Manual Teórico-Práctico de Biología Celular 2024 PDF

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Primera edición MANUAL TEÓRICO-PRÁCTICO DE BIOLOGÍA CELULAR D.C. Karla Rojas Valderrama D.C. Erick Martínez Hernández Dra. Irene Isabel Martínez Guevara Dr. Efrén Durand Aguilar Dra. Patricia Mayeli Quechol Tecuatl D.C. Noe Velázquez Márquez Primera edición MAN...

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Primera edición MANUAL TEÓRICO-PRÁCTICO DE BIOLOGÍA CELULAR D.C. Karla Rojas Valderrama D.C. Erick Martínez Hernández Dra. Irene Isabel Martínez Guevara Dr. Efrén Durand Aguilar Dra. Patricia Mayeli Quechol Tecuatl D.C. Noe Velázquez Márquez Primera edición MANUAL TEÓRICO-PRÁCTICO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR Agregar texto 1 Práctica 1 USO Y MANEJO DEL MICROSCOPÍO OBJETIVO Identificar las partes y aprender el uso adecuado del microscoío óptico durante actividades en el laboratorio. MATERIALES Microscopio óptico Laminillas con muestras preparadas Cubreobjetos Introducción. El término "microscopía" tiene sus raíces en el griego antiguo, donde "mikros" significa pequeño y "skopein" se traduce como observar. Aunque el término en sí es relativamente moderno, la idea de examinar objetos pequeños se remonta a la antigüedad. Los primeros intentos de ampliar la visión humana se atribuyen a los griegos, quienes utilizaban esferas de cristal llenas de agua para magnificar objetos. Sin embargo, el desarrollo real de la microscopía comenzó en el siglo XVII con la invención del microscopio óptico. El holandés Zacharias Janssen y su padre Hans Janssen son a menudo acreditados como los pioneros en la creación del primer microscopio compuesto alrededor de 1590. Este dispositivo, compuesto por dos lentes, permitía la observación de objetos con una ampliación significativa. Posteriormente, el científico italiano Galileo Galilei mejoró la invención alrededor de 1609, después Anton van Leeuwenhoek, dio un salto revolucionario al producir microscopios con una única lente esférica que alcanzó una resolución sin precedentes para la época, permitiéndole la observación de microorganismos en una gota de agua y por lo que se le conoce como el padre de la microscopía. En el siglo XX, la invención del microscopio electrónico marcó otro hito importante, permitiendo a los científicos explorar estructuras a una escala mucho menor lo que llevó al descubrimiento de organelos celulares y proporcionó una visión más detallada de la complejidad celular. 5  Con el advenimiento de la microscopía, los científicos pudieron confirmar visualmente la teoría celular propuesta por Matthias Schleiden y Theodor Schwann en 1839. Esta teoría sostenía que todos los seres vivos están formados por células y que la célula es la unidad estructural y funcional de la vida. Cabe mencionar a Rudolf Virchow, ya que gracias a su investigación se supo que todas las células resultan de la división de células preexistentes. Además de su importancia en la consolidación del dogma, la microscopía ha demostrado ser esencial en numerosos campos, desde la medicina hasta la investigación científica. En medicina, los avances en la microscopía han permitido diagnósticos más precisos al examinar tejidos y células a nivel microscópico. En investigación, desde el descubrimiento de la célula por Robert Hooke gracias a su invención del primer microscopio compuesto, hasta la actualidad, ayuda a nuevas terapias y tratamientos médicos. La tecnología moderna ha llevado la microscopía a niveles extraordinarios, con microscopios de fluorescencia, microscopios de fuerza atómica y microscopios de barrido electrónico, entre otros, que permiten explorar estructuras aún más pequeñas y detalladas, marcando así la historia de la ciencia con cada lente enfocada en lo microscópico. Microscope Leeuwenhoek (s f.) https://campus.usal.es/~histologia/museo/Microscopios/museo04.htm 2 Práctica 1  Conceptos importantes sobre el microscopio. La óptica, es la rama de la física que estudia la luz y su comportamiento, así como las interacciones con la materia. : Espectro de luz: Se refiere a la distribución de colores que componen la luz visible. La luz blanca, como la proveniente del sol, es en realidad una mezcla de colores. El espectro visible abarca desde el rojo (con longitudes de onda más largas) hasta el violeta (con longitudes de onda más cortas). Un ejemplo clásico que ilustra el espectro de luz es el arcoíris, donde la luz solar se descompone en haces de luz coloreados al pasar a través de las gotas de agua en la atmósfera, creando una banda de colores. Límite de resolución: Capacidad de un instrumento óptico para distinguir dos puntos cercanos como entidades separadas. En microscopía, un límite de resolución más bajo puede significar que dos estructuras celulares cercanas no se pueden distinguir con claridad. Poder de resolución: Capacidad de un sistema óptico para formar imágenes nítidas y distinguir detalles finos, es decir, un microscopio con un alto poder de resolución puede revelar estructuras celulares más pequeñas, proporcionando una visión detallada de muestras biológicas. Mientras que un microscopio con un poder de resolución más bajo puede no ser capaz de distinguir detalles finos, limitando la capacidad de estudio de estructuras microscópicas. 2 Práctica 1  Poder de aumento: Capacidad para agrandar la imagen de un objeto. Por sí solo no garantiza una visión detallada; Por ejemplo, en un microscopio, un ocular con un poder de aumento de 10x combinado con un objetivo de 40x proporcionará un poder de aumento total de 400x. Sin embargo, si el sistema carece de poder de resolución, la imagen ampliada puede carecer de detalles. Imagen real y virtual: Este concepto describe cómo percibimos visualmente la posición de un objeto. Una imagen real se forma cuando los rayos de luz convergen en un punto específico después de pasar a través de una lente o un espejo. En contraste, una imagen virtual se forma cuando los rayos de luz parecen provenir de un punto que no es el lugar real de formación de la imagen. Un espejo convexo, por ejemplo, puede crear una imagen virtual de nuestro rostro que parece estar detrás del espejo, aunque no existe un objeto real en ese lugar. 2 Práctica 1  Tipos de microscopio. Óptico. El microscopio óptico, también conocido como microscopio de luz, es el tipo más común y familiar. Utiliza luz visible para iluminar y magnificar las muestras. Su funcionamiento se basa en la refracción de la luz a través de lentes, permitiendo la observación de objetos en el rango de micrómetros. Es ampliamente utilizado para examinar muestras transparentes o teñidas. Serna, N. (2012). Microscopio óptico y sus componentes. https://accessmedicina.bibliotecabuap.elogim.com/ViewLarge.aspx? figid=95222900&gbosContainerID=0&gbosid=0&groupID=0&sectionId=95222892&multimediaId=undefined Electrónico de Transmisión (TEM). El microscopio electrónico de transmisión utiliza haces de electrones en lugar de luz visible para obtener una resolución extremadamente alta. Que permite una visualización detallada de estructuras internas de células y materiales a nivel nanométrico. 2 Práctica 1  Electrónico de Barrido(SEM). A diferencia del TEM, el microscopio electrónico de barrido genera imágenes al escanear la superficie de la muestra con un haz de electrones. Esto proporciona una visión tridimensional detallada de la topografía de la muestra. El SEM es valioso para estudios en geología, biología, y ciencias de materiales, entre otros campos debido a su aumento de 10x a 300,000x. Campo oscuro (SEM). En el microscopio de campo oscuro la muestra se ilumina en forma oblicua o en parábola y solo la luz dispersada por la muestra llega al objetivo. Esto crea un fondo oscuro alrededor de la muestra, resaltando las estructuras o partículas que dispersan la luz. Es particularmente útil para observar organismos vivos sin necesidad de tinción, como es el caso de Treponema Pallidum (agente causal de la sífilis), ya que proporciona un contraste significativo. 2 Práctica 1  Luz Polarizada. Este tipo presenta un funcionamiento en que las ondas de luz viajan en una sola dirección a diferencia de la luz normal que viaja en direcciones aleatorias. Esto nos genera que los componentes fibrosos y cristalinos sean observados con una orientación diferente ya que son atravesados por distinta velocidad de la luz, es decir los veríamos desfasados entre si, lo que se denomina birrefringentes o anisótropos, al contrario de los isótropos, que no modifican el rayo luminoso. Ademas usa dos componentes especiales que es un polarizador que convierte el rayo de luz convencional en luz polarizada, este se encuentra fijo y situado entre la fuente de luz y el objetivo, es decir, antes de la muestra. El analizador es el que determina la intensidad de la imagen observada, debido a que tiene posibilidad de ser girado y este se encuentra antes del ocular, es decir, después de la muestra. Saavedra, J., & Dominguez, A. (2014). Fotomicrografía de tejido óseo compacto; Fotomicrografía de fibras musculares estriadas. https://accessmedicina.bibliotecabuap.elogim.com/ViewLarge.aspx? figid=103761748&gbosContainerID=0&gbosid=0&groupID=0&sectionId=98181904&multimediaId=undefined Luz Ultravioleta. Utiliza luz ultravioleta para excitar fluorocromos presentes en la muestra. La fluorescencia resultante produce una imagen brillante y detallada, especialmente útil en biología celular y molecular. El microscopio de luz ultravioleta es esencial para técnicas de inmunofluorescencia y etiquetado de proteínas. Estereoscópico. También conocido como microscopio de disección o microscopio binocular, presenta dos oculares y dos sistemas ópticos independientes para cada ojo. Esta disposición permite que la muestra se vea desde dos ángulos ligeramente diferentes, dando una imagen en 3D. Serna, N. (2012). Microscopio estereoscópico y sus componentes junto con un embrión de pollo completo. https://accessmedicina.bibliotecabuap.elogim.com/ViewLarge.aspx? figid=95222902&gbosContainerID=0&gbosid=0&groupID=0&sectionId=95222892&multimediaId=undefined 2 Práctica 1  Fuerza Atómica (AFM). Este tipo de microscopio utiliza una sonda puntiaguda muy fina cuyo extremo se aproxima a un solo átomo, esta se encuentra montada en un soporte flexible lo cual le permite colocarse hasta 1 nm de la muestra. Además, la superficie del soporte es reflectante y un haz de láser se proyecta desde ahí hasta un diodo Esta sonda tiene movimientos automáticos hacia arriba y hacia abajo debido a las irregularidades de la superficie, estos movimientos son transmitidos a una computadora que crea una imagen a través de estos. Entre sus ventajas es que la muestra no es necesario que este al vacío, sino que también puede encontrarse en algún medio como el agua, lo que permite observar células vivas. Iwasa, J., & Marshall, W. (2020). Miosina V: una miosina no convencional de dos cabezas involucrada en el transporte de organelos. https://accessmedicina.bibliotecabuap.elogim.com/ViewLarge.aspx? figid=251489786&gbosContainerID=0&gbosid=0&groupID=0&sectionId=249682743&multimediaId=undefined De Contraste de Fases. Este microscopio aprovecha las diferencias en la fase de la luz para crear imágenes detalladas de muestras transparentes. permitiendo la visualización de detalles que de otra manera serían imperceptibles. Este tipo de microscopio permite identificar células si teñir ya que aumenta el contrate entre las partes claras y oscuras. esquema de microscopio de contraste de fases. Imagen recuperada de:https://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1010/815/3/TDIPICYTG8R42015.pdf Invertido. El microscopio presenta un diseño único al posicionar el lente objetivo debajo de la platina. Esta inversión estructural permite observar muestras voluminosas o cultivos celulares en recipientes de cultivo, como placas de Petri o frascos de cultivo. 2 Práctica 1  De Efecto Túnel. Presenta una sonda ultrafina además de conductora, se aplica electricidad entre la punta y la muestra, es importante mencionar que cuando la punta se encuentra a una distancia de aproximadamente 10 Å de la muestra los electrones viajan hacia la punta o túnel y este efecto se da gracias que tanto la punta como la muestra son conductores o semiconductores. El barrido que se genera sobre la muestra es debido a acentuadores piezo eléctricos que lo hacen en forma de Z. Finalmente esta información es procesada por una computadora que nos genera una imagen. Diagrama de funcionalidad del microscopio de efecto tunel. Imagen recuperada de: https://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_efecto_t%C3%BAnel#/media/Archivo:Rastertunnelmikroskop-schema_es.svg Fluoroscopia. El fluoroscopio es un tipo de microscopio utilizado para obtener imágenes en tiempo real de estructuras internas del cuerpo humano, como el corazón o los pulmones, mediante la radiación. Es esencial en procedimientos médicos como la angiografía y la visualización en tiempo real de intervenciones médicas.Su mecanismo se basa en los fluorocromos (moléculas) que son capaces de absorber luz en una longitud de onda específica y emitir luz a una longitud de onda mayor, produciendo un fenómeno conocido como fluorescencia. *Iluminación de Köhler: Es una técnica de iluminación uniforme hacia la muestra desde una fuente de iluminación no uniforme (como el filamento de una lampara). Esta elimina la iluminación dispareja en el campo de observación. Existen dos tipos de iluminación de Köhler. Trasmitida: la luz atraviesa la muestra (usada en el microscopio óptico). Incidental: la luz se refleja en la muestra (usada en metales). 2 Práctica 1  Sistemas del microscopio óptico. El microscopio óptico es un instrumento el cual nos produce una imagen ampliada de una muestra que se desee observar. Para apreciar con claridad al microscopio, es esencial desglosar y comprender los sistemas que componen estos instrumentos, principalmente presentan los siguientes sistemas: Sistema mecánico Sistema eléctrico Sistema de iluminación Sistema óptico Sistema Mecánico: El sistema mecánico está diseñado para manipular y sostener al aparato. Este incluye: pie, columna, brazo, revólver, platina, tornillo macro y micrométrico. -Tubo: Es la pieza que conecta a los objetivos con el ocular y su función primordial radica en asegurar la alineación precisa entre las lentes. -Diafragma de campo luminoso: Se encuentra en la base del condensador y es el encargado de controlar la cantidad total de luz que ilumina a la muestra. -Diafragma de abertura: Se halla dentro del condensador cerca de su abertura, controlando así la cantidad de luz que llega a la lente del objetivo. -Pinzas: Están unidas a la platina y aseguran la firme sujeción de la muestra durante la observación. En microscopios contemporáneos, estas pinzas suelen estar conectadas a un carro con dos tornillos, permitiendo movimientos longitudinales y transversales para una observación precisa. 2 Práctica 1  -Porta filtros: Son estructuras diseñadas para sostener los filtros que permiten modular la luz que incide en la muestra y suelen estar debajo del condensador. -Hendidura para filtros: En algunos microscopios de técnicas avanzadas como el de fluorescencia existe un espacio para insertar los filtros de color o polarizadores. -Pie: También conocido como la base, es la parte inferior del microscopio y proporciona la base sólida sobre la cual se erige el resto del microscopio, asegurando la estabilidad durante la observación. -Columna: Es una estructura vertical que se eleva desde la base y sostiene la cabeza del microscopio. Ofrece soporte estructural y alinea los componentes ópticos para garantizar una observación estable y precisa. -Brazo: Es una pieza que conecta la cabeza del microscopio con la columna, a menudo ubicada en la parte superior del instrumento. Proporciona un asa para transportar el microscopio y ayuda a controlar el ángulo y la dirección de la cabeza durante la observación. -Revólver (o Turret): Es una estructura giratoria que sostiene varios objetivos. Permite al usuario cambiar fácilmente entre diferentes objetivos, cada uno con diferentes aumentos, sin tener que cambiar físicamente la lente. -Platina: Es una superficie plana ubicada debajo de la cabeza del microscopio y sobre la cual se coloca la muestra y tiene mecanismos de sujeción, como clips, para asegurarla durante la observación. -Tornillo micrométrico (de enfoque de precisión): También conocido como de ajuste fino, es un mecanismo de enfoque detallado y nítido que permite realizar ajustes en la distancia entre la muestra y los objetivos. -Tornillo macrométrico (de enfoque aproximado): O de ajuste grueso, es un mecanismo de enfoque que permite realizar cambios rápidos en la distancia entre la muestra y los objetivos. Permite un enfoque inicial y rápido, especialmente útil al cambiar de una muestra a otra. -Tornillo de Movimiento Lateral (X-Y): Algunos microscopios tienen tornillos que permiten el movimiento lateral de la muestra. Sistema Eléctrico. El sistema eléctrico de un microscopio es una parte esencial que contribuye al funcionamiento adecuado de diferentes componentes, como la alimentación (transformador, interruptor de encendido/apagado) y la electrónica (filtros que modifican la calidad o el color de la luz que incide en la muestra). Sistema de iluminación. La clave para desentrañar los secretos de estas diminutas maravillas reside en la iluminación precisa de la muestra. Este proceso es posible gracias a un sistema compuesto por tres elementos esenciales: La fuente de luz, los espejos y los filtros. 2 Práctica 1  -Luz natural: Es la luz del día, rica en espectro, que ofrece una amplia gama de longitudes de onda que permite visualizar detalles finos y contrastes sutiles en las muestras. La iluminación natural también varía a lo largo del día, proporcionando diferentes intensidades y tonalidades que pueden resaltar distintos aspectos de la muestra.El espejo utilizado en el microscopio para dirigir la luz natural puede ajustarse para optimizar la orientación de los rayos luminosos. La elección entre la cara plana y cóncava del espejo depende del uso del condensador y la fuente luminosa natural. Este enfoque dinámico permite al investigador adaptarse a las condiciones cambiantes de la luz ambiental para lograr una observación óptima. -Luz artificial: Proporciona una fuente de iluminación controlada y constante, independiente de las condiciones externas. Esta opción es especialmente útil en entornos de laboratorio, donde la consistencia en la iluminación es esencial para obtener resultados precisos y reproducibles. Cuando se utiliza luz artificial, el espejo cumple la función crucial de dirigir los rayos de manera paralela al eje óptico. La elección de la cara plana del espejo, en este caso, garantiza una distribución uniforme de la luz artificial, crucial para mantener la calidad de la observación. Además, los filtros de luz, situados estratégicamente debajo del condensador, permiten modular la longitud de onda de la luz, destacando componentes específicos de la muestra. Sistema Óptico. El corazón del microscopio es su sistema óptico, diseñado para manipular y enfocar la luz para revelar detalles microscópicos. -Objetivos: Estas lentes ópticas, comúnmente de cristal, están diseñadas para enfocar y ampliar la luz proveniente de la muestra. Cada objetivo tiene una distancia focal y aumento único, variando según el diseño del microscopio. La distancia focal se refiere a la distancia entre la lente y el punto donde la luz converge, permitiendo la observación de muestras a diferentes profundidades. Los objetivos también poseen aumentos específicos, indicados en la carcasa, que varían desde 4x hasta 100x o más. La apertura numérica, la parafocalidad, el sistema de tornillos múltiples y las marcas de corrección son características esenciales que mejoran la capacidad de resolución y facilitan la observación. Existen dos tipos de objetivos: Los secos y los de inmersión. Por un lado, los objetivos secos, sin medio entre la muestra y la lente aparte del aire, son ideales para aplicaciones estándar, aunque tienen limitaciones en términos de apertura numérica y resolución. Por otra parte, los objetivos de inmersión, sumergidos en aceite, eliminan la refracción del aire, mejorando la calidad de imagen y permitiendo aperturas numéricas más altas. 2 Práctica 1  -Condensador: Situado bajo la platina, el condensador es un sistema de lentes que concentra la luz sobre la muestra. Su posición y apertura se pueden ajustar para controlar la intensidad y dirección de la luz. -Ocular: Corresponde a la lente que observa la imagen ampliada creada por el objetivo. Suele tener un aumento adicional y contribuye al poder total de aumento del microscopio. Existen de 5x, 10x y 15x. Sistema digital. Con los avances tecnológicos, muchos microscopios han integrado sistemas digitales que permiten la captura de imágenes y videos. Estos sistemas incluyen cámaras, software de procesamiento de imágenes y pantallas para visualización en tiempo real. Microscopio con interfaz para conectar a computadoras. Imagen Microscopio con pantalla digital marca Bresser. Imagen recuperada de: https://www.mundomicroscopio.com/wp- recuperada de: https://www.mundomicroscopio.com/wp- content/uploads/2017/02/microscopio-camara-digital- content/uploads/2017/03/microscopio-digital-pantalla.jpg ordenador.jpg 2 Práctica 1  PRÁCTICA Materiales: Microscopio óptico Laminillas con diferentes muestras montadas Cubreobjetos Procedimiento: 1. Comprueba que la platina del microscopio se encuentra lo más bajo posible. 2. Coloca la laminilla sobre la platina y sujétala con ayuda de las pinzas 3. Conecta el microscopio a la fuente de energía y enciéndelo comprobando que la luz funciona correctamente. 4. Ubica el objetivo de más bajo aumento (4x) para empezar a observar la muestra. 5. Aproxima la muestra al objetivo con ayuda del tornillo macrométrico procurando no chocar con la lente del objetivo. 6. Observando a través de los oculares y con ayuda del tornillo micrométrico girando en dirección hacia nosotros enfoca la muestra logrando observar al máximo todos los detalles posibles de la muestra. 7. Después de observar la muestra, retírala bajando la platina hasta su nivel más bajo. 8. Bajar el nivel de luz de la lámpara y apagar el microscopio. 2 Práctica 1  NOTAS 2 Práctica 1 2 Práctica 2 Estructura de células procariotas OBJETIVO El alumno será capaz de identificar las diferencias entre células eucariotas y procariotas, la forma taxonómica y morfológica de las bacterias, los fundamentos de la tinción de Gram y de la terapia antimicrobiana. MATERIALES -Microscopio óptico -Aceite de inmersión -Cultivos bacterianos (Gram positivos y Gram negativos) -Asa bacteriológica -Puente de tinción -Cubeta para tinción -Cerillos o encendedor -Mechero de alcohol -Sanitas o servitoallas -Lápiz de tungsteno o rotulador para laminilla -Laminillas -Pipeta -Guantes -Agua destilada -Reactivos de tinción de Gram (yodo lugol, alcohol acetona, safranina y violeta de genciana) Introducción La rama de la biología encargada del estudio de las bacterias se denomina Bacteriología y su historia se remonta hasta 1673 cuando Antón Van Leeuwenhoek (Padre de la Microbiología) observó y describió diversos microorganismos, entre los cuales se encuentran las bacterias, realizando múltiples observaciones que sentaron las bases de esta rama de la biología. Posterior a esto el científico Louis Pasteur se encargo de demostrar que los procesos de fermentación son realizados por algunos de estos microorganismos entre los años 1857 y 1861 y algunos otros son causantes de múltiples enfermedades, a la par el científico Robert Koch realizo los postulados de kochen el año 1882 los cuales sirven para relacionar un microrganismo con una determinada enfermedad. 1  Sin embargo fue hasta 1977 cuando Carl Woese y colaboradores proponen las posibles relaciones genéticas de los seres orgánicos en base a sus características filogenéticas, agrupándolos en tres dominios (Bacteria, Archaea y Eukarya) unidos en un único ancestro en común (LUCA). Clasificación de Woese (sistema de 3 dominios) https://www.lifeder.com/dominios-biologia-woese/ Las bacterias son organismos procariotas los cuales se encuentran agrupadas en el dominio Bacteria y Archaea, mientras que en el reino Eukarya se encuentran distribuidos los organismos compuestos por células eucariotas. Dentro del dominio Archaea se encuentran organismos denominados extremófilos, los cuales tienen la característica de que pueden sobrevivir en condiciones ambientales extremas, estos microorganismos se clasifican en: Metanófilos: Microorganismos con la capacidad de generar a partir de CO2 e H+ metano para sus requerimientos metabólicos. Halófilos: Microorganismos con la capacidad de sobrevivir en medios extremadamente salados como el mar muerto cuyo contenido de sal es de 340 gramos por litro. Acidófilos: Microorganismos con la capacidad de sobrevivir en ambientes con pH extremadamente bajos entre uno y cero. Termófilos: Microorganismos con la capacidad de sobrevivir en temperaturas extremadamente elevadas o extremadamente bajas. 2 Práctica 2 GENERALIDADES DE LAS BACTERIAS Las Bacterias son organismos unicelulares pertenecientes al reino procariota, que carecen de organelos membranosos como el núcleo, aparato de Golgi o retículo endoplásmico y tienen la capacidad de reproducirse de manera asexual. El tamaño de estos microorganismos va desde 0.1um hasta 5um. Membrana Celular La membrana celular es una estructura lipídica dispuesta en bicapa que rodea a la célula, cuya principal función es controla el transporte de sustancias entre el medio interno y el medio externo de la célula, permitiendo el intercambio de nutrientes y desechos metabólicos. Pared Celular La pared es el componente más externo de las bacterias (con excepción de las bacterias que poseen cápsula y aquellas que solo poseen membrana como Mycoplasma spp). La principal función de la pared celular es proteger a la bacteria de agentes externos. Es una estructura rígida de grosor uniforme (20 a 80 nm en las bacterias gram positivas) y que, como consecuencia del mismo, les da las formas características a las bacterias (cocos, bacilos y espiroquetas). La pared celular esta conformada mayoritariamente por peptidoglucano (también conocido como mucopéptido o mureína) (Figura 1), al cual se le pueden unir de forma covalente otras estructuras como lipopolisacáridos, ácidos teicoicos etc. Al contrario de los gram positivos, la pared celular tiene un grosor aproximado de entre 5 y 10 nm. El peptidoglucano está constituido de N-acetil glucosamina y N-acetil murámico. Estos se encuentran alternados en cadenas largas. Estos se encuentran entrelazados unos con otros a través e un tetrapéptido formado por L-alanina, G- glutamato, L-lisina y D-alanina que se extiende desde el N-acetil murámico. Estructuralmente hablando, la pared celular de las bacterias es mucho mas gruesa, debajo de la misma se encuentra la membrana celular. Figura 1. Estructura del peptidoglucano. Los peptidoglucanos es un polipéptido formado por N-acetil glucosamina y N-acetil murámico, los cuales están entrelazados en cadenas largas. Dichas cadenas pueden unirse entre si a través de tetrapéptidos formado por L-alanina, D-glutamato, L-lisina y D-alanina. Práctica 2 3 Contrario a la pared de las gram negativas, ya que la estructura más externa es la denominada membrana externa, seguida de una capa delgada de peptidoglucano, seguido de la membrana interna (figura 2). Estas diferencias en el arreglo estructural permiten a estas bacterias ser diferenciadas mediante técnicas de tinción. Figura 2. Pared celular de las bacterias. La pared celular de las bacterias gram positivas tiene una pared gruesa de peptidoglucano, mientras que la pared de las gram negativas tiende a ser más delgado, asi mismo, esta se encuentra entre la membrana interna y externa. Cápsula La capsula es una estructura externa gelatinosa hecha de polisacáridos que presentan algunos tipos de bacterias que tiene la finalidad de proteger a la bacteria contra la desecación y fagocitosis, ayuda en la adherencia a superficies y en la formación de biopelículas. Citoplasma El citoplasma es el medio que contiene la célula, es rico en agua, enzimas, nutrientes, desechos y gases, en el cual ocurren la mayoría de las reacciones metabólicas de la célula. Nucleoide El nucleoide es la región dentro del citoplasma no rodeada por una membrana, la cual contiene el ADN bacteriano, el cual se encuentra generalmente constituido como una molécula circular bicatenaria asociado a proteínas no histonicas la cual controla las actividades de la célula y la herencia. Práctica 2 3 Plásmidos Los plasmidos son pequeñas moléculas de ADN circular que se replican independientemente del ADN cromosómico, los cuales pueden conferir ventajas selectivas, como resistencia a antibióticos o capacidad de metabolizar compuestos inusuales. Ribosomas Los ribosomas son estructuras constituidas de ARN y proteínas que se encargan de la traducción proteica, tienen la característica de ser 70S y se encuentran formado por dos subunidades una 30S y otra 50S. Flagelos Los flagelos bacterianos son filamentos largos y delgados que se extienden desde la membrana celular los cuales proporcionan movilidad a la célula, permitiéndole moverse hacia ambientes favorables o alejarse de los desfavorables (quimiotaxis), según su ubicación podemos clasificar a las bacterias en monotricos, lofotricos, anfitricos, peritricos y atricas. ChatGPT. (2024). Clasificación de las bacterias según la ubicación de sus flagelos. Generado por ChatGPT de OpenAI. Fimbrias y Pili Son estructuras similares a pelos cortos y delgados en la superficie de la célula. Las fimbrias son importantes para la adherencia a superficies y en la formación de biopelículas. Los pili (especialmente el pili F o de conjugación) son importantes para la transferencia de material genético entre bacterias (conjugación). Práctica 2 5 Endosporas Las endosporas son estructuras resistentes formadas por algunas bacterias bajo condiciones adversas las cuales permiten la supervivencia en condiciones extremas de temperatura, desecación y radiación. Dato de nomenclatura: Las bacterias para su estudio se nombran siguiendo las siguientes reglas: Primero se coloca el género Segundo se coloca la especie La primera letra del Género debe ir en mayúsculas La primera letra de la especie debe ir en minúsculas Siempre se debe escribir el nombre en cursiva Ejemplo: Escherichia coli / E.coli spp CLASIFICACIÓN Existen diversas formas para poder clasificar a las bacterias , dentro de las que se destacan las clasificaciones: morfológica (Cocos, bacilos y espirilos), metabólica (Aerobios y anaerobios estrictos o facultativos) y de acuerdo a su pared celular (Gram positivos, Gram Negativos y BAAR), para fines de practicidad nos enfocaremos en la clasificación en base a su pared celular o también llamada clasificación de Gram. TINCIÓN DE GRAM La tinción de Gram es una de las técnicas más antiguas en cuanto a identificación de microorganismos se refiere. Fue introducida por primera vez por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1882 con el objetivo de identificar los patógenos causantes de neumonía. Actualmente la tinción se utiliza para la identificación microscópica en muestras clínicas o subcultivos de bacterias causantes de diversos cuadros infecciosos. En ese momento solo estaba disponible la tinción para la identificación del bacilo Mycobacterium tuberculosis causante de la tuberculosis. Gram incorporó a su método el colorante cristal violeta (violeta de genciana) como colorante principal. Posteriormente adicionó solución yodada como mordiente seguido de un tratamiento con etanol como decolorizante. Se percató que las bacterias causantes de neumonía se teñían de un color violeta. Gram demostró que su técnica teñía las bacterias causantes de la artritis supurativa seguida de la fiebre escarlata (Streptococcus del grupo beta hemolíticos). Por otro lado, se percató que la bacteria causante de fiebres entéricas (Salmonella tiphy) de decoloraba después del tratamiento con etanol. Así nacía la clasificación que utilizamos actualmente para la identificación de bacterias. Práctica 2 5  La tinción de Gram es una de las principales técnicas utilizadas en microbiología, ya que es el primer paso para la identificación de una bacteria. Esta tinción distingue entre las bacterias Gram positivas (color violeta) y las bacterias Gram negativas (color rojo). Así mismo, esta tinción nos permite ver las formas de las bacterias, se pueden observar cocos (bacterias redondas) o bacilos (bacterias alargadas). Además, esta tinción nos permite observar las estructuras de otros patógenos como hongos y parásitos. En la tabla 1 se muestran las bacterias de importancia clínica y al grupo que pertenecen según su coloración. Existen otro tipo de bacterias cuya particularidad estructural, como la ausencia de pared celular, capacidad para invadir células, la presencia de estructuras externas como capsulas u otras moléculas en la pared como los ácidos micólicos, dificultan su identificación mediante la tinción de Gram. Por lo tanto, se debe hacer otro tipo de tinciones especiales (como la tinción de Ziehl-Neelsen) para su identificación. En la tabla 2 se ejemplifican algunas de las bacterias que no se pueden identificar con la tinción de Gram. Tabla 1. Bacterias de importancia clínica y su tipo de coloración. 6 Práctica 2  Tabla 2. Bacterias de importancia clínica que tienen una coloración variable con la tinción de Gram y bacterias que no se tiñen con tinción de Gram. PRINCIPIOS BIOQUÍMICOS DE LA TINCIÓN DE GRAM En solución acuosa el cristal violeta (Figura 3) se disocia en cristal violeta con carga positiva y iones cloro con carga negativa. Estos penetran a través de la pared y la membrana tanto de bacterias grampositivas como gram negativas. El cristal violeta, con carga positiva, interactúa con las estructuras bacterianas con carga negativa, tiñendo a la bacteria de un color azul/violeta. Cuando se agrega la solución yodada (I- o I3-) interactúa con el cristal violeta para formar complejos cristal violeta-yodo en el citoplasma membrana y pared celular, estos complejos son grandes y estables. El agente decolorizante (etanol o una solución de etanol y acetona) interactúa con los lípidos de la membrana de gram positivos y gram negativos. La membrana externa de los gram negativos se pierde dejando expuesto los peptidoglicanos de la pared celular. La pared celular de los gram negativos es delgada a comparación a los gram positivos. Tienen en promedio 3 capas de peptidoglucano, estas se vuelven permeables al entrar en contacto con el etanol, liberando así el complejo cristal violeta-yodo de la bacteria. Al contrario de las bacterias gram negativas, el peptidoglicano de la pared de las bacterias grampositivas es más grueso y está entrelazado, al agregar el etanol, la bacteria se deshidrata. Este proceso atrapa el complejo cristal violeta-yodo dentro del peptiglucano. Por esto, después de la decoloración, las bacterias gram positivas permanecen de un color azul/violeta. Al final de la decoloración, se agrega safranina, la cual tiñe las bacterias gram negativas, las cuales perdieron el colorante primario. Adicionalmente, otra de las ventajas importantes que tiene la tinción de Gram, es que deja sin teñir los núcleos de las células eucarióticas. Lo que permite realizar la tinción de Gram con diferentes tipos de muestras biológicas. 6 Práctica 2  Figura 3. Estructura del colorante primario cristal violeta (violeta de genciana). Al disolverse en agua el cristal violeta se disocia en cristal violeta de carga positiva y iones cloro de carga negativa. MANEJO DE LA MUESTRA ·Preferentemente la muestra deberá ser tomada antes de la tinción. ·Realizar el extendido en un portaobjetos limpio, el cual se deja secar a temperatura ambiente. ·Posteriormente el portaobjetos se fija con calor, evitando quemar la muestra. SUGERENCIAS PARA LA TINCIÓN ·Para los lavados, el agua corriente se puede sustituir por agua destilada, esto para evitar la presencia de sales en la muestra. ·Las causas de precipitación durante la muestra se pueden deber a que el portaobjetos no estaba limpio o a que la fecha de caducidad del colorante haya expirado. ·En caso de que el colorante presente precipitaciones, se recomienda filtrar el mismo con un papel filtro (hasta un máximo de dos filtraciones), de lo contrario se tiene que preparar nuevamente el colorante y guardarlo en un frasco ámbar lejos de los rayos directos del sol. 6 Práctica 2  METODOLOGÍA 1.Colocar el portaobjetos previamente fijado en un puente de tinción. 2.Cubrir el portaobjetos con cristal violeta e incubar 1 minuto. 3.Escurrir el colorante, posteriormente cubrir el portaobjetos con yodo Gram e incubar por 1 minuto. 4.Lavar con alcohol acetona para decolorar, se deja actuar entre 5 y 15 segundos para los frotis delgados y de 15 a 60 segundos para los frotis gruesos. 5.Se enjuaga con agua destilada para remover el decolorante. 6.El frotis se cubre con safranina, se deja incubar por 1 minuto. 7.Lavar repetidamente el frotis con agua destilada hasta aclarar el mismo. Secar a temperatura ambiente y observar a objetivo de inmersión 100X. Figura 4. Esquema del procedimiento de la tinción de Gram. Proceso para realizar la tinción de Gram de acuerdo a la metodología detallada anteriormente. Figura 5. Bacterias gram positivas y negativas. Imágenes del resultado obtenido después de realizar la tinción de Gram observadas a objetivo de inmersión 100X. 6 Práctica 2  PRÁCTICA 1. Rótulo de la muestra. Usa un lápiz de punta diamante para rotular cada laminilla con la respectiva bacteria que albergarán. 2. Esterilizar asa bacteriológica y tomar muestra. Esterilización con calor, flameando el asa con ayuda del mechero hasta obtener un rojo vivo. Enfriar el asa bacteriológica entre el agar y la pared de la caja Petri. Tomar una colonia del cultivo bacteriano del que se tomará la muestra. 3. Frotis. Se realiza el extendido de las bacterias sobre la laminilla correspondiente al agente bacteriano en la parte media de la laminilla de forma circular, procurando colocar una buena cantidad de muestra. Tras el extendido volver a esterilizar el asa bacteriana con calor. 12 Práctica 2  4. Fijación. Después del frotis se fijará la muestra mediante el uso de calor deslizando la laminilla con la muestra sobre la llama del mechero, cuidando no exceder el tiempo sobre la llama. 5. Tinción de Gram: Colocar muestras sobre la gradilla para realizar tinción. 1. Cristal violeta: Con ayuda de la pipeta tomamos colorante cristal violeta y colocamos sobre las muestras procurando cubrir toda la muestra. El colorante permanecerá sobre las muestras durante 1 minuto. 2. Lavar la muestra: Con agua destilada quitaremos el exceso de colorante de las muestras. 3. Mordiente Yodo Lugol: Ayudándonos de una pipeta se colocará la solución Lugol cubriendo todo el frotis y manteniendo por 1 minuto sobre las muestras. 4. Lavar la muestra: Con agua destilada quitaremos el exceso de Yodo de las muestras. 5. Decolorante alcohol acetona: Aplicar la mezcla alcohol acetona permaneciendo sólo 30 segundos con ayuda de una pipeta. 6. Lavar la muestra: Con agua destilada quitamos el exceso de alcohol acetona de las muestras. 7. Contratinción: Con una pipeta tomamos colorante de Safranina y lo vertemos sobre las muestras, permaneciendo 1 minuto sobre las muestras. 8. Lavar la muestra: Aplicando agua destilada quitamos el exceso del colorante Safranina de las muestras. 12 Práctica 2 6. Secado. Con mucho cuidado secamos las muestras con ayuda de papel absorbente, realizamos este paso con mucha precaución, cuidando no barrer las muestras bacterianas. 7. Observación a través del microscopio. Siguiendo los pasos aprendidos en la práctica de microscopía, se observarán las muestras, haciendo hincapié a sus características y diferencias. Práctica 2 13  NOTAS 14 Práctica 2 3 Practica 3 Preparación de muestras OBJETIVO El alumno conocerá los procesos básicos de obtención de muestras y los distintos tipos de procedimientos que se les realizan para su análisis, así como los fundamentos básicos sobre las tinciones y su uso. MATERIALES -Microscopio óptico. -Abatelenguas. -Portaobjetos. -Cubreobjetos. -Citospray. -Canastilla para laminillas. -Tren de tinción de Arzac. -Sanitas o servitoallas. -Guantes. -Resina sintética o bálsamo de Canadá. -Xilol para limpiar excedente del medio de montaje. Introducción. En el ámbito médico, la intersección entre la histología y la biología celular se convierte en un pilar fundamental para comprender tanto los procesos normales como las alteraciones patológicas a nivel microscópico. La exploración de células y tejidos, aunque desafiante, se beneficia de una variedad de métodos especializados, como la histoquímica, inmunocitoquímica, radioautografía, fraccionamiento celular, y técnicas in vivo, presentes en el estudio de la biología celular. La necesidad de obtener preparados permanentes, como laminillas, para la preservación de células, resalta la importancia de la técnica histológica. La habilidad para preparar tejidos para su observación microscópica se convierte en un proceso crucial, variando según el tipo de microscopio que se emplea. La complejidad de la estructura morfológica celular se ve acentuada por las modificaciones surgidas durante el proceso de fijación y tinción. Este reconocimiento de limitaciones intrínsecas impulsa a la medicina a utilizar estos recursos con cautela, conscientes de que, aunque los preparados permanentes no reproducen fielmente las condiciones originales, siguen siendo vitales para el estudio de células y tejidos. 7  El traslado de la histología a la práctica médica se ve enriquecido por la comprensión de que el análisis microscópico no es simplemente una observación estática, sino una herramienta dinámica para investigar procesos celulares y tisulares en su contexto patofisiológico. Este enfoque integral es esencial para desentrañar los misterios de las enfermedades y avanzar en el desarrollo de diagnósticos más precisos y terapias más efectivas. ¿Cuál es su importancia? Diagnóstico de enfermedades: La observación microscópica de tejidos y células permite a los patólogos identificar anomalías y cambios en la morfología celular asociados con enfermedades. Investigación de procesos patológicos: La histología proporciona una ventana única para estudiar procesos patológicos a nivel celular, como la proliferación celular descontrolada (cáncer), inflamación, degeneración y otras alteraciones morfológicas asociadas a enfermedades. Validación de hallazgos clínicos: Los estudios histológicos respaldan y validan los hallazgos clínicos, permitiendo una correlación más profunda entre los síntomas y las alteraciones estructurales subyacentes. Desarrollo de terapias personalizadas: La comprensión detallada de la biología celular contribuye al desarrollo de terapias más precisas y personalizadas, al identificar blancos terapéuticos específicos a nivel molecular. Formación médica: La enseñanza de la histología y biología celular es esencial en la formación médica para que los profesionales de la salud comprendan las bases celulares de la salud y la enfermedad. ¿Por qué se utiliza? La utilización de la histología y la biología celular en medicina se justifica por varias razones fundamentales que abarcan tanto el diagnóstico clínico como la investigación médica. n Práctica 3  Obtención de muestras, biopsias, tipos y características. La "biopsia" es un procedimiento médico en el que se extrae una pequeña muestra de tejido de un organismo vivo, para su posterior examen bajo un microscopio. Se realiza con el fin de diagnosticar la presencia de enfermedades, identificar la naturaleza de los tumores o investigar anomalías en los tejidos. Dentro de la técnica histológica, no está estrictamente considerada la obtención de tejidos, sin embargo, es importante conocer los tipos de biopsia para comprender en qué situaciones se lleva a cabo cada uno de estos. Tipos de biopsia. Martínez Grau, M., Sanchís Martínez, C., Sanchís Martínez, M. C., Martínez Martínez, A. (2021). Higiene del medio hospitalario y limpieza de material. España: Editorial Editex. n Práctica 3  Biopsia Incisional: Se toma una muestra de tejido representativo mediante la extracción de una pequeña porción de la lesión o área sospechosa con fines diagnósticos. A menudo en tejidos blandos. Ejemplo: Lesión, órgano, tumor. Biopsia Excisional: Se extrae completamente la lesión o el tejido sospechoso. Tiene fines terapéuticos y se debe dejar un margen al momento del procedimiento. Ejemplo: A menudo realizada cuando se sospecha un tumor o una masa, permitiendo una evaluación completa de la lesión. Útil en lesiones pequeñas. Biopsia incisional. (North S, Banks T. Small animal oncology. ed 1. 2009, Saunders/Elsevier) Biopsia con sacabocado: Se utiliza una herramienta cortante para extraer una muestra cilíndrica de tejido. Ejemplo: Común en áreas donde se necesita una muestra más profunda, como en la próstata o el hígado. Biopsia de la piel - Western New York Urology Associates. (s. f.). https://www.wnyurology.com/content.aspx?chunkiid=103941 n Práctica 3  Biopsia por Punción: Se utiliza una aguja fina para aspirar una pequeña muestra de tejido o líquido. Ejemplo: Usada en órganos accesibles por aguja, como la tiroides o el seno. Biopsia por Trepanación: Implica el uso de un instrumento de corte para perforar y extraer una muestra de hueso. Ejemplo: Utilizada para investigar enfermedades óseas, como tumores o infecciones. Biopsia Transoperatoria o Cielo Abierto: Se realiza durante una cirugía, extrayendo una muestra para su evaluación inmediata. Ejemplo: Orientada a obtener un diagnóstico rápido durante la cirugía para guiar las decisiones del procedimiento. Biopsia Colposcópica: Se realiza con un colposcopio, un instrumento para examinar el cuello uterino, y se toma una muestra de tejido. Ejemplo: Principalmente utilizada en la evaluación de lesiones cervicales. Biopsia por Raspado o Legrado: Se raspa o rasga la capa superficial del tejido para obtener una muestra. Ejemplo: Común en la biopsia endometrial o cervical. Biopsia por Punch: Implica el uso de un instrumento llamado "punch" o "bisturí de punch". Este instrumento tiene una pequeña cuchilla circular en el extremo, similar a una pequeña taza afilada. Se realiza una pequeña incisión circular en la piel o en la mucosa, y luego se extrae un cilindro delgado de tejido para su posterior análisis. Ejemplo: Piel, cuero cabelludo, región genital. Técnica histológica. La técnica histológica emerge como un conjunto meticuloso de procedimientos que posibilita la observación detallada de tejidos biológicos. Tiene como finalidad realizar cortes finos a tejidos gruesos para su colocación en láminas y así revelar su compleja estructura microscópica por medio de preparaciones histológicas. n Práctica 3  Técnica histológica, esquema propio (s.f.).- Comité Universitario de Divulgación e Investigación Médica. Técnica de la parafina fundida. - Fijación. Este proceso tiene como objetivo interrumpir los procesos biológicos naturales que suceden después de la extracción del tejido, evitando así la autólisis, descomposición y cambios estructurales indeseados. En esta fase de la técnica histológica, los fijadores reaccionan con los grupos amino, formando enlaces entrecruzados en los extremos de las moléculas. Este mecanismo evita la desnaturalización y descomposición de las estructuras celulares. Con la acción de los fijadores, el tejido experimenta un aumento en su rigidez, se inhiben las proteasas, se detiene el metabolismo celular y se erradican microorganismos no deseados. Este proceso de fijación contribuye no solo a la preservación de la estructura original del tejido, sino también a la creación de un entorno propicio para los pasos subsiguientes de la técnica histológica. - Deshidratación. El objetivo es eliminar el agua presente en los tejidos y sustituirla con compuestos hidrofóbicos, con el fin de poder crear las condiciones óptimas para la posterior inclusión en medios tales como la parafina. Este proceso se lleva a cabo mediante la sustitución gradual del agua por alcohol, utilizando una serie de soluciones de etanol de concentración creciente. Mediante el proceso de difusión, se permite que el alcohol reemplace gradualmente el agua en los tejidos. Además de eliminar el agua, este proceso también cumple con la función de eliminar el formaldehído, un agente fijador utilizado previamente. n Práctica 3  Este paso adquiere relevancia, ya que sienta las bases para la introducción de una sustancia altamente hidrófoba: la parafina, que conocerás más adelante, se mezclará con los tejidos previamente deshidratados, permitiendo una infiltración adecuada. Técnica histológica. Elysium. (s. f.). Elysium. https://elysiumbham.wixsite.com/elysium/tecnica-histologica-y-microscopia - Aclaramiento. Se busca reemplazar el alcohol (etanol) con un compuesto químico miscible con grasas, preparando así las muestras para la inclusión en parafina. Para eliminar el etanol, se emplea típicamente el xileno o xilol, ya que este solvente es soluble con el etanol y con la parafina. Es importante destacar que la parafina (una sustancia que se volverá prominente en las siguientes etapas) es una cera y, por lo tanto, hidrofóbica, similar a las utilizadas en la fabricación de velas. - Inclusión. Se enfoca en transformar la muestra de una consistencia gelatinosa y blanda a una más sólida. Este proceso es crucial para la posterior obtención de cortes finos y precisos en las secciones de tejido. Para lograrlo, el tejido se sumerge en parafina caliente a 60 grados Celsius. La parafina en estado líquido penetra los espacios intercelulares de la muestra. Al enfriarse se solidifica, creando un bloque que encapsula la muestra en su interior. Es crucial señalar que la deshidratación previa con etanol y el aclaramiento con xileno son pasos fundamentales para preparar la muestra para la inclusión en parafina. Si la parafina se agrega directamente al tejido después de la fijación, no se lograría una unión efectiva debido a la presencia de agua en las células. Esto se debe a que, como se sabe, agua y grasa no son compatibles. n Práctica 3  Pombal, M. M. P. M. M. Á. (s. f.). Técnicas hitológicas. 4. Corte. Microtomo de parafina. Atlas de Histología Vegetal y animal. https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/4- mparafina.php - Microtomía. El bloque sólido que contiene la muestra biológica se corta en secciones delgadas utilizando un equipo especializado conocido como microtomo. Una cuchilla de diamante se desplaza a través del bloque de parafina, generando cortes extremadamente finos. Estos cortes, que pueden tener un grosor variable según la configuración del microtomo (1-50 micras), se sumergen luego en un baño de flotación con agua a 45°C. La finalidad de este paso es extender y desplegar los cortes de manera uniforme, preparándose para ser transferidos a portaobjetos. La razón detrás de la delgadez específica de los cortes reside en la necesidad de permitir que la luz del microscopio atraviese la muestra de manera eficiente. La fina sección proporciona una visión nítida y detallada de las estructuras celulares y tisulares, facilitando así la observación microscópica y la interpretación precisa de los resultados histológicos. Myr. (2023, 24 noviembre). Microtomo rotacional semiautomático M-240 | MYR. Myr | Especialidades Médicas Myr, S.L. https://myr.com.es/index.php/productos/microtomo- rotacional-semiautomatico-m-240 n Práctica 3  Técnica de congelación. Es un enfoque alternativo en histología que se utiliza para preparar muestras de tejido para su observación microscópica. A diferencia de la técnica de inclusión en parafina, que implica la creación de bloques sólidos, la congelación se centra en mantener la muestra en un estado congelado para permitir cortes finos y rápidos. Después de la fijación y deshidratación, la muestra se sumerge en una solución crioprotectora que ayuda a preservar la estructura celular durante el proceso de congelación. La rapidez en el proceso ayuda a evitar la formación de cristales de hielo grandes, que podrían dañar las estructuras celulares. Corte en Criostato: El tejido congelado se coloca en un instrumento llamado criostato, que mantiene la muestra a temperaturas muy bajas mientras se realiza el corte. Se obtienen secciones muy finas de tejido, de 5 a 20 micras. Montaje de Secciones: Las secciones cortadas se transfieren a portaobjetos y se pueden teñir directamente sin necesidad de pasar por procesos de desparafinado y rehidratación, como en la técnica de inclusión en parafina. Kalstein. (2023, 16 mayo). ¿Qué es un criostato? Kalstein. https://kalstein.com.mx/que- es-un-criostato/ n Práctica 3  Técnica citológica (por pasos). La técnica citológica comprende una serie de pasos en los cuales, a partir de células obtenidas de las mucosas de diversas cavidades del ser humano, como la boca, el ano, la vagina, entre otras, se lleva a cabo un análisis microscópico. El propósito de este análisis es examinar la estructura, función y características de estas células, con el fin de detectar posibles anomalías y lograr un diagnóstico preciso. Recolección de muestra: La obtención de muestra puede ser mediante una biopsia (extracción de tejidos o células de un organismo vivo) o una necropsia (extracción de tejidos o células de un organismo muerto). Extensión de la muestra (frotis): Existen diferentes maneras en la que se puede extender una muestra en un portaobjetos. Extensión por barrido o deslizamiento: Se coloca una pequeña cantidad de muestra en el centro del portaobjetos y después se utiliza el extremo de otro portaobjetos para extender la muestra por medio de un barrido. Extensión con hisopo: Se coloca una pequeña cantidad de muestra en el centro del portaobjetos y después se extiende la muestra. Técnica de impronta o sello: Se coloca una pequeña cantidad de muestra en el centro del portaobjetos, después se va a presionar ligeramente con otro portaobjetos. Universidad Autónoma de Baja California. (s. f.). Tinción de Hematoxilina- Eosina (HE). peces.ens.uabc.mx. http://peces.ens.uabc.mx/bcym/practica/TincionHE.html Fijación. La fijación de muestras citológicas es un paso crítico que debe llevarse a cabo de manera inmediata tras la obtención del frotis. Su función principal es prevenir la citólisis, es decir, la descomposición de los tejidos. La fijación logra inmovilizar las estructuras celulares de manera que se asemeje lo más posible a su estado original, evitando cambios autolíticos y el crecimiento bacteriano. Este proceso induce la muerte celular súbita y es esencial para preservar la integridad de las células y facilitar su estudio. n Práctica 3  Los fijadores pueden clasificarse en dos categorías: Físicos y químicos, cada uno con sus propias variantes. Fijadores Físicos: Calor: Se emplea un mechero, comúnmente utilizado en bacteriología. Frío: La fijación a bajas temperaturas también es una opción. Fijadores Químicos: Aldehídos: Estos compuestos reaccionan con los grupos amino, estableciendo enlaces cruzados con proteínas y coagulando las proteínas tisulares. Oxidantes: Ejemplificado por el tetraóxido de osmio, este fijador forma enlaces cruzados con proteínas y precipita los lípidos no saturados, siendo especialmente útil en microscopía electrónica. Desnaturalizantes de Proteínas: Involucran interacciones iónicas con moléculas de agua. Ácido acético, alcohol metílico, alcohol etílico y acetona son ejemplos de sustancias que pueden usarse solas o en combinación. Variantes modernas incluyen alcohol absoluto, alcohol-éter en partes iguales y alcohol-cetona en partes iguales. En la actualidad, el Citospray, compuesto por PVP, vehículo y propelente, ha ganado popularidad como fijador debido a su practicidad y seguridad. La elección del fijador dependerá del tipo de muestra y del análisis que se llevará a cabo. Es crucial comprender la importancia de este proceso, ya que una fijación adecuada garantiza la preservación óptima de las células y estructuras tisulares, permitiendo una interpretación precisa en estudios citológicos. Tinción: Los tejidos se someten a la aplicación de colorantes con el propósito de realzar el contraste natural y destacar de manera más evidente los distintos componentes celulares, tisulares y cualquier material extrínseco presente. Esta técnica desempeña un papel crucial al permitir una visualización más clara y detallada de las estructuras bajo observación. La mayoría de los colorantes utilizados se encuentran en forma de soluciones acuosas, aunque algunos también se emplean en soluciones alcohólicas. Esta diversidad en los solventes se selecciona según las propiedades específicas de los colorantes y la naturaleza de las muestras, asegurando una interacción óptima para la revelación precisa de detalles celulares y tisulares. n Práctica 3  ❖Clasificación de Técnicas de Tinción: Vitales y Supravitales: Vitales: Estas técnicas se aplican en material biológico vivo sin provocar la muerte celular. El azul de metileno y el rojo neutro son ejemplos destacados. Al emplear estos colorantes, es posible observar las células en su estado natural, revelando procesos fisiológicos y estructuras celulares sin alteraciones significativas. Supravitales: En contraste, las técnicas supravitales se utilizan después de fijar el material biológico, una vez que las células ya han perdido su vitalidad. A pesar de esto, estas técnicas tiñen estructuras que persisten únicamente en células vivas, gracias a la fijación que conserva estas características. El moreno de Bismarck es un ejemplo representativo de la técnica supravital. Mecanismo de Aplicación del Colorante: Directas: En este tipo de tinción, el colorante se aplica directamente sobre la muestra sin requerir tratamientos previos. La simplicidad de estas técnicas hace que sean ampliamente utilizadas para visualizar estructuras celulares específicas de manera rápida. Un ejemplo común es la tinción con cristal violeta para resaltar la pared celular en bacterias. Indirectas: Antes de la tinción, el tejido se trata con un mordiente que ayuda a fijar el colorante, mejorando la adhesión y estabilidad de la tinción. La tinción de Gram es un ejemplo emblemático de técnica indirecta, donde el mordiente permite la clasificación de bacterias en Gram-positivas o Gram-negativas. Progresivas: Estas técnicas involucran la aplicación secuencial de varios colorantes en tiempos sucesivos. Cada colorante tiñe estructuras específicas, permitiendo una visualización detallada y diferenciada de diferentes componentes celulares. La tinción de hematoxilina y eosina en histología es un ejemplo de técnica progresiva. Regresivas: En contraste, las técnicas regresivas comienzan con un sobretinte intenso que se decolora progresivamente hasta alcanzar el contraste deseado. La tinción de Feulgen para la identificación de ADN es un ejemplo de técnica regresiva. Selectividad de la Tinción: Pancromáticas: Utilizando un solo colorante, estas técnicas generan diferentes tonos en los distintos componentes celulares. La tinción con azul de toluidina es un ejemplo de técnica pancromática que permite la visualización general de estructuras celulares. Totales: En este caso, todo el tejido se tiñe del mismo color. La tinción con eosina y azul de metileno es un ejemplo de técnica total, empleada comúnmente en histología. n Práctica 3  Tipos Especiales: Fluorescentes: Estos colorantes emiten fluorescencia al ser excitados por luz ultravioleta, resaltando regiones celulares específicas. La tinción con DAPI para la visualización de núcleos celulares en microscopía de fluorescencia es un ejemplo de técnica fluorescente. Negativas: En este tipo de tinción, el colorante resalta más el fondo que la muestra, siendo útil en microbiología para destacar la presencia de microorganismos. La tinción de tinta china es un ejemplo de técnica negativa. Principios Básicos de Tinción: La afinidad entre colorantes ionizables (ácidos o básicos) y las proteínas celulares de carga opuesta es crucial. Los ácidos (acidófilos) se unen a componentes básicos, mientras que los básicos (basófilos) tienen afinidad por ácidos. Este fenómeno está intrínsecamente ligado al pH relativo del entorno. Origen de los Colorantes: Los colorantes pueden clasificarse según su origen: Naturales: Provenientes de fuentes animales o vegetales, como la hematoxilina extraída de la madera de un árbol. Artificiales sintéticos: Elaborados en laboratorios mediante procesos químicos, como el cristal violeta. Indiferenciados: Colorantes que no poseen características ácidas ni básicas, como el azul de toluidina. n Práctica 3  Montaje: Representa la fase conclusiva en la preparación de muestras destinadas a la observación microscópica. Este procedimiento asegura la estabilidad de la muestra, previene la deshidratación y facilita la transmisión de la luz. La muestra montada se dispone sobre un portaobjetos y se cubre con una lámina de vidrio delgada, la cual se sella para resguardarla contra contaminantes. Dos opciones comúnmente empleadas son el "Bálsamo del Canadá" y la "Resina sintética". Bálsamo del Canadá: Es una oleorresina extraída de la corteza de ciertas variedades de abeto presentes en la mitad oriental de Canadá, característica por su transparencia en capas delgadas. Este material se adhiere de manera firme al vidrio y alcanza una consistencia muy dura sin granulación apreciable. Además, es altamente soluble en xileno, facilitando su manipulación. Resina sintética, solubilizada al 60% en xileno, se posiciona como otra opción valiosa. Esta resina, al ser soluble en xileno, ofrece una solución práctica para el montaje, asegurando una correcta fijación de la muestra al portaobjetos. Su versatilidad y capacidad de disolución en xileno contribuyen a simplificar el proceso de preparación de muestras para observación microscópica. n Práctica 3  Pombal, M. (s. f.-a). Técnicas. ampliaciones. tabla de colorantes. Atlas de Histología vegetal y animal. https://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/ampliaciones/tabla- colorantes.php n Práctica 3  PRÁCTICA Paso 1: Obtención de la muestra. Utilizando un abatelenguas o una laminilla portaobjetos, se toma una muestra de células del carrillo o del labio inferior de un alumno voluntario por equipo. Paso 2: Realización del frotis por deslizamiento. Con el abatelenguas o la laminilla que contiene la muestra, se realiza un frotis por deslizamiento inclinando aproximadamente 45°, tal como se ilustra en las fotografías 2.1 y 2.2. Paso 3: Fijación de la muestra. Se procede a fijar la muestra con citospray. El rocío se aplica de manera uniforme a una distancia de aproximadamente 15 a 20 cm, cubriendo toda la muestra según se visualiza en la Fotografía 2.3. Paso 4: Tinción siguiendo el tren de tinción de Arzac. Paso 5: Montaje con resina sintética. Se aplica una o dos gotas de resina sintética en sentido longitudinal de la muestra. Luego, se coloca el cubreobjetos en la laminilla, asegurándose de evitar la formación de burbujas. n Práctica 3  Paso 6: Limpieza del exceso de resina y colorante. Antes de la observación al microscopio, se limpia cualquier exceso de resina y colorante utilizando un algodón humedecido en xilol para evitar manchar la platina. Paso 7: Observación al microscopio. Se procede a la observación al microscopio (ver Fotografía 2.5), donde las células teñidas y fijadas previamente pueden ser visualizadas con mayor detalle. Este protocolo garantiza la obtención de resultados claros y detallados durante el proceso de observación microscópica. n Práctica 3  NOTAS n Práctica 3 4 Practica 4 Movimiento Celular OBJETIVO Identificar como se conforma el citoesqueleto, con el fin de analizar su papel e importancia en los diversos procesos celulares en los que participa; así como comprender las características fundamentales del tejido muscular y sus funciones en el cuerpo humano. MATERIALES -Microscopio óptico. -Portaobjetos. -Cubreobjetos. -Vidrio de reloj (uno por equipo). -Sanitas o servitoallas. -Pipetas. -Semen. -Cultivo de Paramecium (se consigue en agua estancada, guardar en botella oscura, en un cuarto oscuro o debajo del lavadero y fresco). -Lechuga, papa y cascara de plátano. -Mercurio. -Dicromato de potasio (K2Cr2O7). -Agua destilada. -Ácido nítrico. INTRODUCCIÓN. La característica fundamental del movimiento celular es la transformación de energía, esto, se logra por la transducción de señales de manera química y posteriormente mecánica, gracias a tres componentes esenciales de cualquier estructura celular: Microtúbulos, Microfilamentos y Filamentos Intermedios. A) Microtúbulos (MT): Los microtúbulos son polímeros huecos y alargados de 25 nanómetros (nm) de diámetro, estos, a su vez, están compuestos por 13 protofilamentos de heterodímeros proteicos denominados a y b-tubulina, dispuestos de forma helicoidal construyendo así al MT que se encuentra recorriendo toda la célula (Figura. 1), algunas de sus funciones son: mantener la forma celular, transporte de organelos y vesículas, separación de cromosomas durante la división celular y sostén celular. 6  El citoesqueleto, Biología celular biomédica, 2.ª ed. de Alfonso Calvo, editorial Elsevier, España. Año 2023 Los MT tienen proteínas motoras, o también llamadas mecano-enzimas, que funcionan como motores proteicos que intervienen en el movimiento de los organelos intracelulares. Su energía es el resultado de la conversión de energía química de la Hidrólisis de ATP en energía mecánica, lo que se traduce en un movimiento unidireccional o “paso a paso” a lo largo de los MT o Microfilamentos (MF) del citoesqueleto. Esto, quiere decir que los MT pueden crecer o decrecer al agregar o desmontar dímeros de tubulina para construir estructuras en la célula, pero esto lo hacen en función de sus extremos, ya que estos presentan una polaridad estructural, en el cual, un extremo puede agregar o desmontar dímeros de tubulina a una velocidad mayor que el otro, por lo que le confiere su gran capacidad para encogerse o crecer durante las diversas actividades celulares. Existen tres grandes grupos de proteínas motoras: A.1) Cinesinas: También conocidas como quinesinas o kinesinas, son tetrámeros formados por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, donde estas últimas, tienen su propio dominio globular que las mantienen unidas a un protofilamento en particular. Su desplazamiento es de forma unidireccional, y es del extremo negativo (-) al extremo positivo (+), es decir, realizando un movimiento anterógrado hacía la periferia de la célula. A.2) Dineínas: Son polímeros formados por dos cadenas pesadas y múltiples cadenas intermedias y ligeras. Las encontramos asociadas a los MT, sin embargo, tenemos una clasificación para estas proteínas: 6 Práctica 4  A.2.1) Dineína Citoplasmática: Se desplaza a lo largo del MT en sentido retrógrado (contraria a la cinesina), es decir, desde el extremo positivo (+) al extremo negativo (-), hacia el interior de la célula. A.2.2) Dineína Axonémica: También conocida como ciliar, únicamente está presente en el axonema de cilios y flagelos, logrando así el desplazamiento de los MT uno sobre otro. A.3) Miosinas: Son polímeros conformados por 2 cadenas pesadas y por un número variable de cadenas ligeras. Estas proteínas, se desplazan a lo largo de los MF de Actina, desde el extremo negativo (-) al extremo positivo (+), es decir, para que se lleve a cabo el movimiento, los filamentos de actina deben interactuar con la proteína miosina. Se dividen en: A.3.1miosinas convencionales (Tipo II): ubicadas en células musculares (miocitos) A.3.2miosinas no convencionales: realizan funciones distintas al movimiento muscular. Para lograr un correcto ensamblaje de los MT, el evento clave que debe ocurrir es una nucleación inicial a partir de organelos especializados llamados Centros Organizadores de Microtúbulos (abreviados como MTOC o COMT). La característica en común de todos los MTOC es la capacidad de poder reclutar (unir) al complejo de la g-tubulina, que va a actuar como un sitio de nucleación para así polimerizar a los MT, esto se traduce en que los MT van a poder crecer hacia la periferia. El MTOC está compuesto de un centrosoma, el cual, se ubica cerca del núcleo de la célula y que consiste en un par de centriolos rodeados por material pericentriolar, que incluye a la proteína g-tubulina en disposición de anillo, y, es a partir de este anillo que funciona como punto de nucleación para polimerizar las unidades α y β-tubulina, en otras palabras, el centrosoma es la base de donde surgirán los microtúbulos. Así mismo, contienen cuerpos basales (cilios y flagelos que se describirán más adelante). Los MT, forman estructuras estables, que parten del cuerpo basal o axonema el cual, funge como el centro organizador de los MT, y se extienden hacia fuera de la superficie celular. El citoesqueleto, Biología celular biomédica, 2.ª ed. de Alfonso Calvo, editorial Elsevier, España. Año 2023 Los cilios (que proviene del latín Cilium = pestaña) y los flagelos (del latín Flagellum = látigo), son haces conformados en una configuración de nueve pares de tubos periféricos dispuestos en círculo que rodean a un par central (9+2) (Figura 2). 6 Práctica 4  Los cilios son numerosos y cortos, mientras que los flagelos son largos y escasos, además, ambos se insertan en la célula por estructuras similares a los centriolos llamados corpúsculos basales, que tienen los nueve pares de túbulos periféricos, pero que no tienen el par central (9+0) (Figura 2). Actualmente, se han descrito dos clasificaciones para los cilios y los flagelos: 1) Por movimiento: Tanto cilios como flagelos, producen el movimiento por la deflexión del centro, y los microtúbulos periféricos se deslizan uno sobre otro, siendo la dineína la responsable de dicha inclinación. Los movimientos encontrados son: ondular (Paramecium coli, el protozoario Tetrahymena y Paragonimus Mexicanus), pendular (Balantidium Coli) e infundibuliforme (Monosiga brevicollis). (Figura 3) 2) Distribución y presencia: Igualmente, se clasifican de acuerdo a su número y su ubicación alrededor del organismo, en átrico (sin flagelos como los cocos), monótrico (con un solo flagelo, por ejemplo el espermatozoide, Trypanosoma cruzi, Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, etc.), lofótrico (un mechón único de flagelos en un extremo como Spirillum serpens, Trichomonas vaginalis, Trichomonas tenax), anfítrico (un mechón de flagelos en ambos extremos como Giardia lamblia, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas pseudomallei) y perítrico (con flagelos distribuidos por toda la periferia como Salmonella typhi, Escherichia coli, Escherichia buchner y Proteus sp). (Figura 4).​​ Atrico Monotrico anfitricas multianfitricas Lofotricas peritrico 6 Práctica 4  B) Microfilamentos (MF): Son estructuras de polímeros helicoidales de la proteína globular Actina, pero, en lugar de formar un túbulo, forma conjuntos de tres o más filamentos de monómeros que se tuercen entre sí, y le da un aspecto de un rosario entrelazado, donde cada cuenta del rosario, simboliza a una molécula de monómero. Gracias a su asociación con otras proteínas, forman filamentos estables, que se pueden organizar en una variedad grande de haces paralelos, unidireccionales, antiparalelos, entre otros que, le confieren el mantener la estructura interna de la célula contribuyendo a la formación del citoesqueleto. Los MF tienen diversos movimientos, que son: muscular, citodiéresis o citocinésis, morfogenéticos, amiboideos y corrientes citoplasmáticas. B.1) Movimiento muscular: El tejido muscular, es uno de los cuatro tejidos que componen al organismo, y, hoy día, sabemos que existen 3 tipos de músculo que son, músculo estriado, músculo liso y músculo cardíaco. Las células musculares estriadas reciben el nombre de fibras musculares, son células muy largas (hasta de 30 cm), cilíndricas y multinucleadas que se agrupan formando haces musculares; la membrana celular recibe el nombre de sarcolema (presenta especializaciones denominadas túbulos transversales o túbulos T, que son invaginaciones hacia el interior de la célula), su citoplasma se denomina sarcoplasma (ocupado por organelos celulares que quedan restringidos al área perinuclear, por ejemplo las mitocondrias o sarcosomas), y su retículo se llama retículo sarcoplasmático (que se encarga del almacenamiento de calcio, fundamental para producir la contracción). De forma intracitoplasmáticamente, cada fibra muscular tiene haces delgados de estructuras llamadas miofibrillas, que presenta bandas claras, y reciben el nombre de filamentos delgados o bandas I (isótropas) y contienen a la agrupación de 3 proteínas contráctiles que son Actina, Tropomiosina y Troponina (aproximadamente entre 1,5000 a 3,000 filamentos cada una), de igual forma, encontramos las bandas oscuras, o bandas A (anisótropas), que contienen la proteína contráctil llamada Miosina. El movimiento se produce por el deslizamiento entre estos filamentos, bajo el control voluntario. La unidad funcional de contracción de la fibra muscular se llama sarcómera o sarcómero, y al ser vistas en el microscopio electrónico, podemos apreciar que se constituyen de la siguiente forma: Cada sarcómera se extiende desde una línea Z hasta una línea Z, conteniendo diversas bandas oscuras y bandas claras. Una sarcómera contiene un par de hemibandas I levemente teñidas localizadas en los bordes externos; con una banda A más densamente teñida, situada entre las bandas I y la zona H que está levemente teñida localizada en el centro de la banda A. Una línea M densamente teñida se localiza en el centro de la zona H. La banda I solo contiene filamentos delgados, la zona H únicamente filamentos gruesos, y la parte de la banda A situada a los dos lados de la zona H representa la región de la superposición (contracción) y contiene ambos tipos de filamentos, (se aprecian mejor en la Figura 5), con una explicación más detallada de cómo sería la miofibrilla en la Figura 6. 6 Práctica 4  Cuando se da la orden de la contracción (en unión neuromuscular), las cabezas de las moléculas de miosina se extienden lateralmente hasta hacer contacto con los filamentos delgados de actina, que en número de seis, rodean a la miosina formando puentes transversales; las cabezas de miosina se inclinan hacia el centro de la sarcómera deslizando los delgados filamentos de la actina sobre el filamento grueso. La energía necesaria para que esto se lleve a cabo está en los puentes que contienen ATP que se hidrolizan gracias a la ATPasa haciendo que las cabezas de miosina actúen como palancas de movimiento de los filamentos de actina, de esta manera, la energía química se transforma en energía cinética, también conocida como energía mecánica o de movimiento. B.2) Citodiéresis: La separación de las dos células al final de la mitosis, recibe el nombre de citodiéresis, y se ha comprobado que existe la presencia de una acumulación de microfilamentos que se deslizan entre sí en la región del surco donde se inicia la segmentación de la célula mediante una transducción quimio-mecánica separando así a las dos células hijas. B.3) Movimientos morfogenéticos: Son aquellos que se realizan en los tejidos durante su desarrollo embrionario, y dichos movimientos se realizan por la presencia de microfilamentos que forman una especie de cinturón en torno del polo apical, tal y como sucede en la invaginación del epitelio bucal durante el desarrollo de la cavidad bucal. B.4) Movimiento Amiboideo: Se trata de prolongaciones del citoplasma hacia afuera (extensión de la membrana celular y posteriormente la emisión del flujo del citoplasma hacia la extensión) denominadas pseudópodos (pseudo = falso, podos = pies), (Figura 7). 6 Práctica 4  Donde se ejemplifican los pasos y formación de un pseudópodo de Amoeba proteus); este tipo de movimiento también se relaciona con la presencia de microfilamentos, que gracias a ellos se llevan a cabo la fagocitosis y pinocitosis; la ameba Entamoeba histolytica, y algunos leucocitos como los monocitos realizan este tipo de movimiento. La diapédesis es un fenómeno que consiste en la emigración de algunos leucocitos a través de los endotelios hacia los tejidos, esto se lleva a cabo gracias a los pseudópodos; la atracción de estos a partículas o bacterias (quimiotaxis) es gracias a sustancias llamadas opsoninas, este se llama quimiotactismo positivo, y cuando las aleja se denomina quimiotactismo negativo. Algunos autores han clasificado a los pseudópodos por su forma, así tenemos que si los pseudópodos son largos y delgados se denominan filopodios; si son cortos y gruesos lobopodios y si tiene forma de red, reticulopodios ( Figura 8). B.5) Corrientes citoplasmáticas: Las corrientes intracitoplasmáticas se realizan gracias a la presencia de microfilamentos que contienen proteínas contráctiles muy semejantes a la actina y a la miosina, y se llevan a cabo sobre todo en células vegetales bajo el nombre de ciclosis. C) Filamentos Intermedios (FI): Son componentes del citoesqueleto cuya función principal es la de proporcionar a la célula o a las estructuras celulares la propiedad de soportar tensiones mecánicas (estructuras de sostén). Este tipo de filamentos, aparecen en las células animales para darle la resistencia mecánica, sin embargo, en las plantas no aparece, ya que la tensión recae en las paredes celulares que llevan a cabo esta acción. Su diámetro es de aproximadamente entre 8 a 15 nm, que se encuentra entre los filamentos de actina (7-8 nm) y el de los microtúbulos (25 nm). 6 Práctica 4  Actualmente, se han descrito dos sistemas de filamentos intermedios: Uno en el citoplasma y otro en el interior del núcleo. Citoplasma: Forman una red que conecta con el núcleo y se extiende hasta la periferia celular (Figura 9), ubicándose anclados a los complejos de unión entre células vecinas (como desmosomas y uniones focales) y entre las células y la matriz extracelular (hemidesmosomas). Núcleo: Forman la lámina nuclear, que es un entramado que da forma y cohesión al propio núcleo. Se estima que pueden estirarse hasta un 250% a 300% de su longitud inicial cuando son sometidas a fuerzas de tensión, y, cuando esto ocurre, disminuyen su diámetro; sin embargo, cuando llega el momento donde no se pueden estirar más, actúan como cables resistentes, formando redes duras. Es por eso que los filamentos intermedios son más estables a comparación de los microtúbulos y los filamentos de actina, gracias a su gran capacidad de organizarse y desorganizarse. Esto, lo logran gracias a procesos de fosforilación y desfosforilación por quinasas y fosfatasas, además de chaperonas. Recientemente, la clasificación de los filamentos intermedios se divide en 6 grupos o clases: C.1) FI Clase I y II: Queratinas ácidas y básicas respectivamente. Al combinarse, nos dan las queratinas de las células, y éstas, son abundantes en células epiteliales. Son el grupo con más diversidad de elementos, ya que se conoce que hay 54 genes para queratinas diferentes, donde 28 corresponden al tipo I y 26 al tipo II. La epidermólisis bullosa simple es una enfermedad a causa de mutaciones en la queratina 14 o 5, que provoca que se desprendan los desmosomas y hemidesmosomas, alterando así a la queratina, que se traduce en una piel muy vulnerable al daño mecánico, es decir, que se necesita muy poca presión sobre la piel para producir descamaciones. C.2) FI Clase III: Se subdivide en 4 grupos: Vimentinas (expresadas en células mesenquimáticas, leucocitos, células embrionarias), Desminas (células musculares de tipo liso, esquelético y cardíaco), Proteína Fibrilar Ácida (solamente aparece en astrocitos y otras células de la glía) y Periferina (expresada en nervios craneales y neuronas periféricas). Al tener ausencia de estos filamentos, provoca debilidad muscular, arritmias cardíacas y cardiopatías diversas. 6 Práctica 4  C.3) FI Clase IV: Incluye a los neurofilamentos, como la sinemina, sincoilina y a- internexina. De acuerdo a su peso molecular igualmente se clasifican en Ligeros, Medios y Pesados. Son relevantes en neuronas maduras, para la organización de dendritas y axones, así como de interaccionar con filamentos de actina. Algunas patologías asociadas a la ausencia de estos filamentos son por ejemplo la enfermedad de Parkinson, donde se agrega más neurofilamento e hiperfosforila, bloqueando el transporte axónico y provocando incluso muerte cerebral. La Esclerosis Lateral Amiotrófica puede surgir por la acumulación de filamentos hiperfosforilados degenerando así a neuronas motoras. C.4) FI Clase V: Familia que incluye a las láminas nucleares A, B y C. Son los únicos filamentos intermedios que no se encuentran en el citoplasma, y realizan el soporte con el núcleo, del lado citoplasmático al lado citonuclear para mantener una correcta arquitectura del núcleo. C.5) FI Clase VI: Una nueva clase añadida recientemente que incluye a proteínas del ojo como filensina y faquinina (ubicadas en el cristalino), así como de nestinas que son expresadas en células nerviosas y musculares en el desarrollo del embrión. Pasos en la formación de los filamentos intermedios y su organización estructural definitiva. Fuente: Biología Celular y Molecular. Edward M. De Robertis. Editorial Promed. Buenos Aires, Argentina. Año 2016. 6 Práctica 4  Práctica Esta práctica consta de 3 experimentos con la finalidad de observar diferentes tipos de movimiento celular. Movimiento Flagelar: 1. Se obtendrá semen aproximadamente 10 minutos antes de iniciada la práctica dado el corto tiempo de vida del espermatozoide fuera de su medio. 2. El semen se depositará en un frasco pequeño de boca ancha y con una pipeta Pasteur se colocará una gota de semen sobre la laminilla/portaobjetos. 3. Colocar un cubreobjetos y observar al microscopio NOTA: Es preferible su observación con el objetivo denominado “seco fuerte”. Movimiento del espermatozoide Movimiento ciliar del Paramecium Representación del movimiento gracias a su flagelo Caudatum ameboideo realizado con mercurio Movimiento Ciliar: 1. Llenar un frasco con agua de laguna, floreros de panteón (no aguas negras) hasta aprox. ¾ partes. 2. Agregar lechuga, papa, cáscara de plátano, plantas acuáticas en pequeños trozos y una gota de leche. 3. Colocar el frasco ámbar en un lugar templado dentro de casa donde reciba calor y luz solar indirecta(cerca de una ventana) y destapado durante 8 días para lograr la reproducción óptima del Paramecium. 4. Con el cultivo listo, se colocará con ayuda de una pipeta una gota del cultivo, se colocará un cubreobjetos y se podrá visualizar al microscopio. Movimiento Ameboideo: Se trata de una imitación del movimiento. 1. En un vidrio de reloj se colocarán aproximadamente 10 gotas de Hg (mercurio). 2. Posteriormente se cubrirá con una solución de agua destilada y dicromato de potasio (K2Cr2O7) para después agregar unas gotas de ácido nítrico en la periferia hasta lograr la reacción (se rompe la tensión superficial del Hg). 3. Absorber la solución con papel sanitario al finalizar la reacción y de esta forma recuperar el Hg. NOTA: Para la observación de trofozoitos reales es recomendable un estudio de “amiba en fresco” 6 Práctica 4  NOTAS 6 Práctica 4 5 Practica 5 Tinción Wright-Giemsa OBJETIVO. Conocer la técnica y utilidad de la tinción de Wright en la práctica clínica y observar e identificar los diferentes componentes celulares sanguíneos así como sus características morfológicas. MATERIALES. -Microscopio óptico. -Lanceta. -Torundas con alcohol. -Guantes. -Asa de tinción. -Cubeta de tinción. -Portaobjetos. -Agua destilada. -Buffer fosfato. -Tinción Wright. -Pipetas. -Sanitas o servitoallas. Introducción. La sangre es uno de los tejidos más importantes de nuestro cuerpo. Realiza diversas funciones como el transporte de nutrientes y eliminación de desechos del cuerpo, así como transporte de hormonas desde el órgano secretor hasta el tejido diana. La sangre es una suspensión, por lo que está compuesta por una parte líquida (45-55%) y una parte sólida (45-55%); la parte líquida es el plasma, mientras que la parte sólida está compuesta por los elementos formes. Componentes de la sangre Contenido Factores de la coagulación y otras Plasma. proteínas. Elementos formes. Eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Tabla 5.1 Componentes sanguíneos (2020). Sangre y hematopoyesis. Kierszenbaum, Abraham L., M.D., Ph.D.; Tres, Laura L., M.D., Ph.D. Histología y biología celular, 5e. Elsevier. 7  Hematopoyesis. Un adulto promedio contiene alrededor de 5 L de sangre o entre 7-8% de su peso corporal, pero, ¿cómo surge la sangre? El proceso mediante el cual se crea la sangre y sus derivados se conoce como hematopoyesis, la cual comienza desde la vida embrionaria en las primeras semanas. Podemos dividir la hematopoyesis en dos sistemas: uno primitivo (embrionario) y uno definitivo (adulto). El primero comienza alrededor de la segunda semana de vida embrionaria siendo el saco vitelino el primer órgano hematopoyético, de ahí, alrededor del primer mes de vida embrionaria, el hígado pasa a ser el segundo órgano hematopoyético ocupando el lugar del saco vitelino (de igual forma intervienen otros órganos como el bazo, el timo y los ganglios linfáticos, aunque en menor medida); es alrededor del cuarto mes de vida embrionaria que se inicia la hematopoyesis en la cavidad medular de los huesos, la cual se torna más importante alrededor del sexto mes, alcanzando su punto máximo alrededor de la semana 30. Es así que, para el tercer trimestre, prácticamente toda la producción de sangre se da en la médula ósea. Línea mieloide. En la hematopoyesis, el proceso de formación de células sanguíneas, se origina en células madre hematopoyéticas en la medula ósea. La diferenciación celular se divide en la línea mieloide y la línea linfoide. La línea mieloide da lugar a una variedad de células especializadas, incluyendo eritrocitos, plaquetas y algunos tipos de leucocitos o glóbulos blancos. Por lo tanto para esta práctica nos enfocaremos en cuatro protagonistas cruciales de la respuesta inmunológica y el transporte de oxígeno: eritrocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos y plaquetas. Línea linfoide. La línea linfoide también desempeña un papel clave en la tolerancia inmunológica, evitando reacciones inmunitarias inapropiadas contra las propias células del cuerpo dando lugar a trastornos inmunológicos, como inmunodeficiencias o enfermedades autoinmunes. Los órganos linfoides primarios, como el timo y la médula ósea, son cruciales para el desarrollo y la maduración de estos linfocitos. A medida que estos linfocitos maduran, se trasladan a órganos linfoides secundarios, como los ganglios linfáticos y el bazo, donde la interacción y la coordinación entre diversas células inmunitarias se vuelven fundamentales. En el corazón de la línea linfoide se encuentran los linfocitos, células altamente especializadas responsables de reconocer y eliminar invasores extraños, los cuales se describen a continuación. 6 Práctica 5  Gráfico 5.1 Linaje celular sanguíneo Se muestran las principales células hematopoyéticas presentes en la sangre. Hemoglobina. La hemoglobina (Hb), es una proteína globular que se encuentra en los eritrocitos. Su función principal es transportar oxígeno desde los pulmones a los tejidos y eliminar el dióxido de carbono, proveniente de los tejidos, a los pulmones para su eliminación. Esta molécula consiste en cuatro subunidades proteicas, cada una unida a un grupo hemo que contiene un átomo de hierro (Fe+²), siendo esencial para la unión de la hemoglobina con el oxígeno. Existen varios tipos de hemoglobina, cada uno con características únicas y roles específicos en la distribución de oxígeno en el cuerpo: Hemoglobina A (HbA): Es la forma predominante en adultos, compuesta por dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Representa aproximadamente el 97% de la hemoglobina en adultos sanos. Hemoglobina A2 (HbA2): Conformada por dos cadenas alfa y dos cadenas delta. Constituye alrededor del 2-3% de la hemoglobina en adultos. Hemoglobina Fetal (HbF): Presente en el feto durante el desarrollo intrauterino. Compuesta por dos cadenas alfa y dos cadenas gamma. Su presencia disminuye gradualmente después del nacimiento. Dato curioso Dentro de las patologías de la sangre encontramos a las talasemias, un grupo de trastornos genéticos hereditarios que impactan la síntesis de las cadenas de globina, lo que conduce a una producción anormal de hemoglobina. Estas afecciones, clasificadas como alfa o beta talasemias según la cadena de globina afectada, pueden variar en gravedad y síntomas. 6 Práctica 5  Eritrocitos. Los eritrocitos, también conocidos como glóbulos rojos, son células sanguíneas especializadas en el transporte de oxígeno desde los pulmones hacia los tejidos y la entrega de dióxido de carbono desde los tejidos a los pulmones, se caracterizan por la ausencia de núcleo, considerados como el producto final de la eritropoyesis. Su característico color rojo se debe a la hemoglobina, una proteína rica en hierro que forma parte esencial de estos diminutos transportadores de oxígeno. La función primordial de los eritrocitos es garantizar un suministro eficiente de oxígeno a todas las células del cuerpo, contribuyendo así a la producción de energía y al mantenimiento de la homeostasis. Su vida media es de alrededor de 120 días. Las alteraciones en su citomorfología conducen a diversas patologías, algunas de ellas se resumen a continuación. ALTERACIÓN MORFOLÓGICA DESCRIPCIÓN CAUSA Células pequeñas con proyecciones Acantocitos Abetalipoproteinemia. espinosas regulares en su superficie. Variación anormal del tamaño de los Anisocitosis Cualquier anemia. eritrocitos (diámetro normal 6 a 8 μ).