Sbobine di Biotecnologie - Ciclo Cellulare e Mitosi PDF

9/12 CICLO CELLULARE EUCARIOTICO Nei procarioti si parla di scissione binaria, la quale ha una durata di circa 20-30 min in condizioni ambientali favorevoli (temperatura, mezzo nutritivo, assenza di specie in competizione). Negli eucarioti è un processo più complesso: il ciclo cellulare inizia quando la cellula viene generata per divisione di una cellula preesistente (G1), per arrivare ad una fase di sintesi in cui la cellula duplica il proprio DNA (S) → tra la fase S e M, in cui viene ripartito il DNA duplicato nelle due cellule figlie, ci può essere una fase G2, fase di intervallo (G= Gap). Per quanto concerne la durata, se il batterio procariote in 30 min riusciva a concludere la duplicazione, solo per terminare la fase S sono invece necessarie 7,8 o 9 ore. - La fase M, cioè la mitosi, suddivisa in mitosi e citodieresi o citocinesi, è l’intervallo più breve → in meno di un’ora si conclude. -La fase G1 è la più variabile a livello temporale: può durare ore, giorni, anni → ci sono delle cellule che arrestano la progressione nel ciclo (neuroni, fibre muscolari) le quali non replicano il DNA ma vivono la loro vita nella fase G0, sottofase della G1, fuoriuscita dal ciclo. Tutto tranne la fase M è detta interfase, data dalla fase S preceduta o seguita da intervalli. I principali checkpoint sono in G1 e in G2, fasi biosinteticamente molto attive (come la transizione G2-M) → meccanismi di verifica dei parametri per la progressione nel ciclo cellulare. Se risultano non funzionanti, ne esistono tanti altri a garantire la solidità. Ci sono però cellule (tumorali…) in cui i checkpoint non funzionano al meglio→ nonostante il malfunzionamento dei parametri si duplica comunque il DNA e la cellula si divide. Quello dei checkpoint è un meccanismo altamente conservato, per cui gli scienziati Hartwell, Nurse e Hunt vinsero il premio Nobel in seguito allo studio di cellule eucariote come la Saccharomyces cerevisiae, le CDK (chinasi-ciclica dipendenti) e le cicline. 9/12 MITOSI La mitosi si suddivide in mitosi “propriamente detta”, la quale riguarda gli eventi della ripartizione fra le due copie del genoma, e in citodieresi, che riguarda la ripartizione degli organuli. La mitosi è a sua volta divisa in sotto fasi (profase, prometafase, metafase, anafase, telofase), alla fine delle quali inizia la citodieresi. Nella profase la cromatina si condensa → la cellula blocca qualsiasi evento trascrizionale e traduzionale per segregare le due copie del genoma prodotte in fase S (tante molecole lineari strettamente associate a proteine). Le molecole diventano visibili, mentre il nucleolo, evidente nel nucleo interfasico, ora scompare. Durante l’interfase, il centrosoma, dato da una coppia di centrioli (uno perpendicolare all’altro) si duplica (avviene prima della profase). Si forma il fuso mitotico, costituito da microtubuli usati per separare i cromatidi fratelli → i microtubuli si organizzano a livello di MTOC, organizzatori di microtubuli, in questo caso rappresentato dal centrosoma → le due coppie di centrioli si separano → a livello di ciascuna coppia di centrioli cominciano a polimerizzare i microtubuli che si allontanano dal centrosoma con la loro estremità +. Ci sono cellule come i fibroblasti che durante la duplicazione perdono la loro forma e diventano più tondeggianti → il cambiamento di morfologia (non più appiattita) è il risultato della nuova organizzazione citoscheletrica. Le due coppie di centrioli divengono i poli del fuso, da cui si organizzano le diverse fibre del fuso, che sono di tre tipi diversi: verdi, rosse e blu. 9/12 Verdi → dell’aster: non prendono contatto con cromosomi, sono le più corte e dinamiche (si accorciano e si allungano), vanno dal centrosoma verso la membrana plasmatica: il loro ruolo è quello di ancorarsi alla membrana plasmatica facilitando la stabilità; Rosse: si agganciano a livello del centromero sul cromosoma dove vi è, da entrambe le parti, una placca proteica detta placca del cinetocore, zona in cui i microtubuli (del cinetocore) si attaccano a ciascun cromatidio fratello. Blu → microtubuli polari: le più lunghe, non prendono contatto con i cromosomi, ma vanno ad incontrarsi con microtubuli polari provenienti dal polo opposto. In anafase B, contestualmente all’accorciamento dei microtubuli del cinetocore, si ha uno slittamento dei microtubuli polari che si allontanano l’uno dall’altro facilitando l’allontanamento dei due poli del fuso dove arrivano i cromatidi. Nelle cellule animali, in profase, l’involucro nucleare comincia a disgregarsi → le fibre del fuso possono così agganciare i cromosomi visibili e condensati a livello di quello che era il nucleo, ora tutt'uno col citoplasma. Via via che il fuso si forma, i cromosomi vengono correttamente agganciati: fasi iniziali della metafase, in cui si entra quando i cromosomi (2 cromatidi fratelli, una la copia dell’altro, uniti al centromero) sono allineati all’equatore del fuso in piastra metafasica. A garantire l’importanza del fuso c’è un punto che, grazie ad importanti enzimi, regola la transizione tra metafase e anafase → checkpoint SAC. Superato questo, si entra in anafase, una sottofase rapida dove i cromatidi si separano perché i microtubuli del cinetocore si accorciano. Tale sottofase può essere suddivisa ancora in anafase A e B: nella prima avviene la separazione dei cromatidi fratelli, nella seconda si allontanano ulteriormente i due poli per allungamento dei microtubuli polari. Tutto ciò ovviamente grazie alle diverse isoforme che permettono l'accorciamento, lo scorrimento e l’allungamento dei microtubuli. Nella telofase, ultima sottofase, la cromatina si decondensa, l’involucro nucleare si riforma, tornano ad essere visibili i nucleoli e il fuso comincia ad disorganizzarsi. Rimangono dei residui dei microtubuli del fuso, in genere all’equatore del fuso, i quali indicano all’anello contrattile, responsabile della separazione della cellula, dove formarsi. Non è ancora finita la telofase che inizia la citodieresi: negli animali prevede la formazione di un solco di actina e miosina che si contrae strozzando la cellula in due cellule figlie. Questo anello non avrebbe potenza invece in una cellula vegetale, poiché dotata di parete rigida 11/12 11/12/22024 Recap della lezione precedente In tutti i viventi l’evento di replicazione del DNA e duplicazione deve necessariamente precedere la ripartizione delle due copie prima della divisione cellulare. La fase M e S sono obbligatorie. Per un organismo unicellulare dividere la cellula è più semplice. Per un organismo pluricellulare vi sono diverse mitosi da compiere. → Prima che la cellula possa dividersi deve accrescersi, con la G1 e la G2. È una fase di preparazione. N.B La divisione cellulare non va confusa con la crescita. →con il termine crescita si intende l’aumento del volume attraverso: trascrizione, traduzione, aumento numero di organuli. →con l’espressione “la cellula prolifera”si intende la divisione cellulare. MECCANISMI DI REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE Essi regolano la vita dei viventi, controllano la progressione da una fase all’altra del ciclo. Integrano segnali endogeni, ma anche stimoli esterni (=esogeni). → la corretta progressione deve garantire che le cellule figlie abbiano un genoma integro. La durata della vita cambia per i tipi cellulari; il tempo di degenerazione definisce la durata del ciclo. es. cellule del lievito →90 minuti. es. cellule epidermide → ogni 30 giorni c’è un ricambio →le cellule proliferano.s scerevisue Lievito; S. cerevisiae Perchè vengono usati questi ceppi? Essi possono essere congelati, sono economici e maneggevoli. Sono una risorsa fondamentale. Il lievito può essere usato anche per gli uomini come riferimento. Quale caratteristica li rende fondamentali? → è un aplo-diplonte: esistono in forma aploide e diploide. diploide: per ogni gene ci sono due copie. aploide: singola coppia. Come è stata sfruttata questa caratteristica? 2001 Premio Nobel per la regolazione del ciclo cellulare (Hartwell, Hunt e Nurse). Hartwell e Nurse stavano studiando questi lieviti, in particolare cercavano dei mutanti di lievito, ossia mutanti che nel DNA avevano mutazioni a livello dei geni coinvolti nel meccanismo cellulare. Loro si bloccano, perché la proteina coinvolta nel processo era bloccata. Non si riesce a concludere il ciclo cellulare, perché le cellule sono un ceppo mutante, la proteina mutante si ferma. Sono chiamati mutanti condizionali o temperatura sensibile. → la svolta è cercare questi mutanti. Hanno la mutazione a carico di un gene, ma a seconda della T alla quale sono fatti crescere, la mutazione si manifesta o no: Ad una bassa temperatura la mutazione c’è , la proteina è mutata, ma il processo non si ferma. Ad alta temperatura 42 C , temperatura restrittiva, la proteina mutata non riesce a funzionare, il processo si blocca. 11/12 → Gli scienziati sfruttano la “proprietà” aplo-diplonte. Identificano i mutanti. Isolano una copia Notano che quando essa è mutata, si manifesta. Osservazione: La diploidia facilita la scoperta rispetto alla aploidia. →Cdc: geni che codificano per proteine che hanno un ruolo chiave nel ciclo cellulare. →Chinasi ciclino dipendenti (CDK): regolano il passaggio dalla fase G1 alla S e dalla G2 alla M. Sono enzimi con un'attività chinasica. Si sono scoperti grazie alle cellule di lievito. Le chinasi possono essere attivate (fosforila dei substrati, formazione di una subunità regolatoria chiamata ciclina.) o inattivate. Le cicline sono sintetizzate o degradate (la chinasi senza la ciclina è spenta, non funziona). = esso è l’evento pilota ❗che guida il processo = La CDK necessita la ciclina. I gruppi fosfato che vengono aggiunti sono a livello di specifici residui aminoacidi (serina + treonina). → Il gene umano che codifica per lo stesso prodotto della chinasi di lievito, può essere sostituito. Il gene umano funziona come quello di lievito❗ N.B. Questo avviene perché i meccanismi sono conservati. → Meccanismi “secondari”: le cicline vengono ubiquitinate e indirizzate al proteasoma →La ciclina al momento giusto è degradata, in modo da inibire la sua attività catalitica. Le cicline hanno infatti all’estremità ammino-terminale una destruction box. 21/12 regolazione per fosforilazione→ esistono delle chinasi che fosforilano (modificazione chimica reversibile) o defosforilano la CDK attivandola o inibendola. Si può inibire anche se la ciclina è attaccata. L’attività può essere modulata. La stessa CDK viene regolata da altre chinasi. Esistono anche delle fosfatasi che rimuovono il gruppo fosfato. Inibitori di CDK→ ci sono una serie di geni che codificano per delle proteine, che quando espresse si legano alla CDK e la inibiscono. Localizzazione subcellulare della ciclina → ci sono dei meccanismi che permettono di regolare l’accumulo di ciclina. In questo modo vengono fosforilati target diversi. CHECK POINT 1. G1/S, punto di restrizione (start): alla fine del G1, integrando tutti i segnali (esogeni e endogeni), si verifica se si è idonei per la fase S. Questa fase è influenzata da fattori di crescita, nutrienti, dimensioni della cellula e presenza di danni al DNA 2. G2/M: a fine della G2 si verifica se si è idonei per la fase M di divisione cellulare. Questa fase è influenzata da dimensione della cellula, presenza di danni al DNA e replicazione del DNA. 3. Transizione tra metafase e anafase: quando i cromosomi finiscono di “danzare” in piastra metafasica, vi è un checkpoint per verificare se si è idonei per entrare in anafase. Si verifica la qualità del fuso mitotico (es. se i microtubuli sono ok). → La cellula deve avere dei sensori al livello dei checkpoint. Il sistema di controllo è adattabile e robusto e può funzionare anche se certi componenti vengono a mancare. → In questi checkpoint viene deciso se attivare o meno la CDK ( funziona come un timer per un tot. tempo). → passando dal lievito eucariote unicellulare agli organismi procarioti pluricellulare si aumenta la difficoltà delle CDK e cicline. Negli eucarioti vi è una maggiore complessità. → Negli unicellulari →Per ogni fase del ciclo ci sono specifiche cicline. Nel lievito la CDK è sempre lei, ma cambia partner regolatorio.es. Partner ciclina G1. (stessa CDK; cambia PARTNER) Nei pluricellulari → c’è una ciclina diversa per ogni fase, ma cambiano anche le isoforme CDK APC/C: Complesso che promuove l’anafase. Esso si attiva in anafase. Ha un'attività catalitica,è una E3 ubiquitino-ligasi → vanno a creare l’etichetta che serve poi per la degradazione proteasomica. L’APC/C è attivato dalla E3 ubiquitino-ligasi. Per inattivare la CDK va inattivata la ciclina. L’ APC/C riesce a inattivare la ciclina (poliubiquitina e spegne l’attività catalitica). Per entrare in anafase: si spegne ciclina e si attiva APC/C. 22/12 & La CDK deve essere attivata affinché in profase avvenga ciò che deve avvenire. A fine della metafase la CDK attiva l’APC/C, e allo stesso tempo permette che l’attività della ciclina della CDK stessa si spenga. Fino alla metafase: Eventi precoci. Dall’attivazione dell’APC/C: Eventi tardivi. →All’inizio della profase la cromatina si deve condensare, si deve assemblare il fuso mitotico, la carioteca si deve degradare. La CDK mitotica deve essere attiva. La cromatina si deve condensare: Le coesine sono delle proteine tengono unite i cromatidi fratelli a livello dei centromeri. Questa unione è dovuta anche dal concatenamento delle due molecole di DNA durante la duplicazione del DNA. Le condensine sono degli anelli che promuovono la condensazione. Sono un target della CDK mitotica. Le condensine sono fosforilate dalla CDK attiva e questa modificazione promuove la condensazione della cromatina. Una profonda condensazione garantisce il corretto maneggiamento. La CDK mitotica induce la fosforilazione della condensina. Nel versante nucleare della carioteca vi è la lamina nucleare con le lamine (filamenti intermedi). La carioteca contiene i complessi del poro, che formano dei pori acquosi. La CDK mitotica fosforila sia alcune subunità dei complessi del poro, ma anche le lamine. Questo provoca una degradazione dell’involucro. Si forma il fuso mitotico. La mitosi M-cdk ciclino-dipendente promuove la creazione del fuso mitotico, andando a fosforilare proteine. La MCDK viene attivata e disattivata nel momento giusto. Dopo aver superato metafase e anafase l’ APC/ C è completamente attiva. → Le coesine sono degradate dalla separasi (è una proteasi). Le coesine tengono unite i cromatidi fratelli. In questa fase la separasi deve essere attivata. La separasi fin ora era inattiva grazie a una proteina chiamata securina. → questo perché le coesine lavorano solo in anafase. I cromatidi fratelli sono separati solo a seguito della disattivazione delle coesine. → l’APC/C è attivato. Degradato la sua ciclina porta all’inattivazione della CDK. 22/12 È molto importante, nel descrivere i meccanismi di regolazione del ciclo cellulare, mettere in evidenza il ruolo delle CDK, delle cicline e l'andamento oscillatorio della concentrazione di queste proteine. La ciclina mitotica, partner della CDK mitotica, comincia ad essere espressa nella fase G2. Alla fine della G2, i livelli della ciclina mitotica sono molto alti. Superato il check-point alla fine di G2, si forma il complesso CDK-ciclina mitotica, con la CDK che diventa attiva. In questa forma, la CDK è una chinasi che fosforila i suoi substrati, dando il via a tutti gli eventi necessari per le fasi iniziali della profase. In particolare, fosforila: Le subunità del complesso del poro nucleare. Le lamine nucleari, causando la degradazione dell'involucro nucleare. Le condensine, favorendo la condensazione della cromatina. Le MAP (proteine associate ai microtubuli) e i motori molecolari, facilitando la formazione del fuso mitotico. Infine, promuove la proteolisi, ovvero la degradazione delle proteine bersaglio da parte del APC/C ciclosoma attivato dal proteasoma, che porta alla degradazione della ciclina mitotica e all'inattivazione dell'attività catalitica della CDK. Inoltre, viene promossa la degradazione delle coesine. Un meccanismo simile avviene per l'entrata in fase S. In G1, ci sono stimoli che portano all'incremento dei livelli della ciclina G1. Quando i livelli della ciclina G1 aumentano, si forma il complesso ciclina con la sua CDK, che, una volta superato il check-point di restrizione (tra G1 e S), consente alla cellula di proseguire verso la fase S, in cui avviene la duplicazione del DNA. Così come la CDK-ciclina mitotica fosforila tutti i suoi substrati per favorire gli eventi necessari alla profase, anche il complesso CDK-ciclina G1 fosforila i substrati necessari per l'entrata della cellula in fase S. Un obiettivo principale di questo complesso è la fosforilazione della proteina RB (Retinoblastoma), un fattore di trascrizione che regola l'entrata in fase S. La proteina RB è attiva quando non è fosforilata; quando viene fosforilata dal complesso CDK-ciclina G1, con una modalità ATP dipendente, perde la sua attività inibitoria e consente l'ingresso nella fase S. Il gene RB, inizialmente identificato come mutato nel tumore retinoblastoma nei bambini (tumore all’occhio) è un esempio di come la regolazione del ciclo cellulare sia alterata nelle patologie tumorali. In questi casi, i meccanismi di controllo del ciclo cellulare sono frequentemente mutati, portando a una proliferazione incontrollata delle cellule. 12/12 Quando la proteina RB non è fosforilata dalla CDK, forma un complesso con un altro importante fattore di trascrizione, chiamato E2F. In questa condizione, RB legato a E2F inibisce l'attività di E2F, bloccando la capacità di attivare la trascrizione di geni necessari per l'ingresso in fase S. Quando i livelli della ciclina della fase G1 aumentano e la CDK associata alla ciclina diventa attiva, la CDK fosforila RB come uno dei suoi bersagli principali. La fosforilazione di RB ne causa l'inattivazione, liberando E2F, che così può legarsi al promotore di specifici geni e promuovere la trascrizione di proteine e enzimi necessari per la fase S, come la DNA polimerasi, istoni, ecc. Questo è un passaggio fondamentale per consentire alla cellula di entrare in fase S e proseguire con la replicazione del DNA. Quando RB è attivo (non fosforilato), blocca E2F, impedendo che la cellula entri in fase S. Invece, quando CDK-ciclina della fase G1 fosforila RB, quest'ultimo diventa inattivo, si dissocia da E2F, che può così svolgere il suo ruolo nella trascrizione dei geni necessari per la fase S. Se il gene che codifica per RB è mutato, come accade in alcuni tumori, RB perde la sua capacità di inibire E2F, causando un’alterazione del ciclo cellulare. In queste cellule tumorali, poiché RB è inattivato, E2F è costantemente libero di attivare la trascrizione dei geni necessari per la fase S, portando a una proliferazione incontrollata e all'ingresso continuo nella fase S. In altre parole, le cellule con RB mutato continuano a dividersi, replicando il DNA senza il normale controllo del ciclo cellulare. Questo schema di regolazione vale in condizioni normali del ciclo cellulare: i livelli di ciclina aumentano durante le fasi appropriate, formando il complesso con la CDK, che diventa attivo. Quando la CDK è attiva, fosforila i suoi substrati (come RB), avviando i processi necessari per la progressione del ciclo. Tuttavia, per garantire che il ciclo cellulare prosegua correttamente, alla fine della sua azione, la CDK deve essere inattivata. Questo avviene attraverso un processo di proteolisi, mediato dalla poliubiquitinazione della ciclina e dalla successiva degradazione della ciclina stessa, un passaggio che assicura la disattivazione della CDK. La CDK ritorna quindi inattiva fino al ciclo successivo. I danni al DNA: Quando si verificano danni al DNA, il check-point G2-M non viene superato, e la cellula si arresta in G1, sperando che i sistemi di riparazione possano risolvere il problema. Se invece il danno al DNA si verifica dopo la fase S, la cellula si arresterà in G2, non superando il check-point G2-M e non entrando in fase M. Chi rileva il danno? La proteina P53. La progressione del ciclo cellulare è controllata da meccanismi che rispondono ai danni al DNA, che possono derivare da mutageni chimici, fisici o mutazioni spontanee. Il nostro sistema di controllo deve rilevare tempestivamente i danni e arrestare il ciclo cellulare, fermandolo al check-point in fase G1-S o fase G2-M. La proteina P53, conosciuta come "guardiano del genoma", svolge un ruolo cruciale in questo processo. Normalmente, P53 è instabile: il gene che la codifica è sempre trascritto, quindi è presente a bassi livelli nelle cellule. Questo perché la cellula deve essere pronta a rispondere rapidamente a eventuali danni al DNA. In assenza di danni, P53 viene rapidamente degradata da una ligasi che tramite poliubiquitinazione, la indirizza al proteasoma. 22/12 Quando si verifica un danno al DNA, i sensori cellulari rilevano il problema e attivano chinasi che fosforilano P53. Questa fosforilazione la stabilizza, impedendo che venga degradata. In questa forma stabile, P53 non viene più riconosciuta dalla poliubiquitina e non viene indirizzata al proteasoma, evitando così la degradazione. La proteina P53 trasloca dal citoplasma, accumulandosi nel nucleo e agisce come fattore di trascrizione, legandosi ai promotori di geni target e attivando la trascrizione. Uno dei principali geni bersaglio di P53 è P21, un inibitore delle CDK. P21 impedisce l'attivazione delle CDK, bloccando la cellula al check-point G1, e impedendo l'ingresso in fase S. Questo arresto dà alla cellula il tempo necessario per riparare i danni al DNA. Se i danni sono irreparabili, P53 può indurre la trascrizione di geni che promuovono l'apoptosi, una forma di morte cellulare programmata, evitando che le cellule danneggiate si replicano. In sintesi, quando si verifica un danno al DNA, i sensori cellulari attivano una chinasi che fosforila P53, stabilizzandola. P53 si accumula nel nucleo, dove promuove la trascrizione di P21, che inibisce le CDK e arresta la cellula in fase G1. Se i danni sono irreparabili, P53 può attivare meccanismi che portano la cellula all'apoptosi. Le cellule della linea germinale negli individui che si riproducono sessualmente non si riproducono per mitosi, ma per meiosi. La meiosi è una divisione cellulare speciale che porta alla formazione di gameti, le cellule riproduttive. Durante questo processo, il numero di cromosomi si riduce da diploide (2n) ad aploide (n), una condizione indispensabile per la riproduzione sessuata. Infatti, quando i gameti maschile e femminile si fondono durante la fecondazione, il numero cromosomico complessivo deve essere ristabilito, e questa riduzione evita che il numero di cromosomi raddoppi ad ogni generazione. Nella riproduzione asessuata, la progenie è geneticamente identica alla cellula madre, tranne in caso di mutazioni occasionali. Al contrario, nella riproduzione sessuata la partecipazione di due individui porta alla generazione di cellule specializzate nelle gonadi, che si fonderanno per formare lo zigote. Durante la divisione meiotica, si verificano processi biologici cruciali che generano gameti diversi tra loro e dalla cellula madre. Questa variabilità genetica (causata da fenomeni come il crossing over, l'assortimento indipendente degli omologhi e l'assortimento casuale dei gameti) è alla base del successo della riproduzione sessuata. La meiosi nelle cellule eucariotiche Dopo la duplicazione del DNA nella fase S dell'interfase, la cellula germinale entra nella fase M meiotica, che consiste in due divisioni cellulari successive. Tra le due divisioni non avviene un'altra duplicazione del DNA. Durante la prima divisione meiotica, i cromosomi omologhi vengono separati, riducendo il numero di cromosomi da 2n a n, creando due cellule aploidi. Successivamente, avviene un breve intervallo, dopodiché avviene una seconda divisione meiotica, simile alla mitosi, ma senza una nuova riduzione del numero cromosomico. Alla fine del processo meiotico, da una cellula madre si ottengono quattro cellule aploidi. Una cellula diploide (2n) ha due copie di ogni cromosoma, una di origine materna e una di origine paterna. Ogni cromosoma può avere forme alternative di un gene, dette alleli. (Proprio per questo le 2 copie del gene non sono necessariamente identiche). Quando una cellula è aploide (n), ha una sola copia di ogni cromosoma, e quindi una sola copia di ogni gene. Nel caso dell'uomo, le cellule somatiche sono diploidi, con 46 cromosomi (23 coppie). I gameti (spermatozoi e ovociti) contengono invece 23 cromosomi, a seguito della riduzione del numero cromosomico durante la meiosi. Quando i gameti si uniscono, il numero cromosomico torna a 46, ristabilendo l'assetto diploide. 12/12 La prima divisione meiotica è detta riduzionale perché dimezza il numero di cromosomi da 2n a n (con la formazione di due cellule aploidi). Nella seconda divisione meiotica, chiamata equazionale, i cromatidi fratelli si separano in due nuove cellule, ognuna con 23 cromosomi dicromatidici. Ogni cromosoma è composto da due cromatidi, e ciascuno di questi cromatidi entra in una delle cellule figlie, senza una riduzione ulteriore del numero di cromosomi. Nella seconda divisione meiotica si dividono i cromatidi fratelli mentre nella prima si dividono i cromosomi omologhi. La profase I della prima divisione meiotica è particolarmente complessa, e si suddivide in cinque sottofasi. Nella terza sottofase avviene il crossing-over, un processo in cui i cromosomi omologhi si appaiano e scambiano segmenti di DNA tra cromatidi non fratelli. Questo evento di ricombinazione genetica contribuisce alla variabilità dei gameti. MEIOSI: La cellula diploide ha 4 cromosomi, colorati con 2 colori diversi (due rossi e due blu, uno lungo e uno corto per ogni colore), rappresentando due coppie di cromosomi: una coppia di cromosomi lunghi (1 rosso e 1 blu) e una coppia di cromosomi corti (1 rosso e 1 blu). I colori distinguono l'origine materna e paterna di ciascun cromosoma. In una condizione diploide, ogni coppia di cromosomi omologhi è perciò composta da un cromosoma di origine materna e uno di origine paterna. I cromosomi omologhi si raggruppano in base a caratteristiche fisiche, quindi i due cromosomi lunghi si affiancano, e lo stesso avviene per i corti. La cellula è in fase G1, poi entra in fase S dove, dopo aver superato il check-point, duplica il DNA. A seguito della duplicazione, ciascun cromosoma si presenta come dicromatidico, ossia formato da 2 cromatidi fratelli identici (quindi ciascun cromosoma aveva un contenuto doppio di DNA). Questi cromatidi rimarranno uniti fino alla seconda divisione meiotica, quando si separeranno. La prima divisione meiotica produce due cellule aploidi, ciascuna con 2 cromosomi. Queste cellule entrano nella seconda divisione meiotica. Durante la seconda divisione, che è una divisione equazionale, ogni cellula figlia mantiene i 2 cromosomi, ma i cromatidi fratelli si separano. Rispetto alla prima divisione, in cui i cromosomi erano ancora dicromatidici, nella seconda divisione i cromosomi si separano in modo simile alla mitosi. In questa fase, i cromosomi omologhi vengono distribuiti in modo casuale tra le due cellule figlie, attraverso un processo noto come assortimento indipendente. Questo assicura la variabilità genetica nei gameti. Le coppie di cromosomi omologhi sono simili per dimensioni, posizione del centromero, forma e informazioni genetiche. Per analizzare i cromosomi e identificare eventuali anomalie, i cromosomi vengono osservati in metafase, quando sono allineati al centro della cellula. (Il cariotipo viene allestito in questa fase). La posizione del centromero è un criterio importante per classificare i cromosomi: se la costruzione primaria del centromero è simmetrica, il cromosoma è metacentrico; se è disposta asimmetricamente, può essere submetacentrico, acrocentrico o telocentrico. 12/12 I cromosomi sono la sede fisica dei geni e sono costituiti da DNA, un insieme di blocchi genici disposti in sequenza. Solo nei cromosomi omologhi, nei due membri della coppia, si trova lo stesso tipo di informazione genetica. Tuttavia, i geni possono avere forme alternative alleliche, quindi la sequenza genetica può non essere identica, pur occupando lo stesso locus (posizione) sui due cromosomi. Ad esempio, in una determinata posizione può esserci un'informazione genetica "A" su un cromosoma, mentre sul cromosoma omologo può esserci un altro allele di quel gene. A seconda della fase in cui si verifica la meiosi, si parla di meiosi gametica, zigotica o intermedia: Meiosi gametica (o terminale): avviene solo nelle cellule germinali (ad esempio, negli animali). Meiosi zigotica: l’organismo è aploide, ma lo zigote risultante dalla fecondazione è diploide e si divide subito per meiosi, ristabilendo l’assetto aploide (ad esempio nei funghi). Meiosi intermedia (o sporofitica): tipica delle piante, in cui l’organismo alterna fasi diploidi (sporofito) e aploidi (gametofito). I gameti aploidi si uniscono per formare una cellula diploide che, tramite mitosi, darà origine allo sporofito diploide. Lo sporofito, a sua volta, produce gameti aploidi tramite meiosi. Questo alternarsi tra generazioni diploidi e aploidi rende il ciclo di vita delle piante un esempio di meiosi intermedia. Ogni divisione meiotica prevede due fasi: la divisione riduzionale (I) e la divisione equazionale (II). 12/12 Durante la profase I, la cromatina si condensa e il corpo nucleare scompare. Inizia la formazione del fuso meiotico e delle tetradi (o bivalenti o sinapsi), strutture in cui i cromosomi omologhi si appaiano. L’appaiamento è facilitato da regioni di complementarietà e dal complesso sinaptonemale (una specie di cerniera), che stabilizza la tetrade. In questa fase avviene anche il crossing-over, lo scambio di materiale genetico tra cromatidi non fratelli di cromosomi omologhi. La profase I si suddivide in cinque sottofasi: 1. Leptotene: inizia la condensazione della cromatina, i cromosomi sono formati da due cromatidi fratelli, uno la copia dell’altro. 2. Zigotene: inizia la sinapsi e come in una cerniera che appaia i cromosomi omologhi si forma il complesso Sinaptonemale. 3. Pachitene: avviene il crossing-over, con lo scambio di tratti di DNA tra cromatidi non fratelli di cromosomi omologhi. 4. Diplotene: il complesso sinaptonemale scompare, ma rimangono visibili i punti di incrocio, chiamati chiasmi, dove è avvenuto il crossing-over. 5. Diacinesi: i cromosomi omologhi, ormai separati, sono pronti per essere allineati nella piastra metafasica durante la metafase I. 12/12 Durante la metafase I della meiosi, le coppie di cromosomi omologhi sono allineate lungo l’equatore della cellula, pronti per essere separati durante l'anafase I. In anafase I della meiosi, sono i cromosomi omologhi a separarsi, con ciascun cromosoma che si sposta verso un polo della cellula. I cromatidi fratelli restano uniti dalle coesine. Al contrario, in anafase della mitosi, sono i cromatidi fratelli a separarsi, poiché i cromosomi sono già distinti nei cromatidi. Nella telofase I della meiosi, i cromosomi omologhi si separano ai poli del fuso, la cromatina si decondensa, e l’involucro nucleare si riforma. In questa fase, si forma l’anello contrattile, che tramite citodieresi, divide la cellula madre in due cellule figlie aploidi. Non avviene una nuova duplicazione del DNA tra la meiosi I e la meiosi II. Segue una breve fase di intervallo e si entra in profase II della meiosi che è simile alla profase della mitosi: la cromatina si condensa, il fuso meiotico si riforma e il corpo nucleare scompare. In metafase II, i cromosomi si allineano, e in anafase II, i cromatidi fratelli si separano, come nella mitosi. Infine, in telofase II, i cromatidi arrivano ai poli, la cromatina si decondensa, e l’involucro nucleare si riforma. Dopo il crossing-over,si assiste alla comparsa dei cromatidi ricombinanti che presentano variazioni rispetto a quelli iniziali, generando una maggiore variabilità genetica. Questo processo, insieme all'assortimento indipendente dei cromosomi omologhi in metafase I, aumenta ulteriormente la diversità dei gameti. In metafase I, la distribuzione dei cromosomi omologhi è casuale. Per esempio, i cromosomi omologhi verdi e marroni o gialli e viola potrebbero essere disposti in modo diverso durante la divisione, generando diverse combinazioni genetiche. Vedendo più nello specifico: Si hanno due cromosomi lunghi (verde e marrone) e due corti (giallo e viola) che si allineano nella piastra metafasica. Quindi, il cromosoma giallo può associarsi con il verde e il viola con il marrone. Tuttavia, questa distribuzione non è predefinita: potrebbe anche verificarsi che il viola si posizioni con il verde e il giallo con il marrone. Pertanto, durante l'anafase I, quando le coppie di cromosomi omologhi si separano, si possono formare diverse combinazioni di cromosomi, in base alla distribuzione casuale durante la metafase. Questa variabilità dipende dalla casualità della disposizione dei cromosomi nella piastra metafasica, e rappresenta il principio dell'assortimento indipendente, che è fondamentale nel generare diversità genetica. Più alto è il numero di cromosomi, minore è la probabilità che si ripristinino le combinazioni parentali originali. Il numero di possibili combinazioni gametiche derivanti dall'assortimento casuale dei cromosomi materni e paterni è 2ⁿ, dove n è il numero di cromosomi aploidi del corredo genetico. Nell'uomo, dato che n = 23, le possibili combinazioni cromosomiche derivanti dalla distribuzione casuale dei cromosomi materni e paterni sono 2²³, ossia circa 8 milioni di combinazioni diverse. 22/12 Confronto tra mitosi e meiosi: Entrambe le divisioni iniziano con la duplicazione del DNA durante la fase S dell’interfase. Nella mitosi, i cromosomi si allineano in piastra metafasica e i cromatidi fratelli si separano in anafase, generando due cellule figlie identiche. Nella meiosi, la cellula madre è diploide e attraverso due divisioni successive (la prima riduzionale e la seconda equazionale) si formano quattro cellule figlie aploidi, ciascuna con una combinazione unica di materiale genetico. Durante la meiosi, i cromosomi omologhi si separano nella prima divisione e i cromatidi fratelli si separano nella seconda. Aneuploidia: Se ci sono errori nel processo di separazione durante la meiosi, come la non-disgiunzione dei cromosomi omologhi o dei cromatidi fratelli, possono verificarsi alterazioni nel numero di cromosomi nelle cellule figlie, con la conseguente formazione di gameti aneuploidi (ad esempio, con un cromosoma in eccesso o in difetto). La non-disgiunzione può avvenire sia durante la meiosi I che la meiosi II. Nell'esempio in figura: Nel caso di un evento di non disgiunzione durante la meiosi I, i cromosomi omologhi non si separano correttamente. Questo comporta che entrambi i cromosomi della coppia vadano a finire nella stessa cellula, mentre l'altra cellula non riceve alcun cromosoma della coppia. Nella meiosi II, quando queste cellule si dividono ulteriormente, delle 4 cellule risultanti, due avranno un cromosoma in più, mentre le altre due ne avranno uno in meno. La non disgiunzione può avvenire anche durante la meiosi II. In tal caso, delle 4 cellule finali, 2 saranno normali, mentre le altre 2 presenteranno un'anomalia cromosomica (un cromosoma in più o in meno). Spermatogenesi e Oogenesi La spermatogenesi porta alla formazione dei gameti maschili, ovvero gli spermatozoi, mentre l'oogenesi (o ovogenesi) è il processo che avviene nelle ovaie per formare i gameti femminili, ossia la cellula uovo. Entrambi i processi iniziano da una cellula diploide della linea germinale nelle gonadi (testicoli negli uomini, ovaie nelle donne). Nei maschi, si parte dallo spermatocita primario, mentre nelle femmine si parte dall’ovocita primario. Entrambi i tipi cellulari vanno incontro a meiosi I e meiosi II, generando quattro cellule figlie. 12/12 Tuttavia, ci sono differenze significative tra i due processi: Spermatogenesi: Tutte e quattro le cellule figlie derivanti dalla meiosi diventano spermatozoi funzionali. Oogenesi: Tre delle quattro cellule prodotte degenerano (non sono più funzionali) a causa di una divisione citoplasmatica asimmetrica. Solo una cellula, che accumula la maggior parte del citoplasma, diventa l'ovocita secondario (una cellula grande e ricca di riserve di mRNA e proteine), mentre le altre diventano corpi polari che degenerano. Spermatogenesi Nel maschio, la spermatogenesi inizia con le cellule germinali diploidi, chiamate spermatogoni, che aumentano di numero per mitosi. Alla pubertà, una di queste cellule, lo spermatocita primario, entra nella meiosi I, dando origine a due spermatociti secondari aploidi. Ciascuno di questi subisce una seconda divisione meiotica (meiosi II) per produrre spermatidi. Da un singolo spermatocita primario diploide, si ottengono quindi quattro spermatidi aploidi. Gli spermatidi subiscono un processo di differenziazione chiamato spermioistogenesi, che li trasforma in spermatozoi maturi. Durante questo processo, il nucleo si condensa, si forma l'acrosoma (una struttura che aiuterà lo spermatozoo a penetrare nell'uovo), si sviluppa il flagello a partire dal centriolo e viene eliminato gran parte del citoplasma. I spermatozoi diventano così cellule piccole, agili e mobili, pronte a muoversi grazie al flagello per fecondare l'uovo. Caratteristiche della spermatogenesi: Processo continuo che inizia alla pubertà e continua per tutta la vita. Da ogni spermatocita primario derivano quattro spermatozoi completamente funzionali. Avviene nei tubuli seminiferi dei testicoli. Oogenesi Nelle femmine, il processo inizia con le cellule germinali diploidi, chiamate ovogoni, che si moltiplicano per mitosi durante la vita fetale. Alla nascita, la femmina ha un numero fisso di ovogoni che non aumenta più. A partire dalla pubertà (fino alla menopausa) alcuni ovogoni si sviluppano in ovociti primari, che entrano nella meiosi I. Gli ovogoni secondari iniziano ad accrescersi e maturare dalla pubertà fino alla menopausa, ma non in modo continuo. Ogni mese, durante il ciclo mestruale di circa 28 giorni, uno degli ovociti primari entra nella profase I della meiosi e si blocca nello stadio di diplotene. Successivamente, il processo di meiosi riprende, e l'ovocita, una cellula diploide, completa la prima divisione meiotica, generando due cellule aploidi: una diventa il primo corpo polare, che degenera, mentre l'altra diventa l'ovocita secondario, destinato a maturare ulteriormente. La divisione citoplasmatica durante la meiosi I è asimmetrica, quindi una delle due cellule aploidi eredita la maggior parte del citoplasma e diventa l’ovocita secondario, mentre l’altra diventa un corpo polare, che degenera (è servita solo per separare gli omologhi). La meiosi II nell'oogenesi si blocca in metafase II e viene completata solo dopo la fecondazione. Quando lo spermatozoo penetra nell'ovocita e lo feconda, la meiosi II viene conclusa, dando origine alla cellula uovo (che diventerà lo zigote) e al secondo corpo polare, che generalmente degenera. 22/12 Caratteristiche dell'oogenesi: Il processo è discontinuo e si svolge su un lungo periodo di tempo. La meiosi femminile non è continua, e solo una delle cellule aploidi prodotte durante le due divisioni meiotiche diventa una cellula uovo funzionale. Le altre cellule aploidi, chiamate corpi polari, degenerano e non contribuiscono alla formazione dell'ovocita. Differenze tra Spermatogenesi e Oogenesi 1. Numero di gameti: ◦ Nella spermatogenesi, da un singolo spermatocita primario si ottengono quattro spermatozoi funzionali. ◦ Nell'oogenesi, da un singolo ovogonio si ottiene una cellula uovo funzionale, mentre le altre tre cellule diventano corpi polari e degenerano. 2. Processo: ◦ La spermatogenesi è un processo continuo che dura tutta la vita dopo la pubertà. ◦ L'oogenesi è discontinua: gli ovociti primari entrano in meiosi durante la vita fetale, ma la meiosi riprende solo alla pubertà e si completa solo con la fecondazione. 3. Citoplasma: ◦ Nella spermatogenesi, le quattro cellule prodotte dalla meiosi hanno una distribuzione bilanciata del citoplasma, tutte diventano spermatozoi funzionali. ◦ Nell'oogenesi, la divisione citoplasmatica è asimmetrica, una sola cellula riceve la maggior parte del citoplasma, diventando la cellula uovo. Le altre diventano corpi polari e non sono funzionali. 22/12 Determinazione del Sesso Il sesso dell'individuo è determinato dal spermatozoo, che può contenere un cromosoma X o un cromosoma Y. Se lo spermatozoo con cromosoma X feconda l'ovocita, si sviluppa un individuo femminile (XX); se lo spermatozoo con cromosoma Y feconda l'ovocita, si sviluppa un individuo maschile (XY). Cariotipo Il cariotipo è un'analisi cromosomica che consente di visualizzare, contare e identificare eventuali anomalie nei cromosomi. Viene utilizzato, ad esempio, in diagnosi prenatale tramite tecniche come la villocentesi o l'amniocentesi, oppure tramite l'analisi del sangue per rilevare condizioni patologiche. I cromosomi vengono osservati durante la metafase, quando sono più facilmente visibili. Per ottenere questo stadio, le cellule vengono proliferate in laboratorio e poi bloccate in metafase, precisamente al checkpoint della fase M. Questo blocco è indotto tramite l'uso della colchicina, una sostanza che inibisce la formazione dei microtubuli e impedisce la separazione corretta dei cromosomi, arrestando la cellula nelle fasi di metafase e anafase. Il complesso del controllo del fuso mitotico, rilevando la presenza di colchicina, non riesce a garantire una corretta separazione dei cromosomi, inducendo così il blocco in metafase. Questo processo è utile in ambito sperimentale, poiché consente di "congelare" la cellula nel momento in cui i cromosomi sono chiaramente visibili. Successivamente, le cellule vengono trasferite in una soluzione ipo-osmotica, che provoca il rigonfiamento del nucleo e facilita la separazione dei cromosomi per una migliore osservazione. Infine, vengono utilizzate tecniche di colorazione che permettono di visualizzare i cromosomi sotto forma di bande (bandeggiamento). Esistono anche software specifici che consentono di analizzare i cromosomi, rilevando eventuali traslocazioni, inversioni, delezioni o altre mutazioni. 13/12 Aneuploidia Non-disgiunzione dei cromosomi sessuali durante la meiosi porta ad aneuploidia=condizione anomala in cui uno o più cromosomi mancano o sono in eccesso Esempi nella nostra specie: Sindrome di Turner Individui femmine con cariotipo X0=carenza di un cromosoma sessuale (lo 0 indica questa mancanza): donne (tendenzialmente) sterili con leggere alterazioni fisiche ma non hanno anomalie mentali/impedimenti vitali ← unico caso in cui un individuo può sopravvivere con un solo cromosoma sessuale, anche se molti concepimenti X0 abortiscono spontaneamente nelle fasi iniziali dello sviluppo embrionale Sindrome di Klinefelter Individui maschi con cariotipo XXY=un cromosoma sessuale in eccesso → caratteristicamente hanno gli arti più lunghi del normale e sono anch’essi sterili, ma rimane comunque una condizione compatibile con la vita. Cariotipo=analisi dell’assetto cromosomico di un individuo mediante la definizione delle coppie di omologhi che definisce la sequenza genica ↓ Le cellule umane diploidi hanno un cariotipo costituito da 23 coppie di cromosomi → 46 singoli. In particolare i cromosomi non-sessuali=autosomi: 22 coppie autosomiche all’interno del cariotipo e sono numerati in ordine decrescente per lunghezza e allineati secondo la posizione del centromero. L’allestimento del cariotipo consente di ottenere informazioni qualitative/quantitative sui cromosomi (come aneuploidie o aberrazioni cromosomiche), per questo è frequente sia nella diagnosi prenatale che per la diagnosi di tumori → avviene sempre in fase mitotica, ovvero nella fase di proliferazione per avere una cultura in vitro amplificata. ← Per congelarle al momento della divisione meiotica, queste cellule vengono trattate con la colchicina (veleno meiotico che non consente il superamento del checkpoint metapahse-to-anaphase transition, ovvero quando i cromosomi non sono ancora separati). Dopo il trattamento, le cellule vengono messe in una soluzione ipotonica che consenta rilassamento + lisi dei cromosomi per permetterne lo studio mediante colorazione. ↓ 13/12 mette in evidenza il bandeggio tipico di ciascun cromosoma di individui della stessa specie=un numero di 400-800 di bande per ciascun cromosoma che a loro volta contengono milioni di basi ↓ I diversi approcci alla marcazione del bandeggio: La prima tecnica di bandeggio (anni ‘70)=bandeggio Q → utilizza un colorante fluorescente= quinacrina → agisce alchilando il DNA → tale alchilazione poi verrà evidenziata mediante luce UV. Al giorno d’oggi viene usato maggiormente il colorante Giemsa, preceduto dal trattamento con l'enzima proteolitico=tripsina → degrada le proteine strettamente legate al DNA per facilitare l’accesso della colorazione che consente di mettere in evidenza il bandeggio a microscopio ottico. Bandeggio R → prevede una denaturazione mediante calore → denatura preferenzialmente le zone ricche con basi AT; in seguito a tale denaturazione si procede con il Giemsa → in questo modo vengono messe in evidenza solo le coppie GC. Bandeggio C → prevede sempre denaturazione con calore di cromosomi in soluzione di idrossido di bario → mette in evidenza le zone eterocromatiche costitutive (es:centromeri). Sono anche disponibili delle tecniche più sensibili che sfruttano sempre la fluorescenza → permettono di scendere sui dettagli molecolari dell’anomalia → se ci sono delle familiarità in diagnosi prenatale si va a cercare la specifica mutazione → mediante ibridazione post-denaturazione con una sequenza polinucleotidica: FISH (ibridazione in situ fluorescente) → si utilizza come sonda fluorescente un oligonucleotide la cui sequenza è complementare al tratto di DNA del cromosoma in studio → mette in evidenza la mutazione stessa. CGH array → comparative genetic hybridization. ↪ Una volta effettuato il bandeggio, avviene l’analisi su vetrino: i cromosomi vengono raggruppati a coppie e allineati per consentirne lo studio. Cellule staminali 1906 Alexander Maximov definisce le cellule staminali=cellule capostipiti delle discendenze cellulari. Ad oggi non esiste una definizione esaustiva e puntuale di cellula staminale. =cellule indifferenziate (progenitori delle cellule differenziate): Cellule staminali embrionali (ESC) → durante un preciso stadio dello sviluppo embrionale= blastocisti (circa una settimana dopo la fecondazione) → qui le cellule si trovano sotto forma di agglomerato=ICM (massa cellulare interna/embrioblasto della blastocisti=poco prima dell’impianto nella mucosa uterina) → pluripotenza differenziativa=sono le cellule ancestrali da cui deriva il differenziamento delle cellule di qualsiasi tessuto degli organismi pluricellulari. Gli scienziati sono riusciti a prendere queste cellule e metterle in coltura in vitro → si possono automantenere per un tempo illimitato senza andare in senescenza se la nicchia ambientale creata è adatta → poi si possono utilizzare grazie alla loro manipolazione in qualsiasi generazione tissutale. 13/12 ↑ Esperimento di Evans + Kaufman (1981): coltivano blastocisti di topo, ottenendo ESC pluripotenti. Per verificare la pluripotenza osservarono 2 fattori che corroboravano la loro corretta manipolazione: comparsa di teratomi (tumori caratterizzati da un ammasso di cellule di tessuti diversi) → poiché le ESC possono essere rilevate dall’organismo come non-self + possono differenziarsi in qualsiasi tipo di cellule, in questo caso in cellule tumorigeniche=deriva dell’indirizzamento artificiale; formazioni di chimere → quando iniettate nella cavità di una blastocisti ospite, la blastocele, le ESC sono in grado di colonizzare tutti i tessuti dell’embrione chimerico (chimerico perché composto da due genomi diversi) compresa la linea germinale; differenziamento in vitro. Thomson (1998) → isola le cellule staminali embrionali umane, prese da embrioni sovrannumerari (da DNA procreazione artificialmente assistita=fecondazione in vitro) per impiantarle ← ESC possono essere modificate geneticamente sostituendo un gene di interesse con uno mutato mediante ricombinazione omologa. ↖ tuttavia le ESC umane ottenute da embrioni non impiantati sono immunologicamente diverse dal paziente trapiantato, sono dunque necessarie terapie immunosoppressive (trapianti d’organo) + non è da sottovalutare il rischio dell’insorgenza di teratomi. Per sicurezza si cerca di utilizzare ES già parzialmente indirizzate (parzialmente differenziate) verso il tipo cellulare da curare. Cellule staminali adulte (o tissutali/somatiche=ASC) → si trovano in tutti i distretti tissutali per garantirne l’omeostasi tissutale=consentono la rigenerazione delle cellule dell’organismo + medicina rigenerativa=utilizzo delle cellule indifferenziate per indirizzarle artificialmente al differenziamento specifico ← con ovviamente un indirizzamento più specifico rispetto alle ESC (bisogna considerare che fra le cellule staminali adulte sono presenti anche quelle neonatali, fetali, isolabili da sangue cordonale e dalla placenta) → multipotenza/unipotenza differenziativa (più limitata rispetto a ESC). ↖ Presenti nei tessuti a rapido ricambio fisiologico: epiteli e sangue + recentemente sono state evidenziate in tessuti una volta considerati “perenni”=nervoso (negli anni ‘90 Weiss + Reynolds hanno identificato le cellule staminali neurali nel cervello maturo che sostengono la produzione di un numero limitato di neuroni nell’ippocampo) + muscolare scheletrico. ↪ Caratteristiche principali fondamentali: capacità di self-renewal=auto-rinnovamento per un tempo virtualmente illimitato + potenza differenziativa + una volta adulte, sono clonogeniche=in grado di generare una linea di cellule identiche in grado di differenziare nei tipi cellulari dei tessuti in cui risiede (clonogenicità dimostrata in vitro). ↑ POTENZA DIFFERENZIATIVA Totipotenza → può sostenere, non solo la generazione di tutte le cellule dell’organismo, ma anche la generazione di tessuti extraembrionali ← zigote=totipotente=cellula staminale per eccellenza. Pluripotenza → capacità di una singola cellula di dividersi + dar luogo ad una progenie in grado di differenziarsi in uno qualsiasi dei tipi cellulari derivati dai tre strati germinali embrionali: endoderma, mesoderma, ectoderma ← ESC. Multipotenza → capacità di differenziarsi in limitati tipi di cellule ← ASC Unipotenza → capacità di differenziarsi in un solo tipo di cellule ← ASC miocitiche - cellule scheletriche. 23/12 DIVISIONE ASIMMETRICA: una cellula staminale è in grado di dividersi in due cellule figlie, che sono tra loro diverse: 1. cellula staminale figlia (uguale alla madre=ha ereditato un determinante staminale) 2. progenitore (non ha capacità staminali)=darà luogo ad una discendenza cellulare mediante una proliferazione a tempo limitato. ↓ Divisione asimmetrica → mantiene il pool di cellule staminali all’interno di un organismo ← esistono due teorie circa l’asimmetria staminale: → asimmetria ambientale: sono gli stimoli ambientali che rendono diverse le due cellule figlie in seguito alla citodieresi nella nicchia ambientale che nascono invece simili (ecco perchè lo studio dei fattori alla base della rigenerazione dei tessuti in vivo è una parte importante della ricerca sulle cellule staminali); → asimmetria divisionale: le cellule prodotte dalla divisione cellulare nascono già biomolecolarmente diverse grazie a distinte caratteristiche intrinseche: cellula staminale figlia → eredita il determinante staminale, al contrario del progenitore, che ne è privo. A livello biocellulare non disponiamo di marcatori molecolari che ci permettano di distinguere le due cellule figlie della cellula staminale → la loro definizione si basa su saggi funzionali retrospettivi → dipende quindi dallo studio a posteriori del comportamento della cellula staminale in vivo/in vitro (bisogna stare attenti quando si strappano le staminali dal loro microambiente=nicchia staminale ne regola comportamento/destino mediante stimoli che bisogna riprodurre anche nella manipolazione in vitro). ↑ Esperimento di Evans + Kaufman: Una cellula staminale adulta ematopoietica trapiantata in un topo letalmente irradiato ha la capacità di rigenerare tutti gli elementi figurati del sangue per tutta la sua vita (È possibile inoltre trapiantare il midollo di quel topo in un secondo topo irradiato + ripetere la procedura più volte). Al contrario se venisse trapiantato un progenitore, questo sarebbe in grado di dare vita agli elementi figurati del sangue solo per un periodo limitato di tempo. 18/12 Bio LE CELLULE STAMINALI ADULTE (O SOMATICHE) Un’altra tipologia di cellule staminali include le Adulte, dotate di self-renewal e diﬀerenziamenti; si trovano in tutti gli stretti tessutali e il loro compito è di garantire l’omeostasi e la rigenerazione tessutale. Queste cellule sono piuttosto rare e la loro divisione può avvenire secondo due modalità: la prima è Divisone asimmetrica: si tratta di un’ auto generazione che porta alla formazione di una cellula figlia identica alla madre e ad un progenitore: ossia una cellula non staminale che è in grado di dividersi per un certo numero di volte suﬃciente a garantire il numero di cellule che andranno a sostituire quelle usurate. Il progenitore darà luogo ad una progenie diﬀerenziata che non è destinata a permanere per tutta la durata della nostra vita (a diﬀerenza delle staminali). E’ importante ricordare che queste cellule non sono al riparo da mutageni: possono essere attaccate e danneggiate. Perchè queste cellule sono così rare? Le cellule che si amplificano in transito (TA) transitano dal carattere staminale al carattere diﬀerenziato e grazie ai cicli di divisione che attraversano hanno l’eﬀetto di aumentare il numero di progenie diﬀerenziata che deriva da una sola divisione di una cellula staminale. Questo permette alla popolazione di cellule staminali di dividersi raramente e di generare un’abbondante riserva di nuove cellule diﬀerenziate La divisione può avvenire in maniera asimmetrica o simmetrica a seconda del bisogno del nostro organismo; se infatti la popolazione staminale è stata danneggiata e alcune sono state perse, è chiaro che rispondendo ad appropriati stimoli della nicchia staminale (sede dove si trovano), la popolazione andrà incontro ad una divisione simmetrica con l’obiettivo di risanare la precedente perdita. Queste cellule adulte sono Clonogeniche: capaci di generare una linea di cellule identiche in grado di diﬀerenziare nei tipi cellulari necessari in ogni tessuto. Questa caratteristica è più facile da generare in vitro anche perchè non è banale distinguere chi è la figlia staminale e chi è la figlia progenitore. Abbiamo già fatto riferimento ad un’ipotesi dei filamenti immortali che fu avanzata negli anni 70 da Cairns: si tratta di un meccanismo molecolare usato dalle c.stminali per diminuire le mutazioni che promuovono il cancro durante la replicazione del dna: Indipendentemente dalla frequenza di divisione della cellula staminale (la cellula si divide lentamente e così la marcatura viene lentamente diluita nel DNA neosintetizzato), una possibile interpretazione del mantenimento della marcatura nel DNA è che le cellule staminali possano segregare in modo asimmetrico i loro filamenti di DNA in modo che in ogni divisione il DNA marcato in origine venga mantenuto dalla cellula staminale. Questo filamento dovrebbe aver acquisito un contrassegno speciale. Quest’ipotesi è stata dimostrata solo in alcuni staminali adulte ad esempio in quelle del muscolo, staminali epiteliali e staminali nervose. Il fatto che si trovi nella nicchia e che abbia una velocità di divisione bassa al contempo fa sì che si riproduca lentamente, ma anche permettono di reagire qualora vi fosse un’urgente necessità di fornire delle cellule diﬀerenziate. 16/12 Dove si trovano queste cellule staminali adulte? Conosciamo abbastanza bene alcune topologie di cellule staminali adulte quali quelle dello strato basale dell’epidermide: l’epidermide è infatti un tessuto pluristratificato il quale viene rinnovato perennemente (circa ogni 30 gg) e questo può essere possibile perchè nello strato basale sono presenti delle cellule staminali adulte capaci di autorigenerarsi, ma sono dal punto di vista potenziale, UNIPOTENTI perchè sono in grado di diﬀerenziarsi fino ad andare incontro al diﬀerenziamento terminale. L’epidermide è un epitelio e le cellule sono cheratinociti (provengono da filamenti intermedi coinvolti nelle giunzioni cellula-cellula). Queste cellule staminali sono raggruppate nelle punte delle papille del derma e si dividono raramente generando i progenitori che invece si replicano frequentemente ma non illimitatamente. In seguito alla divisione asimmetrica si genera un progenitore che andrà incontro all’amplificazione: il progenitore figlio (non più staminale) lascia la nicchia staminale e di fatto procede gradualmente da uno strato all’altro andando incontro a espressioni geniche diﬀerenziali fino ad acquisire lo stato diﬀerenziato e alla fine dei 30 gg circa, verrà persa ed eliminata dallo strato più esterno. Sempre parlando di epiteli, anche a livello corneali vi sono delle cellule staminali: nel Limbus (tra la cornea e la congiuntiva) e garantiscono la rigenerazione della cornea (per assicurare la vista); può tuttavia succedere che delle ustioni uccidano queste cellule e dunque la cornea non si rigenera (periodo di ripresa di circa 1 anno). Anche nell’intestino (epitelio monostratificato) in particolare nelle cripte ci sono cellule s.a. Sono MULTIPOTENTI (generano progenitori che escono dalla cripta e andranno incontro a 4 destini diﬀerenziativi diversi (enterociti cona la funzione di assorbimento; mucipare-secernenti; cellule di Paneth e cellule enteroendocrine.) Le cellule diﬀerenziate vengono estruse nel lume intestinale dopo aver raggiunto l’apice della loro carriera. 16/12 Un altro tipo di staminali adulte è La staminale emopoietica HSC (hemopoietic stem cell): la sua nicchia staminale è il midollo osseo in cui risiede un’importantissima popolazine staminale alla base dell’emopoiesi (cellule che sostengono ogni giorno la generazione degli elementi figurati del sangue) sono MULTIPOTENTI e molto rare. Sempre nel midollo osseo vi sono altre Adulte che sono di supporto e forniscono il microambiente in cui la staminale vive: parliamo ad esempio delle cellule del sistema linfatico (vedersi schema sottostante) Il tessuto è ovviamente irrorato da vasi sanguigni dove queste cellule immettono i loro prodotti. Nel tessuto muscolare sono state ritrovate delle cellule somatiche dette Satelliti UNIPOTENTI (sono capaci di generare un tipo cellulare diﬀerenziato che è il miocita che formerà la fibra muscolare ). Vengono denominate come tali perché sono interposte fra il plasmalemma e la lamina basale e normalmente sono quiescenti (G0); se si subisce un trauma al muscolo escono dalla quiescenza ed entrano in G1 e cominciano a proliferare. FERRARI G SCIENCE 1998 Verso la fine degli anni 90 vennero pubblicati dei dati che mostravano che una cellula staminale adulta è molto più plastica di come si credeva: poteva andare incontro al trans-diﬀerenziamento ad altri tipi cellulari che non risiedono in quel tessuto. Questa aﬀermazione fece molto clamore in quanto queste cellule erano state prese dalla loro nicchia, isolate e manipolate in vitro (si crea un microambiente non uguale a quello della cellula) dunque non vi era la certezza che gli stimoli a cui era sottoposta fossero realmente fisiologici. Da quel momento in poi, sono stati messi a fuoco una serie di punti che devono essere rispettatI prima di fare certi esperimenti e dimostrazioni. Per conoscere bene una cellula staminale dobbiamo conoscere la sua nicchia staminale: ossia il microambiente che si trova attorno ad esse,fornendoli supporto e segnali che regolano i processi di auto-rigenerazione e diﬀerenziamento. E’ molto importante conoscere bene questi segnali per comprendere con quale popolazione di staminali abbiamo a che fare: la nicchia dirige il destino della staminale. m 16/12 CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE IPS Pluripotenza= tipica delle cellule staminali embrionali (presenti solo nello stadio di blastocisti). Si riprogrammano in laboratorio attraverso delle cellule somatiche. Lo scienziato giapponese Yamanaka ha generato in laboratorio IPS condividendo il premio nobel per aver aperto l strada alla medicina rigenerativa con John Gurdon (ricordato per l’esperimento di clonazione riproduttiva fatto su un girino: il genoma di una cellula diﬀerenziata era stato trapiantato al posto di una cellula uovo e sostenne lo sviluppo fino alla generazione di un girino; un esperimento Simile era stato fatto nei mammiferi con Dolly. Il genoma non è soggetto a eliminazione di geni che non servono più, ma vengono inattivati). Come ha fatto Yamanaka a riprogrammare una cellula in staminale pluripotente e che ruolo aveva Gurdon? Yamanaka partì da fibroblasti di topo e successivamente umani: Con degli screening dimostra che facendo overesprimere dei fibrobalsti, questi riprogrammavano la loro espressione dei geni attraverso quattro fattori di trascrizione (Oct4, cMyc, Klf4, Sox2) ritornando ad uno stato di pluripotenza tipica delle staminali embrionali (le stesse cellule che nella blastocisti possono diﬀerenziarsi nei 200 tipi cellulari diversi e dividersi un numero infinito di volte). Questi fattori venivano inseriti con dei vettori che mimano un virus che infetta una cellula, permettendo un’alta eﬃcienza e tutti i fibroblasti venivano colpiti, anche se non si sa bene dove si inserisca questo vettore (per questo ci sono stati dibattiti e si evita di lavorarlo sull’uomo). Se sono pluripotenti, sia in vitro che lab devono essere capaci di dividersi almeno in tre tipi cellulari diverso (1 per foglietto embrionale: uno per il meso,uno ecto e uno endoderma). Da un punto di vista etico ci si domanda se le IPS siano a tutti gli eﬀetti degli embrioni: la critica si divide e vi è un’importante percentuale di chi vede questa scoperta come una svolta nel tentativo di trovare una cura a malattie. CONFRONTO: Le cellule staminali adulte non fanno correre il rischio al paziente di rigetto nel caso venissero trapiantate; a diﬀerenza delle IPS. In questo processo di riprogrammazione le IPS overesprimendo questi 4 fattori riaccendo i geni che servono, ma non riesco a cancellare tutte le modificazioni epigenetiche che il fibroblasto aveva: è come se queste cellule mantengano una sorta di memoria di quello che erano, anche se sono diventate pluripotenti; a diﬀerenza delle Staminali Embronali. Inoltre in un’ottica di trapianto proprio come le cellule embrionali, anche le ips sono tumorigeniche e ciò risulta di grande rilevanza in quanto non è concesso trapiantare cellule che rischiano di mutarsi e divenire maligne. Per concludere… Essendo così complesso e allo stesso tempo non privo di rischi, ad oggi le IPS non sono utilizzate in clinica, ma sono comunemente create in laboratorio per essere poi studiate e indirizzate attraverso dei determinati modelli cellulari. MENDEL E L’EREDITARIETA’ 18/12 Furono degli studi eﬀe=ua? a ﬁne del 1800 tu=avia, la comunità scien?ﬁca non era pronta a comprenderli ﬁno a quando nel 1903 venne dimostrato che i geni sono ﬁsicamente localizza? sui cromosomi e le leggi di Mendel trovarono il loro fondamento ﬁsico nella meiosi. Quindi solo 35 anni dopo degli studi di Mendel, grazie al lavoro di De Vries, Correns e Von Tschermak, ques? studi trovano la loro sintesi in quella che ora si chiama Teoria Cromosomica dell’ereditarietà. Mendel nei suoi studi scelse come modello delle piante di pisello perché avevano dei grandi vantaggi: - facile produzione su larga scala - numero elevato di discenden? (semi) - tempi di generazione brevi - organi riproduYvi maschili e femminili talvolta sulla stessa pianta Scelse di osservare 7 cara=eri quali: il colore dei ﬁori, la posizione dei ﬁori, il colore del seme, la forma del seme, il colore del baccello, la forma del baccello e la lunghezza del fusto. Di ques? 7 lui studia la trasmissione dei cara=eri incrociando le piante parentali ed in questa scelta fu estremamente fortunato in quanto essi erano codiﬁca? da geni che si trovavano in cromosomi diversi, se non fosse stato cosi quindi se i geni si trovavano sullo stesso cromosoma, Mendel non sarebbe a riuscito a dimostrare il suo studio. Quindi di fa=o Mendel spende prima tanto tempo per generare le cosidde=e linee pure che dal punto di vista geno?pico sono degli omozigo? (possiedono due forme alleliche iden?che) Inizialmente incrocia una generazione parentale(linee pure) di ﬁori viola e ﬁori bianchi, si o=ennero dei semi che pianta? generarono la prima generazione ﬁliale F1 ed erano tu=e piante con ﬁori viola, quindi il cara=ere bianco era scomparso. Successivamente le piante della generazione F1 vennero incrociate tra di loro per dare vita alla seconda generazione ﬁliale F2 dove però riappare il colore bianco nel 25% delle piante. Ques? stessi passaggi Mendel li ripete per tuY e 7 i cara=eri. I cara=eri sono controlla? dai geni, i geni non sono tuY uguali ma si presentano in forme alterna?ve chiamate ALLELI L’allele dominante(espresso dalla le=era maiuscola) è quello che si esprime nella generazione F1, viceversa l’allele recessivo(espresso dalla le=era minuscola) è quello che sembra scomparire ovvero il ﬁore bianco. Le linee pure, dal punto di vista geno?pico, erano degli omozigo? ed il gene che controllava il colore del ﬁore era presente in due forme alleliche ma iden?che infaY nella linea pura a ﬁori viola c’era un omozigosi dominante, nella linea pura a ﬁori bianchi invece c’era un omozigosi recessiva. Chiaramente le piante della F1 erano invece eterozigo? e l’allele dominante dominava su quello recessivo quindi feno?picamente le piante erano a ﬁori viola ma geno?picamente non erano come le piante liea pure parentale. Nella meiosi abbiamo visto che i cromosomi sono delle sequenze di geni localizza7 sullo stesso cromosoma e ciascun gene controlla un cara8ere. Abbiamo de8o che le piante parentali(linee pure)sono in condizioni di omozigosi quindi se chiamiamo P il gene che controlla il colore del ﬁore nella pianta linea pura a ﬁori viola geno7picamente sarà PP, la pianta a ﬁori bianchi sarà pp. Quando queste due piante generano game7 ogni gamete per quel gene avrà una copia sola(aploide). Le piante della F1 saranno quindi tu8e eterozigo7 Pp che generano per il 50% game7 con P e per il 50% game7 con p. Incrociando la F1 si oJene la F2 con rapporto geno7pico 1 PP: 2 Pp: 1pp e rapporto feno7pico 3viola e 1bianco. INCROCIO DIIBRIDO Mendel dopo l’incrocio monoibrido decide di voler proseguire con un incrocio diibrido cioè non considera un solo cara=ere per volta ma due contemporaneamente, l colore del seme(verde-giallo) e la forma del seme(liscio-rugoso). La generazione parentale era composta da una pianta a ﬁori gialli e lisci SSYY l’altra a semi verdi e rugosi ssyy, dall’incrocio si oYene la F1 con tuY semi gialli e lisci. Successivamente nella generazione F2 ricompare sia il colore verde che l‘aspe=o rugoso del seme. DOPO DI MENDEL Dopo di lui tan? iniziarono a fare esperimen? simili. Nel 1909 Thomas Hunt Morgan con i suoi collaboratori decise di studiare il moscerino della fru=a (Drosoﬁla) che pur non essendo una pianta aveva un tempo di rigenerazione breve e un elevato numero di progenie. Incrocia una drosoﬁla dal corpo grigio e le ali normali con un’altra dal corpo nero e le ali corte. Il colore grigio e le ali normali sono i cara=eri dominan? quindi la prima sarà una drosoﬁla eterozigote BbVv mentre l’altra che feno?picamente manifesta il cara=ere recessivo sia per il colore del corpo che per la lunghezza delle ali sarà un’omozigote recessivo bbvv. Chiaramente si aspe=ava di o=enere delle drosoﬁle che avevano tuY i possibili feno?pi in rappor? tuY uguali fra di loro; invece, oYene che la maggior parte delle mosche risultante da questo incrocio aveva il feno?po parentale, tranne circa 200 che avevano il feno?po ricombinante. Quindi diﬀerente dalla condizione di Mendel il gene B e il gene V erano sullo stesso cromosoma, dunque, non vengono separa? durante la meiosi ma rimangono associa?. Come si spiegano allora quelle 200 drosoﬁle che avevano il feno?po ricombinante: in prima divisione meio?ca, prima della separazione delle copie di omologhi, può veriﬁcarsi il crossing over ovvero lo scambio di traY di DNA fra croma?di non fratelli di cromosomi omologhi quindi evidentemente ques? feno?pi ricombinan? erano il risultato del crossing over. Ovviamente ques? studi furono molto importan? perché permisero a Morgan e i suoi collaboratori di costruire in base alla frequenza di ricombinazione delle mappe cromosomiche in cui la distanza dei geni sul cromosoma veniva espressa in termini di unità di mappa. Ricapitolando: lo scopo era capire dove ques? geni erano ﬁsicamente localizza? sul cromosoma come una sorta di mappa cromosomica e riescono a farlo osservando la frequenza di ricombinazione, che si trova facendo il rapporto tra N di progenie ricombinante e N progenie totale basandosi sul fa=o che geni più distan? sul cromosoma subiscono più facilmente il crossing over rispe=o a quelli vicini. Grazie a questo approccio sono state costruite molteplici mappe per diverse specie. Ci sono state però diverse scoperte di eccezioni: DOMINANZA INCOMPLETA Non sempre la forma allelica dominate riesce a dominare sulla recessiva. In questo caso come generazione parentale c’è una pianta a ﬁori bianchi rr e una a ﬁori rossi RR ma dopo il primo incrocio la F1 esprime il colore rosa e nella seconda generazione F2 ricompare sia il colore bianco e rosso. Questo è un esempio di dominanza incompleta dove probabilmente il gene R che controlla il colore del ﬁore, codiﬁca per un enzima che catalizza la conversione di un substrato in un pigmento, se la forma allelica dominante codiﬁca per un enzima aYvo e la forma allelica recessiva codiﬁca per la forma non aYva di un enzima la pianta avrà solo metà degli enzimi funzionan? quindi la quan?tà di pigmento non è suﬃciente a conferire il colore rosso al ﬁore. EPISTASI Un altro esempio è l’epistasi, in cui la presenza di una coppia allelica recessiva (aa), che altera la produzione di melanina, va a coprire qualsiasi altra coppia di alleli non stre=amente dominante (quindi bb oppure bB) Esistono dei topolini che indipendente che abbiamo il geno?po BB,Bb,bb, se hanno un altro gene in questo caso il gene a in condizione omozigosi recessiva, quel topolino sarà albino ed avrà il mantello apigmentato poiché il gene a blocca la produzione di tuY i pigmen?. EREDITA’ CITOPLASMATICA In questo caso, l’aspe=o del ramo indipendentemente dal feno?po del ramo del genitore maschio, chi controlla la trasmissione del cara=ere è sempre il genitore del genitore femmina. Nella cellula eucariote ci sono degli organuli in par?colare il mitocondrio e il cloroplasto che contengono un proprio genoma, in questo caso si parla di eredità citoplasma?ca o materna considerando meccanismi di trasmissione di quei cara=eri controlla? da geni non che si trovano su i cromosomi del nucleo della cella ma appunto codiﬁca? dal genoma di ques? organuli. ALLELI MULTIPLI: GRUPPI SANGUIGNI Finora abbiamo de=o che i geni si presentano in due forme alleliche, allele dominante e allele recessivo. Ma talvolta un gene si presenta non in due ma in forme alleliche mul?ple. L’esempio dei gruppi sanguigni è infaY un esempio di allelia mul?pla. I gruppi sanguigni sono determina? gene?camente quindi vengono seguite le leggi mendeliane della trasmissione di ques? cara=eri. Come sappiamo i gruppi sanguigni sono fondamentali durante le trasfusioni, una trasfusione errata infaY può provocare una grave risposta immunitaria. La risposta immunitaria è contro la superﬁcie dei globuli rossi dove si trovano degli an?geni(o carboidra? lega? a delle proteine di membrana o lipidi di membrana) Esistono 32 sistemi di gruppi sanguigni i più importan? dei quali sono il sistema ABO e Rh+ e Rh-. Il sistema ABO è cara=erizzato da 4 gruppi determina? da 4 stru=ure diverse degli oligosaccaridi espos? sulla superﬁcie dei nostri globuli rossi. Quindi l’an?gene è un oligosaccaride formato da una stru=ura di base di 5-13 zuccheri che terminano con fucosio e gala=osio. - Negli individui A alla stru=ura base è legato una N-ace?l gala=osammina - Negli individui B alla stru=ura base è legato un gala=osio Questa diﬀerenza è dovuta alle mutazioni che hanno colpito il gene che codiﬁca per una glicosil-transferasi, cioè un enzima che a=acca gli zuccheri portando alla formazione della glicoproteina. Il gene che codiﬁca per la glicosil-transferasi si trova sul cromosoma che potrà trovarsi nella popolazione in più di due forme alleliche, in par?colare nella popolazione si trova in 3 possibili forme alleliche. 1. L’allele (iA) l’enzima riconosce e lega una N-ace?l gala=osammina 2. L’allele (iB) l’enzima riconosce e lega un gala=osio 3. l’allele (i) l’enzima non dà luogo ad alcun prodo=o Gli alleli (iA) (iB) sono dominan? su (i) e codominan? fra di loro. Il sistema RH è controllato da due geni (RHD e RHCE) che codiﬁcano per dei canali ionici. Mentre la proteina D ha un’aYvità an?genica forte, l’HCE è una proteina con debole aYvità an?genica. Circa l’85% della popolazione umana presenta l’an?gene D sulla membrana dei globuli rossi, il 15 % ne è sprovvisto e produce an?corpi an?-D. Principalmente l’immunizzazione si determina durante trasfusioni di sangue o per il passaggio di globuli rossi dal feto alla madre a=raverso piccole lesioni della placenta che si veriﬁcano sopra=u=o nelle ul?me seYmane di gravidanza e al momento del parto. Quando una madre Rh- porta un feto Rh+ (cara=ere ereditato dal padre) si crea una situazione di incompa?bilità materno-fetale, in realtà con la prima gravidanza non ci saranno problemi al feto poiché al termine della prima gravidanza la madre verrà immunizzata contro il fa=ore Rh senza gravi conseguenze perché la produzione di an?corpi richiede un certo tempo e la risposta (primaria) è di bassa intensità. In caso di una seconda gravidanza invece, la madre, già immunizzata, s?molerà una massiccia produzione di an?corpi (immunoglobiline di ?po G, IgG, risposta secondaria), che passeranno nel sangue fetale a=raverso la barriera placentare provocando una grave anemia emoli?ca del neonato che può portare alla morte del feto. IL SESSO E’ DETERMINATO DAI CROMOSOMI SESSUALI Come sappiamo il sesso è determinato dai cromosomi sessuali in par?colare a determinarlo è lo spermatozoo con il cromosoma X o Y. Il cromosoma X rispe=o al cromosoma Y con?ene più geni e ha delle dimensioni più importan?, quindi, è chiaro che geni localizza? sul cromosoma X saranno di maggior numero nelle donne in quanto hanno due cromosomi X. Per questo si veriﬁca nella specie umana un meccanismo che porta all’inaYvazione casuale di uno dei due cromosomi X nelle cellule soma?che. Il cromosoma X inaYvato è de=o CORPO DI BAR, è un ?pico esempio di eterocroma?na facoltataiva e chiaramente i geni su quel cromosoma non verranno espressi data l’inaYvazione del cromosoma stesso. L’inaYvazione casuale dell’ X può risultare evidente nel feno?po. Per esempio, topi e gaY hanno parecchi geni X-linked che controllano il colore del mantello. Le femmine eterozigo? per tali geni posso presentare chiazze di un colore nel mantello in mezzo ad altre di colore diverso. Tale fenomeno prende il nome di VARIEGAZIONE ed è evidente nei gaY tartaruga. Quando si deve quindi considerare la trasmissione di cara=eri controlla? da geni presen? sul cromosoma X, come per esempio il gene che controlla la visione del colore e quindi in forma recessiva il daltonismo. Questo gene è localizzato sul cromosoma X e quindi in quel caso non si può ignorare il fa=o che i maschi saranno in una condizione di omozigosi quindi avranno quella forma allelica che, se sarà recessiva, l’individuo sarà malato. Le femmine per essere malate devono essere omozigo? recessive. Se si ha un’eterozigosi allora sarà una portatrice sana 19/12 Lezione 19/12 I VIRUS Sono entità biologiche, non sono viventi, non hanno struttura cellulare, non hanno metabolismo; ma sono costituite da macromolecole quali acidi nucleici, proteine… Sono parassiti, infatti devono necessariamente infettare un ospite; endoparassiti cellulari obbligati. I virus sono quindi delle entità biologiche costituite da macromolecole che, per stabilire con l’ospite una relazione di parassitismo (=la cellula infettata ha degli svantaggi mentre il virus ha dei vantaggi in termini di riproduzione), si impossessa di tutto il macchinario biosintetico della cellula, sia per replicare il proprio genoma, sia per esprimere le proprie proteine. Il genoma di un virus può essere a DNA o a RNA NB: Nei viventi il materiale ereditario può essere solo il DNA! Esistono dei virus il cui genoma è sì rappresentato da una molecola di acido desossiribonucleico, ma SS (=single strand, a singolo filamento); idem per quanto riguarda l'RNA che abbiamo sempre conosciuto come una molecola a singolo filamento, nel caso dei virus può essere sotto forma di double strand RNA, quindi una molecola di RNA a doppio filamento. La molecola di RNA a doppio filamento scatena nelle cellule un complesso di rischio, perché questo double strand RNA viene processato (da quegli enzimi che maturano, modellano modificano questi duplex di RNA), lasciando di fatto un corto frammento di RNA che inglobato in un complesso proteico, di cui fanno parte le proteine argonauta, guiderà questo corto RNA a una sequenza complementare su un mRNA target, la cui traduzione verrà inibita o addirittura quell'mRNA (se la complementarità è perfetta) potrà essere degradato, e non verrà più tradotto. Capside virale: involucro proteico che protegge il genoma virale, costituito da capsomeri. Pericapside/ Mantello: Rivestimento di natura lipoproteica, simile alla membrana plasmatica. (Il pericapside non è presente in tutti i virus). Spicole proteiche: proteine spike presenti nel pericapside, codificate dal genoma virale,e implicate nella gemmazione. La morfologia del capside proteico è un criterio di classificazione -> in foto avete degli esempi, certamente vedete che la morfologia geometrica o molto complessa del capside caratterizza i diversi tipi di virus. In alto vedete il capside elicoidale di un virus che infetta cellule vegetali. Al centro invece un capside geometrico poliedrico di un adenovirus. In fondo riconoscete il capside complesso con la testa, la coda, le fibre della coda di un batteriofago di cui abbiamo più volte parlato (vedi esperimento di Hersey e Chase, Crick e Brenner). I virus sono altamente specifici non solo per la specie infettata ma addirittura per il tipo cellulare, quindi sono caratterizzati da un elevatissimo tropismo (quindi quel virus infetterà quel vivente e in particolare nel caso sia un pluricellulare, solo alcuni tipi di cellule). Il riconoscimento da parte del virus dell'ospite si basa dal punto di vista molecolare su interazioni proteina-proteina altamente specifiche tra una proteina del virus e il la proteina dell'ospite, espressa nell’ospite sulla superficie della membrana cellulare (molto spesso, questi virus utilizzano dei recettori espressi nella membrana della cellula che quella cellula usa fisiologicamente per la sua segnalazione; quindi questi virus entrano sfruttando un apparato molecolare, diciamo, comunque presente sulla cellula). Una volta riconosciuta una cellula ospite, si verifica l'infezione vera e propria: da parassita endocellulare obbligato qual è, il virus o comunque il suo genoma deve entrare all'interno 19/12 dell'ospite dove, in quanto parassita, si impossessa di tutto ciò che serve per duplicare il suo DNA; quindi il citoplasma della cellula ospite diventa proprio una fabbrica in cui nuovi virioni vengono assemblati. BATTERIOFAGI I batteriofagi sono dei virus che infettano i batteri, che possono essere caratterizzati da un ciclo infettivo di tipo litico (dove la cellula batterica infettata verrà lisata), oppure un ciclo lisogeno (che può generare lisi, ma che prevede, almeno in una fase iniziale, l’integrazione del genoma virale nel cromosoma batterico). E questa integrazione del genoma in un certo senso fa acquisire nuove caratteristiche al batterio che, per esempio, può essere protetto (una sorta di immunità da altre infezioni da parte di batteriofagi), ma può anche diventare capace di rilasciare certe tossine che in assenza del fago integrato nel suo genoma non avrebbe potuto rilasciare. RICAPITOLANDO: le fibre della coda del capside in interazione proteina-proteina riconoscono la cellula da infettare.A quel punto (come una siringa) per contrazione della coda, il genoma viene inserito all'interno. Questo genoma nel batteriofago è genoma costituito da DNA, molecola di DNA lineari, che poi all'interno della cellula circolarizzano. Nel caso del batteriofago dopo che è avvenuto lo specifico riconoscimento da parte del virus della cellula ospite il capside proteico rimane fuori. A questo punto, nel ciclo litico, il DNA fagico circolarizzato, viene duplicato più volte, ma anche i geni contenuti in esso vengono espressi. Quindi il batterio diventa uno schiavo a vantaggio della riproduzione di nuovi virus che si autoassemblano nel citoplasma del batterio e in seguito a lisi verranno rilasciati all'esterno. Per quanto riguarda il genoma virale, ci saranno dei geni che vengono precocemente trascritti (subito dopo l'infezione), altri invece trascritti ed espressi più tardivamente. Alcuni geni hanno da una parte la funzione di stimolare la riproduzione del virus, e dall'altra di inibire le funzioni batteriche (per esempio uno di questi geni precocemente trascritti dall'RNA polimerasi batterica codifica per una proteina che va ad inibire la trascrizione dei geni della cellula batterica). 19/12 GENI PRECOCI GENI TARDIVI Quindi al fine di potenziare, di impossessarsi di tutto l'apparato biosintetico cellulare da una parte ci si impossessa di RNA polimerasi, tutti i nucleotidi, tutto ciò che serve per esprimere i geni virali e dall'altra parte si frena, si inibisce l'espressione dei geni batterici! La molecola di DNA circolare del batterio viene frammentata dopo una iniziale fase inibitoria dell'espressione di geni ed in fase di assemblaggio, quando il genoma virale viene incluso all'interno della testa del capside, può capitare che un frammento di DNA batterico possa essere incluso all'interno della testa del capside. Contestualmente tra questi geni precoci ci sono dei geni che codificano per proteine che invece stimolano la riproduzione del genoma virale, ma anche che stimolano la trascrizione di geni tardivi; quindi sono dei veri e propri fattori proteici con funzione regolatoria (vedi proteina CAP che stimolavano la trascrizione dei geni batterici). Quindi analogamente nel genoma virale, che ovviamente dimensioni è molto più piccolo del genoma batterico. La sequenza dei codoni che nei batteri (dove non c'è splicing, quindi non c'è da rimuovere prima della traduzione delle sequenze introniche non codificanti) E abbiamo detto che ciascun codone, ciascuna tripletta è costituita da nucleotidi che non fanno parte della tripletta successiva, cioè quella parte del codone non viene letta più volte in modo sovrapposto. Invece di nuovo, un'altra eccezione in questo mondo virale, proprio perché il genoma virale è minuscolo, e date le dimensioni piccolissime di queste entità biologiche, ci sono degli hot spot, in cui la RNA polimerasi scivola, cambiando cornice di lettura. ——————————————————————————————————————————— —>Il riconoscimento del tipo di cellula da infettare nell’ospite si basa su interazioni proteinaproteina, molto spesso i virus utilizzano recettori cellulari presenti fisiologicamente nell’ospite per penetrarvi. Il virus usa l’RNA polimerasi, i ribosomi, i nucleotidi, ecc della cellula ospite per assemblare nuovi virus Il citoplasma della cellula ospite diventa una fabbrica di virioni, la cui liberazione dipende dal ciclo infettivo del virus o per gemmazione. BATTERIOFAGI Virus che infettano i batteri, che possono essere caratterizzati da un ciclo infettivo di tipo litico, o di tipo lisogeno. Dopo che è avvenuto il riconoscimento, il capside rimane fuori, come in una siringa il genoma viene spinto all’interno della cellula ospite, il dna fagico assume forma circolare, mentre il capside “ghost” si stacca. 19/12 I geni virali sono regolati da un punto di vista temporale, ci saranno dei geni trascritti ed espressi subito, altri espressi tardivamente. Al fine di impossessarsi di tutto l’apparato biosintetico batterico, si inibisce la trascrizione del batterio per favorire la trascrizione dei geni virali. Alcuni farmaci provocano la escissione del genoma virale, portando così alla lisi. ——————————————————————————————————————————— RETROVIRUS: Dogma centrale della biologia-> DNA-trascrizione- RNA-traduzione-PROTEINE (il flusso dell’informazione genetica è sempre monodirezionale nei viventi) (Telomerasi: enzima che catalizza l’allungamento dei telomeri, a dna-polimerasi su stampo di RNA.) Alcuni virus possono fare traduzione e trascrizione inversa, potendo quindi, a partire dall’RNA, ottenere il DNA. I retrovirus hanno genoma a RNA, ma il ciclo infettivo prevede che il genoma si integri nella cellula ospite, e perciò deve essere retrotrascritto a DNA. Poichè il genoma virale deve integrarsi, deve essere retrotrascritto; ciò è possibile grazie ad un enzima che si chiama trascrittasi inversa (dna polimerasi rna dipendente). MECCANISMI DI TRASFERIMENTO ORIZZONTALE: CONIUGAZIONE, TRASFORMAZIONE, E TRASDUZIONE DEL SEGNALE La coniugazione è resa possibile dal plasmide F, che può integrarsi nel genoma del batterio, dando luogo ad una cellula Hfr (=grande frequenza di ricombinazione). La cellula donatrice, che ha il plasmide F integrato nel cromosoma della cellula ospite, potrà sempre coniugare con una cellula F- ricevente che non ha il plasmide di fertilità ma che lo riceverà attraverso il ponte di coniugazione. Tuttavia è raro che il ponte di coniugazione resti integro durante tutto il processo (si tenta infatti di fare una copia di tutto il genoma), pertanto solo una parte di genoma viene trasferita. Può dunque verificarsi una ricombinazione: la cellula F- ricevente, in seguito al trasferimento incompleto, 19/12 sarà una cellula ricombinante. MECCANISMI DI TRASDUZIONE DEL SEGNALE Capacità di rispondere a stimoli che devono evocare una risposta biologica nella cellula, che prevede una cascata di segnalatoria. Già conoscete le segnalazioni ENDOCRINA E ESOCRINA Mediatori locali: fattori che agiranno su cellule vicine o sulla cellula stessa= segnalazione PARACRINA/AUTOCRINA NB: Ci sono vescicole extracellulari (EV=Esosomi/Ectosomi), tutte le cellule rilasciano queste vescicole. Queste vescicole contengono proteine, acidi nucleici, miRNA, RNA, frammenti di DNA. Quindi c’è una cellula donatrice che rilascia queste vescicole che troveranno una cellula bersaglio con cui si fondono per rilasciare il loro contenuto all’interno. Tuttavia si stanno studiando approfonditamente queste vescicole perché possono essere rilasciate sia da cellule malate che da cellule sane; ma si vorrebbe anche usare queste vescicole come dei vettori, poiché si potrebbero caricare di farmaci o anticorpi, il che sarebbe ottimale se si riuscisse a veicolare certe vescicole alle cellule tumorali ad esempio. Sulla base della natura del segnale il recettore potrà essere esposto sulla superficie oppure all’interno della cellula. Il ligando, che verrà riconosciuto da un recettore, è polare poiché di natura idrofilica (= quindi non può attraversare la membrana-> il recettore che riconosce il ligando idrofilico deve essere esposto sulla membrana) Se invece il ligando è una piccola molecola di natura idrofobica, non avrà problemi ad attraversare la membrana, ed il recettore si troverà nel citoplasma. Si forma un complesso recettore-ligando che porta alla TRASDUZIONE del segnale. Meccanismo di amplificazione: per ogni passaggio il segnale amplifica sempre di più la risposta; grazie all’amplificazione che si verifica ad ogni passaggio della cascata segnalatoria, per una molecola di ligando ottengo una risposta concreta. 19/12 Enorme interesse per la drugability del farmaco: costruire farmaci che regolano i recettori che modulano tante risposte biologiche. Questi recettori, accoppiati a proteine G, che attraversano la membrana 7 volte, quindi ci sarà un’estremità della proteina che sporge all’esterno (amminoterminale) e una che sporge all’interno del citoplasma (carbossiterminale). L’estremità cabossiterminale può contenere una serie di siti importanti per il funzionamento del recettore. Le proteine G sono eterotrimeriche (Galpha, Gbeta, Ggamma) che funzionano come degli interruttori: il ligando viene riconosciuto e si forma il complesso recettore-ligando, il recettore si attiva e scatena la cascata di eventi, reclutando le proteine G a cui si accoppia il recettore. Le tre subunità sono inizialmente attaccate, ma quando le proteine G si accoppiano al recettore, le subunità gamma e beta si staccano dalla subunità alpha (quella che lega il GDP= guanosin difosfato), che ora non lega il GDP ma il GTP. Fintanto che la subunità alpha è GDP legata, questa attiva la cascata dei segnali; ed ha attività GDPasica, quindi ha il meccanismo endogeno per spegnersi. Un altro messaggero importantissimo è lo ione Ca, i cui livelli sono generalmente tenuti bassi nella cellula, così che possano aumentare in risposta ad una segnalazione. (Il RE può essere un magazzino di ioni Ca, è da questi depositi intracellulari che poi gli ioni vengono rilasciati al bisogno) 29/12 La CALMODULINA è una proteina che può legare 4 ioni Ca, il complesso calcio-calmodulina attiva la proteina cambiando la conformazione della proteina e si può legare a proteine bersaglio a loro volta attivate e che scatenano quei segnali che portano ad evocare la risposta cellulare. (NON SBAGLIATE A DIRE CHE OGNI PROCESSO BIOLOGICO CELLULARE è MEDIATO DA CALCIO) Stimoli diversi evocano risposte biologiche diverse. Ci sono altri recettori di membrana che per non sono legati a proteine G, ad esempio i recettori con attività (enzimatica endogena) tirosino-chinasica (=nella coda citosolica del recettore ci sono una serie di residui di tirosine, uno di seguito all’altro); quando il ligando arriva va a legarsi nel sito di legame del recettore che è esposto all’esterno, questo complesso posta alla dimerizzazione (=sulla membrana si forma un dimero, due recettori con attività chinasica) ed un recettore, con la sua attività chinasica intrinseca, fosforila le citosine nella coda citosolica dell’altro, e viceversa. Dopo la dimerizzazione, si verifica una trensfosforilazione (=un recettore fosforila la coda citosolica dell’altro). I gruppi fosfato che fosforilano i residui tirosinici fanno sì che vengano reclutate delle proteine che riconoscono i gruppi fosfato delle tirosine fosforilate. Si arriva fino a dentro al nucleo, dove verrà promossa la trascrizione di specifici geni. SPEGNERE IL SEGNALE Ci sono diversi scenari, ad esempio il recettore, dopo che ha legato il proprio ligando, viene internalizzato e poi può subire destini diversi. C’è una fase di refrattarietà in cui una cellula, anche se è subito stimolata con quel ligando, non può rispondere allo stimolo perché il recettore è stato in

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