Acronimi e Biotecnologie (PDF)

03/11 Acronimi: - NDA: new drug application, uno degli acronimi usato in passato e nel presente per indicare nuovi farmaci di sintesi che dovevano essere approvati. - BLA: biological license application; applicazione fatta all’ente regolatorio per avere l’approvazione del biologico. - NM...

03/11 Acronimi: - NDA: new drug application, uno degli acronimi usato in passato e nel presente per indicare nuovi farmaci di sintesi che dovevano essere approvati. - BLA: biological license application; applicazione fatta all’ente regolatorio per avere l’approvazione del biologico. - NME: new (small) molecular entities, termine più corretto dal 2019. - Biologic: in sostituzione a BLA Negli articoli si trovano spesso tabelle di Public Biotech (dove le industrie biotecnologiche sono quotate). In una Top 10 selling biological drugs 2012 cono riportati nome del farmaco, chi lo ha prodotto (lead company), indicazioni terapeutiche approvate (in quell’anno, spesso cambiano), tipo di molecola, guadagno. Tra le tabelle troviamo anche peptidi (es Lantus) e small molecules (es Gleevec), ma perché nella stessa tabella troviamo categorie diverse di molecole che vengono nominate tutti come biofarmaceutici da nature biotechnology? C’è una caratteristica che accomuna i biologici con alcuni farmaci di sintesi: specificità e target! Sono farmaci molto specifici, selettivi per un bersaglio ecc e per questo sono considerati come biotecnologici (biofarmaceutici) nell’immaginario collettivo. Nel caso dei biologici, il brevetto non comprende solo il prodotto finito ma anche il DNA usato, le cellule usate, e le modifiche che si fanno alle cellule, ecc ovvero processi molto più complicati della sintesi organica classica. Per questo motivo i brevetti depositati possono essere diversi, ad esempio, in USA e in Europa. 08/11 Principali differenze tra BLA e NME Tra i vari farmaci biologici ci sono grosse differenze di PM: da proteine ricombinanti umane come le insuline (a sx) ad anticorpi o costrutti molecolari (a dx) —> PM e complessità di biologici possono essere molto diversi. 1 Esistono molti modi di chiamare i farmaci biotecnologici: biologici è il più comune, ma vengono chiamati anche biofarmaci (biopharmaceutical), farmaci biotecnologici che sarebbe la corretta denominazione. Pipeline: solitamente è un termine che viene utilizzato per il petrolio, i pipeline sono i tubi dove passa il petrolio o il gas ecc. In ambito farmaceutico questo indica che un farmaco entra nel “tubo” (hit compound ottimizzato), fa tutto un percorso fino ad arrivare alla fine, ovvero il paziente. Ogni azienda ha interesse nell’avere una pipeline ricca di composti e he essi siano promettenti. “Pipeline” is the term used to describe all of the projects under development at a company. The pipeline covers work still in discovery and early preclinical phases, through clinical phases 1-3, and finally phase 4, also known as the post-marketing stage. The process by which a product moves through the pipeline can be time-intensive and costly, and not every product will make it all the way through. Sotto alla categoria biofarmaceutica abbiamo prodotti diversi: - Low-tech: a “bassa tecnologia”; il contenuto di innovazione non è molto alto perchè sono formulazioni già conosciute da molti anni come i vaccini classici, prodotti del siero, tossine, antisiero ecc. In questi prodotti la tecnologia non è più innovativa ma ben consolidata. 2  - High-tech: alto contenuto tecnologico innovativo; in quegli anni le proteine ricombinanti complesse (mAb e proteine ricombinanti) sono esplose dal punto di vista dell’utilizzo nei pazienti. Anche le terapie geniche e le cellule staminali iniziavano ad essere utilizzate. La differenza tra queste due classi sta quindi nel contenuto tecnologico di innovazione. Biopharmaceuticals are a wider groups of drugs, it comprehends vaccines, antivirals ext. the term biologic is more related to how we make the drug. NB: in questa tabella abbiamo una quarta colonna, ovvero quella borderline: questi sono prodotti con caratteristiche comuni tra le small chemical entities e i biofarmaceutici. In questa categoria rientrano peptidi, polinucleosidi, prodotti di fermentazione e di sintesi. Uno dei motivi per cui i peptidi si trovano in questa categoria è il PM: non sono abbastanza grandi e complessi per rientrare nei biotecnologici e non abbastanza piccoli per rientrare nelle small chemical entities. Un altro aspetto da considerare è che i peptidi possono essere ottenuti per sintesi —> sono prodotti chimici che non utilizzano organismi viventi per la produzione. Questi peptidi possono essere prodotti sia per classica sintesi, con una regolamentazione apposita, oppure con metodi ricombinanti; quindi, anche se parliamo dello stesso prodotto, in realtà otteniamo sono due cose diverse. Lo stesso discorso vale per i polinucleosidi: sono prodotti che non hanno un ampio mercato; sono sequenze di DNA o RNA modificato e non, ottenuti per sintesi organica in fase solida. In qualche caso possono essere prodotti con sistemi enzimatici ma solitamente si preferisce la sintesi chimica. Ciò nonostante, hanno una complessità e un PM molto elevati, non che un’azione abbastanza specifica. Tra i prodotti di fermentazione rientrano gli antibiotici (esempio penicilline), ovvero metaboliti secondari di piccoli organismi viventi come funghi, batteri, ecc. In questo senso sono dei prodotti biotecnologici, ma ad oggi sono quasi tutti prodotti per sintesi organica come le small molecules. Una volta individuata la struttura viene poi messo a punto il processo di produzione —> è il produttore che decide qual è quello più semplice, che dà le più alte rese, ecc. Solitamente gli antibiotici sono prodotti per via o totalmente sintetica, o al limite semi sintetici. 12/11/24 Esiste una grande varietà di termini utilizzati come sinonimi, ma occorre definire cosa effettivamente sia un prodotto farmaceutico. 3 Un biopharmaceutical secondo una vecchia edizione della farmacopea americana la biotecnologia all’interno dell’industria farmaceutica si riferisce soprattutto alla produzione di proteine utilizzando DNA ricambiante o anticorpi monoclonali. BLA are distinct from chemical-based drugs (small molecules) (chemical-based = prodotti ottenuti con tecniche di sintesi) —> sono solitamente ottenuti con alta consistenza e usando processi chimici ben consolidati. La consistenza della produzione dei farmaci sintetici è importante: se utilizziamo processi chimici standard in condizioni corrette e controllate, il prodotto che otteniamo è sempre lo stesso. With skills and experience the chemical process can be consistence and also is relatively easy to control and relatively easy to test it. —> altre sintesi dello stesso composto possono dare lo stesso prodotto. La purezza può cambiare se il processo non è controllato, ma alla fine possiamo sempre caratterizzare e quantificare le impurezze. Esiste una tecnologia consolidata per rispondere a queste esigenze: che impurezza c’è, quanta e per controllare la consistenza da batch a batch. 4  —> la conseguenza di queste due osservazioni è che i farmaci di questo tipo, anche se prodotte da altri produttori con processi diversi, siano uguali. Tutto ciò, dal punto di vista pratico, ha aperto tutta la parte di legislazione che ha portato alla possibilità di sostituire un branded con un generico nella terapia. At some point everybody could make their chemical compounds and not only big pharmas. —> può essere modificato durante il processo o può portare a modificazioni nella struttura del composto. Each subunit of these polymers is a potential site of variations. NB: un’altra differenza tra BLA e NME è che i primi sono composti flessibili, mentre i secondi sono rigidi per definizione. Per questo motivo la variazione strutturale è molto frequente in BLA e implicita nella complessità della struttura. Le variazioni strutturali sono molto importanti perchè possono implicare una diversa attività. Often we need more than one technique to understand the structure of one protein. —> possono presentare una diversità inerente al modo in cui sono prodotti: abbiamo più strutture non del tutto omogenee che rendono più difficile un’analisi chimica e biochimica rigorosa. NB: follow-on proteins è un termine che veniva utilizzato per indicare sia i biosimilari che altre proteine che “seguono” qualcos’altro. Nel caso dei BLA ci sono moltissime analisi da fare ed esistono ancora dei gap nella descrizione di alcune parti di queste proteine complesse, perciò non abbiamo la descrizione puntuale e precisa che invece otteniamo con l’analisi su una small molecule. NB: microeterogenicità è una caratteristica implicita dei farmaci biotecnologici, dovuta alla complessità strutturale e al fatto che vengono prodotti da organismi viventi, difficili da controllare. Tutto ciò porta ad una maggiore difficoltà di descrizione analitica di questi composti. 5 Le conseguenze sono che: se due produttori vogliono produrre lo stesso farmaco biotecnologico, usando gli stessi sistemi, le stesse tecnologie analitiche, ecc, in realtà ottengono due composti diversi. Questo è importante perchè due composti con delle differenze possono avere profili di efficacia, sicurezza ed immunogenicità diversi tra loro!! Tutti questi fattori hanno complicato la regolamentazione dei farmaci biotech. Method of production and Inherent degree of variability —> la sostanza attiva finale del biologico può avere un inherent degree of variability (implicito grado di variabilità) che viene chiamato microeterogeneità. —> le industrie lavorano per mantenere “micro” l’eterogeneicità dei prodotti e controllano che non abbia effetti tossici sui pazienti. —> sono applicati controlli molto stretti e severi per assicurare il paziente che ci sia una consistenza e che le possibili differenze non abbiano effetto su sicurezza ed efficacia sul prodotto. If you change the manufacturing process you change the product. —> la struttura molecolare così grande e complessa porta a delle sfide analitiche per cui sono necessari metodi molto più sofisticati come: peptide mapping, spettrometri a di massa, ecc. 6  —> la natura e l’identità di un BLA richiede informazioni sul farmaco in sé e per sé, e anche informazioni sulla sorgente biologica (quale DNA utilizzo per produrla) e come viene processata (come mettiamo a punto il sistema ospite-vettore e come lo facciamo crescere per ottenere la proteina = processing del DNA per ottenere il clone che ci darà la proteina). —> caratteristiche proteine ricombinanti. —> il prezzo non è solo legato ai costi di produzione, ma in generale i BLA sono molto più costosi di NME L’ambito regolatorio è molto complesso sia per quel che riguarda il prodotto che per come viene fatto. NB: la differenza tra un brevetto di un farmaco di sintesi e un biologico sta anche nel fatto che i biologici sono coperti da brevetto sia per la molecola in sé e nel suo uso che per quel che riguarda il metodo della produzione: sorgente biologica, come è stata messa a punto ecc. Per questo motivo esistono moltissimi brevetti per una stessa molecola (almeno 4 brevetti rilevanti per ogni biologico). —> il biologico una volta prodotto come farmaco deve essere privo di impurezze o averne livelli accettabili. 7 Perché investire sulle biotecnologie? - La reperibilità del principio attivo è molto importante. - Maggiore sostenibilità ambientale: l’impatto è minore di quella chimica ma comunque c’è. - Minor rischio immunogenico: è minore relativamente ai farmaci già presenti come le proteine non ricombinanti (non umane o contaminate). Questo problema non è stato risolto interamente ma il livello di immunogenicità è molto ridotto. La biotecnologia, come tecnologia, aiuta a risolvere il problema dell’approvvigionamento dei farmaci: il farmaco è una proteina che può anche essere estratta —> le biotech hanno risolto il problema della poca quantità di farmaco ottenuta. Source availability was the big mover. Un farmaco estratto da animale o cellule di animale coltivate può contenere patogeni dell’animale. When you take a compound from a biological source you might be concerned about contamination. Some sources have patogens that we don’t even know about. Source safety also means immunogenicity: when you use bacteria you use them to create a human protein, when you use an animal’s protein you could have immunogenicity reactions. Esempio: problema dei prioni derivati dagli allevamenti. Anche il problema dell’immunogenicità è stato in parte risolto: ci sono comunque problemi di sicurezza virale in qualche caso e di imunogenicità in tutti i casi. Le biotecnologie sono state un’alternativa all’estrazione diretta anche da sistemi pericolosi o non appropriati: ad esempio alcuni ormoni venivano estratti da pool di urine, oppure peptidi derivanti da animali velenosi, ecc. La possibilità di creare proteine ingegnerizzate nuove ha portato a grandi vantaggi anche a livello clinico. Non ci si è più limitati a copiare la natura ma sono state apportate modifiche per ottenere vantaggi specifici. There’s a design engineer to modify the drug and make it better for the patience. tPA: tissue plasmigen activator à the first one was the natural one and then people started to modify the pharmacokinetics to make it better for the patient, so now this is a life-saver. Fusion proteins: you fuse the domains of two proteins. Esempio: nelle insuline modificate sono state introdotte mutazioni in determinati siti (studiati, non casuali) —> un grande studio di design ha portato ad un nuovo prodotto molto efficace. Esempio: tPA (attivatore del plasminogeno tissutale) che è stato modificato per avere una farmacocinetica molto più veloce. 8 Esempio: mAb e fusion protein, che, come tali, non esistono in natura. —> ingegneria proteica accoppiata al drug design per l’ottenimento di nuovi composti. Tutto questo vantaggio e crescita delle biotech si è rivelata un grande booster per l’economia (ci sono state nuove richieste, sono nate nuove aziente, ecc) e per la legislazione. Prepare a presentation considering a brief description of pages contents, including: How it is organized The specificities of the company’s pipeline How it communicates the contents: what type of strategy they use Streghts (if any) of this pipeline Presentation: don’t use more than five slides 5 mins talking and 1 min asking questions MARTEDI 19/11 Consider a salf evaluate of your grup: - Clarity of presentation - Completeness - Consistency of the chosen methods with respect to the reference target - Respect for times - Involments in the presentation - Concretness of obkectives - Internal organization of your group’s work - EMA website - Nel regolatorio ci sono moltissime informazioni condensate in un indice. L’EMA ha sezioni che corrispondono a tutto il ciclo di vita del farmaco dal punto di vista regolatorio: dalla fase pre clinica di ricerca e sviluppo, la parte di AIC, la parte di ritiri dal mercato, ecc. Ci sono parecchi topics in ordine alfabetico: una parte sui biosimilari, una sull’innovazione in medicina, una sul marketing, orphan designation, farmaco vigilanza, ecc. Regulatory Affairs specialist Personale con formazione scientifica (farmaceutica) che formulano le strategie di interazione tra l’azienda e le autorità regolatorie. E’ una figura chiave per l’azienda. Devono sapere i processi di ricerca e sviluppo del farmaco perchè devono riportarle alle autorità regolatore in modo corretto. 9  Compilano tutte le informazioni richieste per la registrazione e approvazione finale. Devono continuare a studiare in quanto le guide regolatorie sono in continuo cambiamento! Acronimi - CHMP : committee for medicinal products fo human use. Commissione dell’EMA che si occupa del regolatorio di tutti farmaci per uso umano, non solo i biologici. E’ la commissione responsabile della preparazioni delle opinioni sulle domande che riguardano i farmaci per uso umano. Le opinioni poi vanno mandate alla commissione europea per poi diventare mandati vincolanti per gli stati membri (approvazione centralizzata dalla commissione europea, non dall’EMA il quale dà solo opinioni). - CPMP : quando l’EMA si chiamava EMEA, il CHMP aveva questo acronimo qua. - COMP : comissione per farmaci orfani. - CDER : persone che si occupano del regolatorio dei farmaci. I biologici intesi come proteine terapeutiche rientrano qua. - CBER: center for biologics evaluation and research. I farmaci che rientrano in questo centro sono i vecchi vaccini, prodotti del siero eccc. 10 TECNICHE DI (BIO)TECNOLOGIE MOLECOLARI DNA CLONING Per ottenere un farmaco biotech bisogna operare sul DNA: prenderne un frammento e clonarlo in un vettore. Vediamo quali sono le parti per ottenere il sistema che produrrà le proteine ricombinanti: 1. Restrizione (taglio) 2. Annealing (appaiamento) 3. Legame Il frammento di DNA di interesse, chiamato cDNA, che codifica solo per gli AA (se è eucariotico non ha gli introni ma solo le triplette che codificano per la proteina), viene isolato. Deve essere inserito in un elemento genetico capace di autoreplicarsi (self replicating genetic agent): generalmente un virus, ma più spesso, nel caso dei farmaci, è un plasmide = vettore di clonazione (cloning vector). Abbiamo quindi 2 DNA: uno che contiene il gene per la proteina, uno per replicarsi e produrre le proteine. Restriction enzymes are enzymes that cut the DNA and also, they cut the plasmid so if you use them to cut both you have cohesive ends. Per ottenere il primo frammento abbiamo il cDNA e il vettore: la cosa più semplice è che entrambi siano stati tagliati con lo stesso enzima di restrizione; dopo di che i frammenti tagliati vengono uniti con un enzima: DNA ligasi. Il cDNA in rosa (frammento con il gene di interesse), tagliato con un enzima di restrizione, ha delle estremità coesive (sticky ends). In nero abbiamo il vettore (plasmide circoalre) che viene tagliato con un enzima di restrizione (= viene linearizzato). Ora entrambi i DNA vengono incubati insieme, nello stesso solvente, alla temperatura corretta, e per la complementarità delle basi si appaiano. Si forma quindi una nuova macromolecola di acidi nucleici in cui abbiamo il gene e il plasmide ospite (vettore). Questa molecola ha un problema dopo l’annealing: tra A del DNA rosa e la base dopo di quello nero ci sono dei buchi! Non si ha quindi un legame covalente: se scaldiamo si riapre. Per risolvere questo problema si opera una reazione enzimatica con la DNA ligasi: enzima purificato che chiude il legame fosfodiestereo. Alla fine otteniamo una nuova molecola: un plasmide che contiene il cDNA = plasmide ricombinante. Vettore di clonazione: contiene il DNA che ci interessa, inserito solitamente in siti specifici: Siti di restrizione: sequenze di basi (4 o più spesso 6) riconosciute dagli enzimi di restrizione e tagliate. Quelli indicati solitamente non sono tutti ma sono quelli unici: ci sono una volta sola e vengono indicati perché sono quelli che servono a linearizzare il frammento (senza spezzettarlo). 11  MCS: multicloning sites in rosa, ovvero siti di restrizione posizionati li da chi ha disegnato il plasmide; servono a clonare il cDNA esattamente li. ORI: in verde, regione del plasmide che permette l’inizio del processo di replicazione. Ap: in blu, spesso lo troviamo anche come BLA. Gene della resistenza all’ampicillina: gene che origina la β-lattamasi (proteina che idrolizza il legame β-lattamico e distruggono l’antibiotico àil batterio cresce anche in presenza dell’antibiotico). È utile perche è un modo per identificare i plasmidi che contengono il cDNA. Ci sono moltissimi altri segnali nei plasmidi: essi sono ingegnerizzati per avere molti segnali che permettono e controllano la replicazione, trasduzione, ecc. Quindi abbiamo promotori, enhancer ecc. Restriction Endonuclease Enzimi di restrizione: enzimi che tagliano il DNA in iti specifici = sequenze sono palindrome. Essi producono delle estremità nette (blunt ends). Quindi quando separiamo il DNA vediamo che il taglio è netto. Le estremità coesive sono prodotte da altri tipi di enzimi: riconoscono una sequenza palindroma e tagliano i filamenti ad x basi di distanza. If you lower the temperature (4°) the two cohesive ends will see each other. NB: Le estremità coesive si riconoscono tra di loro in modo specifico seguendo le leggi di Watson e Crick (appaiamenti più termodinamicamente sensati). 12 The cohesivity is seen because if you have TTAA the perfect combination to have more H bond possible is the AATT so the third strand. The annealing allows to obtain the DNA and now the only thing to do is to remove the gap. Dopo aver ottenuto il plasmide ricombinate dobbiamo inserirlo nella cellula, come? The process of introducing the recombinant DNA in the cell is called transformation (if the cell is a bacteria) or transfection (if the cell is a mammalian). Ci sono vari protocolli che utilizzano cambi di temperatura e sali, altri che usano dei veicoli specifici, ecc. Tutti questi protocolli permettono di rendere la membrana permeabile per introdurre il DNA. Il processo che permette l’entrata del plasmide all’interno della cellula si chiama trasformazione o trasfezione. È diverso da cellula animale a cellula batterica, le condizioni sono molto diverse. à è necessario individuare qual è il clone corretto perché dobbiamo capire quale indurrà la produzione della proteina. Alla fine, quando abbiamo i plasmidi ricombinanti all’interno della cellula ospite abbiamo la possibilità di indurre la traduzione del gene, ottenendo la proteina ricombinante. Formation of a recombinant DNA molecule 1. RE clevage produces dna fragments with cohesive (sticky) ends 2. DNA with sticky ends can be base pair (annealing) 3. Annealed sequences can be covalently linked by enzyme ligase Immagine riassuntiva Parte in alto: inserimento del cDNA nel vettore; inserimento del vettore nella cellula —> riproduzione della cellula e ottenimento di una sospensione. NB: il batterio ha anche il suo cromosoma oltre al plasmide! Parte della sospensione viene messa sulla piastra petri (immagine arancione) che contiene un supporto semisolido, solitamente agar, in cui i batteri possono accrescere e formare colonie sul solido. Selezioniamo poi i batteri ricombinanti introducendo antibiotico e otteniamo colonie (cloni) di cellule ricombinanti, contenenti il gene di nostro interesse (rosa). Tutte le colonie vanno poi rianalizzate una per una perché ci possono essere degli errori in questi passaggi. Una volta trovato la colonia corretta, la ricoltiviamo e induciamo l’espressione della proteina. 13 I grossi passaggi sono quindi due: 1. Ottenimento del plasmide ricombinante; 2. Vedere come si comportano le colonie e qual è quella migliore per l’espressione della proteina. NB: le proteine prodotte non saranno solo quella che vogliamo noi ma anche le altre, però la nostra proteina verrà prodotta in quantità molto maggiori. NB: i plasmidi che servono per clonare e i plasmidi che servono per esprimere quasi sempre sono diversi!! Una volta che abbiamo il nostro gene (cDNA) lo possiamo porre dove vogliamo. Abbiamo quindi plasmidi di clonazione e plasmidi di espressione. Gel electrophoresis of DNA Through agarose or polyacrylamide, they can be used to separate, identify and purify DNA fragments. DNA is a polyanion, will move toward the positive electrode according to its size and shape. To visualize DNA it must be stained (with ethidium bromide) or it must be labelled (fluorescent dyes or radioactivityà the highest the fluorescence the highest the DNA). The sample is put into the wells (pozzetti) and then it migrates from the gel to the way down. Usually, you use a standard to understand the size of your sample. Often, we see more than one band on an electrophoresis. When this happen, it can be because of the size or the shape. Different bands can be also due to different shape, if the DNA is linear will have a different migration than a circular DNA or than a supercoil DNA. What kind of experiments can we do to prove that the DNA is supercoiled? We do restrictionàwe make a restriction, we cut the DNA with a restriction enzyme and then we reload the sample before restriction, the standard, which is linearized, and our sample and we see that if the DNA is supercoiled it will have a different mobility. Also, we can find out the dimension because we can compare our sample with the linearized DNA. It can also happen that everything become a unique bandà all the bands were supercoiled DNA but all of them were the same DNA so once you linearize them, they are all the same DNA. Restriction mapping is a commonly used way to understand the identity of a plasmid. DNA inserts Gli inserti ti DNA possono essere: geni modificati, librerie genomiche, DNA che deriva da una libreria cDNA, un prodotto della PCR, un nuovo gene che può essere assemblato con geni che derivano da diverse sorgenti che vengono poi manipolate con PCR per rendere più semplice la parte di biologia molecolare. cDNA libraries cDNA significa DNA complementare/copia: copia dell’RNA raccolto dalle cellule per ottenere queste librerie. In queste librerie usano RNA raccolti e trascritti dalla cellula in DNA copie. Noi abbiamo una cellula in crescita di cui raccogliamo il materiale genetico: non raccogliamo il DNA ma gli mRNA presenti nella cellula. Questo perché l’mRNA è già stato maturato: in un gene eucariota sono presenti introni (in rosa), esoni (in rosso, zone che hanno codoni che trascrivono) —> è presente molto più DNA di quello che serve per la produzione di una proteina e ci sono molti segnali che non sono rilevanti. 14 La cellula durante la trascrizione trascrive il genoma, si formano trascritti di DNA non maturi con zone celesti (ORF = open reading frames) cioè la parte di cotone che codifica per gli AA) e zone gialle (zone che corrispondono agli introni). La cellula è capace di escludere dal trascritto primario del DNA gli introni per ottenere un RNA maturo (mRNA) con un metodo chiamato RNA Slpicing L’mRNA, come tutti gli RNA, è fragile e facilmente idrolizzabile sia dall’acqua he da altri nucleofili, per questo motivo non è utile avere librerie di RNAàper ottenere una libreria di cDNA si raccolgono dalle cellule gli mRNA e si ritrasformano in DNA (cDNA clones) in quanto sono più stabili e possono essere conservati più a lungo (anche come pellet, liofilzzati). The instability is the main concern, but they are so powerful because they contain the massage. So sometimes some people transform the mRNA in double strand DNA. Come trasformiamo mRNA nel cDNA? Con la Reverse Transcription ad opera della trascrittasi inversa / retrotrascrittasi. L’mRNA viene riconosciuto e copiato in DNA a doppia elica da questo enzima. Questi cDNA ottenuti verranno poi inseriti nei plasmidi ricombinanti. NB: ogni clone di cDNA corrisponde a geni maturati che in quel momento sono trascritti nella cellula, e siccome la trascrizione di particolari geni non è uguale per tutte le cellule ma dipende dalla cellula, dal tempo di raccolta della cellula ecc, le librerie di cDNA sono diverse in base al tipo di linea cellulare utilizzata. Quando vogliamo ottenere una certa proteina per usarla come farmaco, dobbiamo essere sicuri che il DNA che ci interessa sia presente nella libreria utilizzata. Reverse Transcription Utilizzando la trascrittasi inversa (retrotrascrittasi) copiamo un RNA in un DNA a doppia elica. Il flusso di attività può cambiare dal tipo di trascrittasi inversa che si utilizza ma fondamentalmente è uguale per tutti: 1. Raccolta del mRNA: uno dei metodi più facili è sfruttare la coda di poli-A che si ha alla fine di ogni mRNA eucariota. Possiamo anche utilizzare un oligonucleotide breve a DNA (timine) che abbia la stessa sequenza complementare del poli-A e che quindi si appai e che permetta all’enzima di attaccarsi a 3’ e polimerizzare. Quello che otteniamo dalla prima attività di polimerizzazione è una prima doppia elica formata dall’mRNA (in blu) e il DNA nuovo (in rosa) —> ibrido. Esempio: nell’HIV la trascrittasi inversa del virus dopo aver copiato il DNA è capace di idrolizzalo con RNAsi-H per ottenere un singolo filamento di DNA. 15 2. Si degrada l’RNA con soluzione alcalina (è labile e molto sensibile all’alcalinità: se posto in soluzione a pH 9-10 si degrada molto in fretta) A questo punto abbiamo un primo filamento di DNA e per ottenerne due possiamo utilizzare la stessa trascrittasi inversa (oppure altre polimerasi): o si utilizza un hairpin loop oppure si utilizza un altro primer. Alla fine, in qualunque caso, dopo la degradazione dell’RNA otteniamo un singolo filamento di DNA che viene copiato in DNA a doppia catena, il quale può essere manipolato. https://www.youtube.com/watch?v=0MJIbrS4fbQ La prima attività di RT è la copiatura dell’RNA in DNA: questo non è banale perchè RNA ha una serie di folding e strutture molto stabili che a temperatura ambiente possono bloccare le polimerasi, per questo spesso si utilizzano temperature maggiori. NB: la trascrittasi inversa non serve solo a formare librerie di cDNA ma può entrare anche in protocolli di RT-PCR: trascrittasi inversa accoppiata alla PCR, tecnica utile per copiare il genoma RNA di un virus per capire se è nel campione biologico, amplificarlo e quantificarlo —> capacità di sequenziamento. In vitro RNA transcription DNA copied into RNA: può essere effettuato anche in vitro con enzimi diversi rispetto al vivo. DNA sequencing Enzymatic Method - Metodo di Sanger Protocolli che utilizzano polimerasi per conoscere la sequenza di un certo substrato di DNA. Si sfrutta la presenza di una molecola di ssDNA (singola catena, denaturato) di cui vogliamo conoscere la sequenza; si utilizza poi un primer (15-20 basi) capace di appaiare una determinata sequenza di DNA e in presenza di una polimerasi specifica e di una miscela dei 4 deossiribonucleosidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), comincerà a copiare il substrato a 37°C circa (a partire dal 3’ del primer). Il principio di Sanger è che oltre ai deossiribonucleosidi normali che costituiscono il buffer, inseriamo anche una piccola quantità di uno dei nucleotidi ma modificati: un dideossiribonucleoside (ddTTP), nucleosidi apparentemente normali ma a cui manca l’OH in posizione 3’, cioè quello che di solito fa da raccordo con il resto della molecola di DNA. Quando questi dideossi vengono riconosciuti dalla polimerasi e introdotti nella catena portano alla terminazione dell’attività polimerasica perchè manca OH per formare il legame fosfodiestereo. Durante la polimerizzazione in queste reazioni tipiche del sequenziamento abbiamo la rara incorporazione di uno dei dideossi che bloccano l’ulteriore crescita della molecola di DNA. 16 Questa terminazione è voluta! Protocollo Si prende il DNA a doppia catena, si denatura e otteniamo ssDNA; a questo punto nel tubo di reazione aggiungiamo una miscela con il primer (label in giallo; normalmente non viene visto a meno che non venga legato ad un composto fluorescente o radioattivo per esempio). Il primer appaia, inseriamo i dNTPs in eccesso, inseriamo DNA polimerasi e dopo di che dividiamo la miscela in 4 tubi diversi e in ognuno inseriamo una piccola quantità di ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP. Otteniamo quindi filamenti di lunghezze diverse per ogni tubo di reazione. Dopo di che separiamo le miscele in un gel di acirlammide o in altri sistemi e andiamo ad osservare dove sono le bande. Questo è un gel di acrilammide denaturante (in grigio): osserviamo le bande (perchè il primer è marcato) che corrispondono ai frammenti via via più lunghi e per ogni banda corrisponde una sequenza che termina con una base (A, T, C, G) —> riusciamo a leggere la sequenza (in verde). 18/11/24 PCR - Polymerase Chain Reaction Reazione polimerasica che copia DNA in DNA e permette l’amplificazione di miliari di volte di una sequenza di DNA specifica. Quello che dobbiamo conoscere non è tutta la sequenza del DNA, ma almeno la sequenza delle estremità del DNA per poter permettere le classiche reazioni di polimerizzazione (appaiamento dei primer che definiscono la zona di DNA da amplificare). 17 1. First cycle - Denaturazione: si denatura il DNA scaldando la soluzione che lo contiene: si separano i filamenti (templati da copiare). - Annealing: si aggiungono i primer definiti (o sono già presenti nella miscela di reazione) per l’annealing (appaiamento) abbassando la temperatura (40-60°C, se minore si appaiano anche dove non dovrebbero). - Estensione: copia del filamento di DNA; in questo caso si utilizzano DNA polimerasi termostabili (che funzionano a 72°C, non vengono denaturate). in the first cycle you really have not much DNA, then, at the end of the cycle, you get a lot of amplified DNAS. The three steps of the PCR are the most important, we have to learn about these. If you change the conditions of the PCR, you can get different results: from a little amplification to a big amplification. The big discovery was an enzyme that can work at 72° C and is stable at that temperature so it doesn’t denature when we boil. Dopo il primo passaggio otterremo di ogni substrato 1 sola copia, se continuiamo con i cicli di denaturazione, annealing ed estensione otteniamo grandi quantità del frammento di DNA. Di cosa abbiamo bisogno? - Original target DNA (few copies): templato/substrato da copiare; - 2 synhetic primers: oligoniucleotidi a DNA definiti; - dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): mattoncini per copiare il DNA; - Taq polymerase (thermostable DNA polymerase); - Total volume of reaction: 25-100 µL o minore. Gel di agarosio (figura a dx): 4 PCR sullo stesso templato fatte in condizioni diverse; il DNA originale non lo vediamo mai nel gel (ultimo pozzetto a dx dopo banda grande) e in base alla quantità generata lo vediamo di più o di meno (bande più intense o meno intense). Esercizio: Look carefully at the sequence in the projected slide, and identify the sequences of two primers to do a PCR amplification; the amplified PCR must correspond to DNA from position 2533 till 2757 (indicandoli da 5’ a 3’, come per convenzione). Lunghezza del frammento: 225 nucleotidi (non coppie di basi perchè è un singolo filamento). Si fa la differenza (2757-2533) + 1 = 2757-2533 =224 + 1=225 18 Per calcolare il PM medio si moltiplica il numero di nucleotidi per 33 (se si ha un doppio filamento si moltiplica il numero di bp per 66). Primer A corretto: 3’ GGA TCC AGA CAT GAT 5’ Primer B corretto: 3’ CCA CAT TTG TAG AGG 5’ La sequenza del primer A, in giallo, corrisponde Quindi poi bisogna invertire le sequenze per avere il primer a quella del primer, mentre quella del primer B è corretto la fine dell’amplificato, quindi quando denaturiamo il templato l’altro filamento avrà la sequenza complementare GGA GAT GTT TAC ACC da 3’ a 5’ ! Quindi per scriverlo correttamente da 5’ a 3’ dobbiamo invertirlo. Il primer A, invece, ha la sequenza che coincide con la sequenza del templato in quanto si appaia al filamento opposto. Come lo abbiamo scritto noi il primer si appaia da destra a sinistra MA amplifica dalla parte opposta! Dobbiamo stare attenti alla polarità che siamo al primer. The primers of the PCR are used, they’re not recycled. It’s wrong to think that the amplification happens from a primer to another primer, they’re included in the amplification. The starting of the amplified sequence is part of the primer, it becomes part of the template. The start primer cannot star before the beginning of the amplification. il primer A copierà l’altro filamento, per questo la sequenza è GGA TCC AGA CAT GAT; la copiatura va da 5’ a 3’ sempre. Si può cambiare il primer per poter inserire delle mutazioni, ad esempio cambiare le triplette. Esistono dei protocolli di PCR con sequenze che non appaiano al templato: al 5’ possiamo mettere quello che vogliamo come siti di restrizione nuovi, promotori della trascrizione, segnali di tutti i tipi che possono essere utilizzati per formare poi geni di fusione, ecc, allungando il primer e inserendo le sequenze che interessano a noi, che faranno poi parte del templato finale. The melting temperature is important for the annealing phase. If the Tm is too low the annealing will happen everywhere, but if the temperature is too high the annealing won’t happen anywhere. NB: se il templato è circolare possiamo amplificare in entrambi i lati, se invece è lineare, se andiamo nella direzione opposta (verso l’esterno) non possiamo più amplificare in maniera esponenziale perché il frammento è troppo grande. Il fatto di avere sequenze molto stabili nel templato o proteine fortemente legate al DNA può essere un problema perché la polimerasi incontra ostacoli. La situazione ideale è di amplificare un frammento semplice con delle estremità ben definite, decise da noi. If you put primer in excess you can have a faster migration and you can see it on an sds page. 19  Quando abbiamo un DNA da copiare è un double stranded: abbiamo due filamenti, uno 5’3’ e uno 3’5’; i due primer appaiano uno per filamento e avranno polarità opposta. Nel primo ciclo di amplificazione il DNA copiato va oltre al “confine” che abbiamo stabilito noi, ma quando abbiamo ottenuto l’amplificato, esso a sua volta diventa templato dei primer —> dal secondo ciclo si ottengono i frammenti con le estremità desiderate. Mano a mano che ripetiamo le amplificazioni, il templato reale non è più il DNA originale (presente in piccolissima copia) ma l’amplificato stesso. Questo è quello che vediamo dalla telecamera: un fondo nero con delle bande fluorescenti, le quali rappresentano il DNA legato a dei fluorofori (veniva spesso utilizzato etidio bromuro). Per stampare il gel abbiamo fare il negativo dell’immagine e otteniamo uno sondo bianco con bande nere. Abbiamo degli aloni bianchi che corrispondono ai pozzetti del gel, dove carichiamo il campione. Tra i pozzetti e le bande ci sono delle ombre bianche che sono i coloranti che mettiamo nel gel per vedere come procede la corsa (traccianti). Sotto alle bande nere ci sono delle altre bande molto meno intense. Queste bande più veloci e poco intense, cosa potrebbero essere? Potrebbero essere i dNTPs che non sono stati incorporati, ma sono troppo piccoli quindi molto veloci, e tendono ad uscire dal gel. Se andiamo a marcali possiamo vedere dove sono. Potrebbero essere i primer: sono in eccesso, sono carichi negativamente, sono piccoli e più veloci dell’amplificato, e allora perchè sono così poco intense e definite le bande? Perché le maglie del gel sono abbastanza strette ma la dimensione dei primer è simile ad esse—> tendono a diffondere. Il fatto che siano poco fluorescenti e che sembrino meno di quello che sono in realtà è dovuto al fatto che per questa colorazione è stato utilizzato l’etidio bromuro: i primer sono a singola catena e l’etidio è un intercalante del DNA duplex! La resa quantica di fluorescenza dell’intercalante con il DNA a singola catena (il primer) è molto bassa. In DNA gel you load your sample with something that makes it more viscous like glycerin and then you add a tracer that migrates with the sample in the gel, so you can see if the sample migrates too much. 20  Serial DNA Cloning La PCR serve a risolvere un sacco di problemi di clonazione: possiamo clonare un cDNA monoamplificato, possiamo fare dei pezzettini di DNA nuovi che vengono usati come raccordo tra frammenti diversi, ecc. Esempio: vogliamo unire il gene blu e il gene verde per crearne uno nuovo di fusione ma abbiamo le estremità non coesive , oppure vogliamo aggiungere un terzo gene (in rosso): i pezzi possono essere in parte frammenti di DNA in parte amplificati della PCR. Esempio: Enbrel (Etanercept) una proteina di fusione messa a punto unendo due geni diversi; per fare questo hanno fatto una PCR per creare un raccordo tra i geni che volevano unire. Il serial DNA cloning viene utilizzato per introdurre siti di restrizione utili, mutazioni sito-specifiche, segnali che non necessariamente fanno parte del gene ma possono essere utili alla cellula per fare delle cose specifiche (spesso sono promotori per RNA polimerasi, segnali che possono dirigere una proteina in un certo compartimento come segnali di secrezione, ecc.) Eternacept: is a fusion protein and a successfully designed drug. For many years it was a blockbuster drug. It’s an antibody, but it’s considered a protein, not an antibody. 19/11/24 Eternacept was invented by a super small biotech company and then it was bought by bigger companies. Successful compounds come from small but big ideas. It’s a fusion protein by the FC domain of an antibody and the extracellular domain of TNF-receptor (to bind TNF) then it was dimerized with the FC domain of an antibody. The domain that actually binds the TNF is the extracellular domain of TNFr. FC domain has a possibility of finding another one and dimerized, cause usually it is a monomer. The idea of TNF receptor binding TNF a and b was to have a monomeric drug, but the dimer was much more efficient in binding TNF-a. The key point behind the design of Etanercept was how to dimerize it, indeed. They decided to dimerize it because it was more effective. They made the monomer; they tested it and then they tried to make it better. How we dimerize a protein? You have many ways to make a dimer, you can use a sulfide bond exploiting the Cys or you can make a linker that is able to join the two molecules and be covalent. The very much good idea was to exploit the immunoglobulin which evolved to dimerize with appropriate Cys in such a way that it doesn’t bother the function of the FC domain. The design of receptor is actually the design of the monomer. At the end of the production of the protein, the cell secretes not the monomer but the dimer. à how did they make the DNA to this new protein? 21 It’s written in the patents and they tell you how to do it. Two plasmids: one that contains the FC domain and one that contains the TNFr extracellular domain which is the one that actually makes the binding. You take the plasmids, you grow them, you purify them and then you cut your DNA from the two plasmids and then you put them together into another new plasmid, this one is the recombinant plasmid that contains the two domains fuse together, in frame. In frame means the one that corresponds to the correct order of the codon. When you make ligation, you have to respect the codon cause otherwise the reading of the sequence is completely wrong. In this way you have to respect the frame, the codon. You have to make the ligation in a way that you don’t have cohesive ends where they meet, they don’t have to join each other, otherwise if you join them together, they make a mistake, because in that point there will be another amino acid. How to solve this problem? You use the PCR. They make a PCR linker; with PCR you can make pieces that resolve the problem with cohesive ends. The problem that we have seen was solved by making linker for ligation of the TNFr 3’ end and Igg-1 5’ end using PCR. They work on the template. They basically want to amplify the template. They made primers that are complementary to the 5’ end of the human IgG1. We have two primers of the IgG1. Primer 1 is a piece of DNA, the grey part, but the black part is not complementary to the first template of IgG, it’ complementary to the of the receptor for TNFa. The black part of the primer is the one that will anneal to the TNFr, but it’s not a template. Primer 1 is 15 bs + something else, is much bigger than the first primer. The two primers are very diverse in the end. What happens then when you have two primer that are very different? In the first cycle, the black part will also be amplified, and so in the other cycles. In the end my amplified DNA will be the primer2 and the rest will be part of the sequence of the receptor and part of the sequence of the immunoglobulin which is IgG 1. With PCR you can amplify something that is not on the template, but they still will be produced. The first primer will amplify something that ends at the end of the thing added. You will amplify what’s in the primer even if it has no complementary sequence. In the end the amplified DNA will be the primer 2, the part in between the two primers, the part of the first primer and the other part of the first primer. Everything that is in the primer will be read and also cloned. 22 When you’re cloning usually you do a cut and paste of the DNA and then you put it on a blue script which is a small plasmid. It’s a plasmid made for bacteria cells. If you want to make a plasmid for a mammalian cell you have to do something different, you need to have a proper plasmid that will replicate in mammalian cells. Most of proteins that we use and know are expressed in mammalian cells. 20/11/24 Inside the cells there’s a particular mechanism that allows to produce high quantity of the protein of our interest. All drugs that we use are used as tools in pharmacology, biochemistry ext. Because each one of them has a particular characteristic that can be interesting. Production of recombinant proteins Quello che alla fine utilizziamo per la produzione di proteine ricombinanti è un plasmide di espressione, cioè quello che una volta all’interno della cella dà origine al DNA e alla proteina che verrà sovraespressa. We have a promoter which is the one that guides the transcription. There are some promoters that allows the transcription only after particular signs. 23 Guidelines and regulations I biologici e i biosimilari sono altamente regolati e hanno dei regolamenti diversi dalle small molecules (in quanto sono prodotti differenti). Monografia su recombinant DNA technology - Farmacopea Europea Si parla di manufacture and control (articolo) —> come si fanno a livello industriale e il controllo analitico (numero di test molto elevato rispetto alle small molecules): controllo del prodotto finito che deriva da DNA ricombinante. Questa monografia è divisa in varie sezioni. —> la purificazione industriale è un processo molto complesso. Once you have produced your system a lot of testing must be done. The part in which this is explained it’s not in the images above. Production Dal punto di vista generale la produzione industriale di un prodotto da DNA ricombinate è basata su un sistema seed-lot (quando iniziamo la produzione il sistema ospite-vettore validato serve come seme / inizio per la produzione di un particolare lotto di quella proteina —> seed-lot system è quello che inizia la produzione industriale). 24 Esempio: quando dobbiamo coltivare dei batteri, prendiamo una piccola quantità di cellule di una colonia e le seminiamo su un’altra piastra o in vitro. Indicazioni su quello che va fatto per caratterizzare il vettore di espressione e la cellula ospite. Infatti dall’host-vector combination al seed-lot system ci sono le cell banks : - Master Cell Bank - Working Cell Bank Tutte le banche cellular come il modo in cui sono state ottenute, mantenute e coltivate, vanno a descritte in dettaglio per ottenere le approvazioni. Quello che chiede la farmaopea per fare gli host-vector combination system è il clonaggio e la scegli dell’ospite. NB: il clonaggio è quello che produce il gene (DNA con PCR, cDNA, sintesi chimica del DNA), il quale viene poi inserito nei multiple cloning sites, ecc. Le variabili scritte in basso sono utili per scegliere qual è il sistema più adatto. - Selection markers - Origin of replication - Promoter - Tags (affinity, solubilisation and targeting) Host strain = ceppo dell’ospite, quale battere, come è stato modificato, quali sono i marker tipici, ecc. E.coli utilizzati sono cellule altamente ingegnerizzate con tanti sistemi che favoriscono e permettono il cloning. —> chi mette appunto questi sistemi ha un’ampia possibilità di scelta. Once you made it you have it forever and then every time you have to start a production you take the cell that you already have. Expression vector and host cell à il sistema della cellula ospite, il pool of transformed/transfected cells (tutte le colonie da cui il clone deriva) va tutto documentato in quanto l’ente regolatorio richiede moltissime informazioni (dati, grafici, ecc). You need to create a proper document for these bacteria. The identity of the protein depends a lot on the identity of the living material that you are using. Everything must be recorded in the correct order cause if anything goes wrong you at least know where the mistake might have been. 25  —> da dove arriva la cellula ospite, che storia ha (modifiche effettuate), che storia hanno i vettori di espressione ecc. —> la suitability del sistema ospite vettore va caratterizzata e dimostrata! All steps need to be well done by protocols and then you have to check every single step and document it. Oltre alla farmacopea ci sono delle altre linee guida che riprendono le stesse informazioni, una interessante si trova nel sito dell’EMA: si ha una sessione che parla delle sostanze attive. Manufacture, characterization and control of the active substance 25/11 - Guidelines - ICH: linea guida di qualità all’interno dell’EMA e la prima è dedicata all’analisi del costrutto di espressione usato per la produzione di prodotti proteici derivanti da DNA ricombinante. ICHàInternational Conference on Harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. This organization produces many documents about registration and realization of different drugs. There’s a council that brings together regulatory authorities and pharmaceutical industries, so the people that regulate and the people that produces. The fact that it’s a global association means that it’s reliable. They have Quality guidelines (Q). in the pharmaceutical industries there aren’t only biotech drugs. There are also Safety guidelines, efficacy guidelines and … Most of these guidelines are continuously updated. The EMA has acquired the guidelines of ICH. Vedi slide con documenti à 1. Introduction If you know the techniques you know how to use them and also you know their limits, because every technique has some limitations. The expression vector and the protein are fundamental. II. Rationale for Analysis of the expression Construct During cloning something can go wrong, like in PCR if we use Taq this is not very reliable, so some mistakes can be made. We know that even DNA polymerase in our cells can make mistakes, in other situations or in other living organisms can happen as well. How: nucleic acid analysis can be done in many ways. The makers have to do that, every production system has to be validated. III. characterization of expression system When you transform your cell and you plate them you will have many clones, which one will you pick? What are the criteria you use to select them? The criteria depend on what you’re doing, but you have to describe them. 26 Master Cell Bank: la proteina non c’è, ma c’è tutto ciò che serve a produrla! Una volta fatto, scelto, caratterizzato e validato il sistema per produrre una certa proteina, viene consolidato in banche cellulari e il produttore non lo rifa più. Cell banks —> cellule che derivano dal clone originale. Tutte queste cellule vengono poi messe in varie aliquote in dei tubi tenuti poi in posti diversi e sicuri (bassa temperatura): non abbiamo un unico tubo con la master cell bank perché se succede qualcosa perdiamo tutto! È quindi un modo per moltiplicare il sistema ospite vettore e averlo per tutto il tempo di produzione della proteina stessa. Quando parliamo di banche cellulari non parliamo solo di queste, ne esiste un’altro tipo: —> sospensione omogenea di cellule che derivano dalla MCB (non più dall’ospite- vettore iniziale) mantenute nello stesso modo. Abbiamo il plasmide, transfettiamo e otteniamo il clone, espandiamo le cellule ed eseguiamo il controllo qualità. Ripartiamo le cellule in diversi tubi: ognuno di questi contiene le copie del clone iniziale —> MCB. Per ognuno dei tubi possiamo espandere nuovamente le cellule —> WCB (utilizzate per la produzione). UPSTREAM PROCESSING DOWNSTREAM PROCESSING 27  —> caratterizzazione e analisi sono due componenti critiche del controllo del prodotto finito. —> banche cellulari batteriche (procariotiche) e di lieviti (sono eucarioti, ma hanno caratteristiche di produzione che li accomunano di più ai batteri che ai mammiferi). Yest cells are eukaryote cells. In many ways yeast and animal cells bank have a nucleos. Yeast are simple eucaryotes we can say. —> cellule animali intese come di mammiferi (spesso roditori ma possono anche essere umani) possono essere contaminate da micoplasmi o virus! The contaminants that you find when you use eucaryote cells are different than the ones you find in procaryotic and yest cells. Procaryotic cells have virus like Fagi, but these viruses can’t affect eucaryotic cells. Another important difference is about the post-translation modifications and in particular the glycosylation. You can’t obtain a glycosylated protein with a procaryotic cell, you must use yeast or a mammalian cell. This is important also for the environment in which your protein is made. Inside the cell bacteria cells are different from mammalian cells, slightly, but they’re different so the folding might not be the same. The folding might not be the correct one. The distinction is made by possible contaminants. What type of living cell will be used to express my protein drug (biologic)? 28 Production of Biotech drugs Il sistema di espressione è importante ed è specifico per la cellula che utilizziamo per la produzione delle proteine: abbiamo un sistema di espressione adatto con tutti i segnali corretti per dirigere trasfezione ecc (non necessariamente i sistemi per i mammiferi vanno bene anche per i batteri). Quali sono i criteri di scelta di una cellula batterica o di mammifero per ottenere una proteina? What concerns we might have? The complexity of the conformation; the size of the protein and what we want form/in the protein. Esempio: non possiamo esprimere una proteina con delle modifiche post traduzionali in una cellula batterica, in quanto i batteri non sono in grado di eseguire quelle modifiche. I criteri di scelta sono diversi e dipendono dalla proteina e da: - Lunghezza del gene che codifica per la proteina, quindi anche la lunghezza della proteina stessa. Il fatto di avere proteine di dimensioni diverse comporta limitazioni per alcuni tipi di cellule: i monoclonali interi, ad esempio, sono molto pesanti come proteine, non possono essere prodotti in batteri in quanto si ha un problema di difficoltà di processazione del DNA. - Quantità di proteina che si vuole ottenere: nei procarioti la replicazione è molto più veloce e si possono ottenere rese molto maggiori. - Raccolta: questa può essere importante perchè la proteina può essere trovata / raccolta diversamente: per il batterio è dentro, nelle cellule di mammifero è fuori. Questo fa si che le tecniche di raccolta e la purezza della proteina raccolta siano diverse. Esempio: e dobbiamo tirare fuori una proteina da dentro al battere: lisiamo la proteina ed esce tutto, compresi i contaminanti. Se noi mettiamo una proteina all’interno di un sistema vivente, sono presenti enzimi proteolitici: la lisi cellulare del batterio può dare origine a condizioni pericolose in quanto la proteina è esposta a diverse proteasi. Choice of expression system for the protein drug - Procarioti (batteri) - Eucatioti (lieviti o cellule di mammifero in colture): cellule di criceto cinese, ma anche cellule umane Non sono le uniche due linee utilizzabili! Potremo utilizzare anche cellule di piante, di insetto, ecc. Per quello che riguarda la produzione di proteine terapeutiche si utilizzano batteri, lieviti o mammiferi in quanto gli altri tipi di cellule hanno caratteristiche che li rendono meno adatti o potenzialmente immunogenici. 29 Bacteria and yest are very fast and they give lots of proteins in a very short time. Mammalian cells are lazier, so they give way less proteins in the same time. The defining point of the downstream and the upstream process is the harvest which is the term used to define the collection of the cells to end the upstream process and start the downstream one. In bacteria, unless you engineer them, the protein is inside and so you have to lyse the bacteria cell and this process is a messy one, you have more molecules to be discarded. What could be harmful to the protein during this process? Proteases, the proteases of the bacteria proteins could cut our protein. The bacteria are engineered to have a lower number of proteases, so they won’t harm our protein. In our organism we have a way to secrete proteins outside the cells, indeed we have many proteins circulate in the blood. Using mammalian cells can be helpful cause they have a way to secrete proteins outside the cell. If the human protein expressed in bacteria doesn’t fold correctly in the bacteria? We denature the protein and then we try to renature in the correct environment hoping she folds correctly. If the protein will not renature, we have to move away from bacteria and choose eukaryote. We always have to check if the conformation is okay. Expression system NB: i batteri hanno una limitazione sul PM della proteina da esprimere NB: la proteina a mano a mano che viene sintetizzata tende ad assumere una certa conformazione che dipende dalla sequenza, dall’ambiente, dalla presenza di altre proteine che assistono il folding ecc. In qualche caso proteine umane prodotte in cellule batteriche non si trovano nelle condizioni adatte a raggiungere il corretto folding. Il problema non è insormontabile: nel caso la proteina non fosse correttamente foldata e non avesse l’attività corretta è necessario operare la rinaturazione in condizioni native. NB: alcune proteine non riescono a rinaturarsi correttamente —> devo cambiare il sistema di espressione. 30 La denaturazione in sé ha anche delle possibilità buone: quando abbiamo una proteina misfolded nei batteri prima di buttarla possiamo denaturarla ancora di più in modo tale che perda la conformazione sbagliata; dopo di che possiamo provare rinaturarla! NB: un’altra caratteristica dell’ospite che esprime la proteina è la presenza di agenti contaminanti che dipendono dall’ospite che utilizziamo: ad esempio i virus possono essere presenti nella cellula di mammifero e sono quindi possibili contaminant; i pirogeni, endotossine batteriche, possono essere presenti in sistemi di espressione procarioti. 26/11 We have to be careful with the sugar that is chosen for glycosylation, because they might provoke immunogenicity. Protein expression in E. coli Esistono tante review sulla produzione di proteine ricombinanti all’interno di cellule batteriche: la produzione industriale è essenziale per la scoperta e sviluppo di farmaci ma può avere dei problemi. Glicosilazione La glicosilazione è un processo post- traduzionale fondamentale. I batteri non riescono a fare questa modifica —> non creano glicoproteine, mentre gli eucarioti si. With one protein with different glycan attached to it we can have many different variations of the protein. Dal punto di vista della produzione dobbiamo tenere conto di questa cosa. Da un segmento di DNA genomico, la natura riesce a diversificare la proteina creata in molte varianti dove la differenza sta nella catena zuccherina: potendo attaccare catene zuccherine anche complesse in determinati siti delle proteine, aumenta l’eterogeneità e cambia la funzionalità della proteina stessa (regolazione più fine dell’attività della proteina) NB: l’errore in questa figura sta nel fatto che il messenger non è DNA ma RNA! 31