexo feminino e por norma mais larga e mais baixa, com uma forma em U, ao passo que o sexo masculino tem uma bacia com ossos mais estreitos e altos, com uma forma em V. 29  Sexo Masculino Sexo Feminino Em complemento, sao tambem observados os ossos do crânio. Por norma, indivíduos do sexo masculino tem um cranio de maiores proporções, com arcadas supraciliares (por baixo das sobrancelhas) marcadas no osso, onde as do sexo feminino sao mais esbatidas, e o tamanho do seu crânio é menor tambem. Sexo Masculino Sexo Feminino E tambem possível discriminar o sexo pela cabeça do fémur, apesar deste metodo nao ser o principal utilizado. No caso da mulher a cabeça do femur, que e o osso mais robusto e longo, e mais pequeno e suave, enquanto no caso do homem, e por norma maior e mais robusto. Idade do Indivíduo A idade de um individuo e determinada pelos ossos da sínfise púbica e pela extremidade da quarta costela esternal. Os ossos da sínfise púbica localizam-se na zona central da bacia que ao nascimento são ossos separados, um do lado esquerdo e outro do lado direito, que se fundem com a idade. Com esta fusao, surge uma zona de embate entre eles, que com o passar dos anos, torna-se desgastada e esbatida. Assim, um individuo jovem (15-20 anos) tera esta face muito irregular, enquanto alguem com 80-90 anos, que teve esta zona em contacto uma com a outra durante muitos anos, tera uma superfície completamente regularizada e praticamente lisa. 30 Idade Da mesma forma, ao observar a metamorfose da extremidade esternal da 4ª costela, e possível ver que um individuo mais velho tera esta extremidade mais desgastada. Existem tabelas que permitem, atraves de mediçoes, obter o grau de metamorfose e a suposta idade. Idade Observando novamente o cranio, agora focando nas suturas cranianas, e possível distinguir a idade atraves da definiçao das suturas. Um individuo com 60-70 anos quase não terá uma grande presença das suturas da uniao entre os diferentes ossos do cranio. Estatura e Robustez Para presumir uma altura, avalia-se o nosso maior osso, o fémur, para estimar a altura do individuo. Este metodo foi criado por uma investigadora portuguesa, Cristina de Mendonça, e envolve mediçoes de certos pontos do femur, chegando-se a altura presumida do individuo. Afinidades Populacionais Relativamente a afinidades populacionais, a Antropologia Forense tenta dar informaçao da origem etnica do individuo em estudo. Atualmente, estas características estao a tornar-se menos salientes, devido a globalizaçao e mistura de populaçoes. A Antropologia Forense tenta dar informaçao se o individuo e:  Mongoloide – povos do leste e sudeste asiatico, Oceania (malaios e polinesios) e continente americano (esquimos e ameríndios)  Caucasoide – povos do continente europeu, Norte de Africa e parte do continente asiatico (medio oriente)  Negroide – povos da Africa subsariana Consegue-se distinguir as afinidades pelo crânio e características faciais, principalmente nasais, espaço inter-orbital, presença ou ausencia de prognatismo (projeçao da mandibula para a frente). O cranio de um indivíduo negroide tem maior distância entre os olhos, uma raiz (espaço entre sobrancelhas) mais pronunciada, crânio mais robusto e mandibula mais projetada para a frente, e tambem uma arcada dentaria superior. A Antropologia Forense utiliza uma serie de mediçoes do cranio, incluindo a raíz, a ponte, largura da abertura nasal, e a espinha para averiguar a afinidade populacional do cadaver esqueletizado. 31 A forma da arcada dentária superior tambem da indicaçoes da afinidade, em que a arcada de caucasianos e mais arredondada em forma de U, a de negroides mais retangular, e a de mongoloides é intermédia. Fatores de Individualização Existem adicionalmente características que permitem a individualizaçao mais especifica de indivíduos, devido ao facto de serem pouco comuns ou mesmo raras. Por exemplo, na imagem, mostra um crânio que tem um osso a mais em baixo, quando o normal e ser apenas um osso, este tem dois. Este exemplo e característico de algumas populações centro-americanas. Outro exemplo e a existencia de uma sutura metópica, que se localiza na zona do centro da testa, em que existe um sulco a dividir o osso frontal do cranio em dois, que e visto em radiografia, e devido a sua raridade permite uma individualizaçao simples do indivíduo, uma vez que esta característica, ao contrario da anterior, que e comum num tipo de populaçao, e rara em qualquer pessoa. Outro fator de individualizaçao, tambem no cranio, e a existencia de varios ossículos cranianos supranumerários, em que na zona de tras do cranio, existem variados ossos pequenos, sendo esta característica comum em populações centro-americanas, em algumas tribos. Existem alguns ossos, como o do esterno, mas nao so, em que alguns indivíduos, sendo esta característica muito rara, têm uma abertura no osso, que existe desde nascença. Estas características, se houver registo delas quando o individuo era vivo, sao extremamente importantes e individualizantes para um cadaver esqueletizado, devido a sua raridade. Sinais de Doença Existem tambem características que sao obtidas nao ao nascimento, ou seja, de forma nao congenita, que podem servir como fatores individualizantes muito específicos, devido a sua raridade, se, novamente, houver registo dos mesmos quando o individuo era vivo. 32 Nesta imagem, temos um individuo que no passado teve um tumor ósseo no cranio, em que o mesmo teve de ser removido. Ao este cranio ser encontrado, e muito facil individualizar a pessoa, uma vez que nao existirao muitos indivíduos sem parte do cranio com registo de um tumor osseo. Outras pessoas, nascem com o palato fendido, ou seja, a zona onde esta o ‘teto’ da boca tem uma abertura a meio. A maior parte destes casos e resolvido a nascença com uma cirurgia simples, mas as vezes nao se fecha o palato. Quando isto acontece, torna-se uma característica extremamente especifica de apenas alguns indivíduos, que servira como um fator individualizante. A diabetes, entre muitas complicaçoes, pode levar a neuropatia diabética, em que ha danos dos vasos circulatorios, que ficam mais estreitos e duros, e nervos, que pode levar a uma infeção grave, que pode criar necrose das extremidades, tendo muitas vezes de ser resolvida por amputação. Esta característica leva a outro fator de individualizaçao muito raro que permitira a identificaçao de um individuo desconhecido. Tambem pode haver irregularidades, por exemplo, no femur, em que na cabeça do femur, existe evidencia que existia um problema articular, em que muito provavelmente, o individuo em vida claudicava, ou seja, coxeava, devido a essa irregularidade. Existem tambem doenças ósseas, como a osteomielite, que provocam buracos pequenos em todo o osso, que tambem sao faceis de identificar. Novamente, observando registos medicos, e possível chegar a uma identificaçao de forma rapida e bastante eficiente. Para alem disso, existem características típicas de outro tipo de doenças, como uma tuberculose bastante violenta, que deixam algumas zonas irregulares na costela. Se o individuo tiver registo de uma tuberculose, as marcas deixadas pela mesma nos ossos da costela levarao a identificaçao do cadaver esqueletizado. Doenças sexualmente transmissíveis, como a sífilis (Treponema pallidum), quando nao diagnosticadas e tratadas, levam a pequenas perfurações no osso, chamadas de periostite, que sao bastante especificas da doença. Cada vez menos comuns, sao características que remetem para os dentes, que indiciam longos períodos de fome entre os 0 e 20 anos, que deixam sulcos nos dentes. Isto acontece em indivíduos que estiveram em situaçoes de desnutriçao severa, com fases de fome extrema. E cada vez menos comum devido ao aumento da qualidade de vida mundial, mas ainda pode ser encontrado em algumas zonas do mundo. Ademais, os fatores de individualizaçao podem nao ser naturais, como por exemplo, um individuo que tenha tido alguma intervenção cirúrgica no cranio, em que ha evidencias dessa cirurgia e da reformulaçao do osso, ou em cirurgias que envolvem implantes metálicos. 33 Assim, a Antropologia Forense consegue, ao fazer um estudo do individuo, pelo seu perfil biologico e fatores de individualizaçao, obter uma identificação de presunção do suposto individuo, que permite afunilar para um número mais restrito de indivíduos, dos quais depois sao chamados familiares para posterior identificaçao genetica. Identificaçao Genetica Se houver algum tipo de amostras pertencentes ao individuo quando este era vivo, como laminas de barbear, escovas de dentes, sangue de alguma analise feita, conseguimos o perfil genético do individuo, que pode depois ser comparado com possíveis familiares, em que se houver compatibilidade de resultados, e existencia de parentesco entre os dois, consegue-se chegar à identificação correta da pessoa. Bases de Dados de DNA Em alguns casos, e possível obter amostras do individuo atraves de bases de dados de DNA. A maior parte dos países desenvolvidos ja tem uma base de dados de DNA que envolve uma grande parte da populaçao, como por exemplo Portugal, que criou a sua base de dados nacional em 2008. No entanto a maior parte dos países em desenvolvimento ainda nao tem essas bases o que pode dificultar a obtençao de amostras de DNA de um individuo desconhecido. 34