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• Il corso è "Metodi Tecnici di Chimica e Biochimica"
• La lezione attuale è la Lezione 1
• La docente è Serena Bonin

Obiettivi del Corso

• Fornire le conoscenze di base sui metodi analitici di tipo chimico e biochimico impiegati nell'ambito del Laboratorio biomedico.

Testo di Approfondimento

• Ciaccio: Trattato di Biochimica Clinica e Medicina di Laboratorio-Ed EDISES, anno di pubblicazione 2021

Modalità d'esame

• Testo scritto (prova parziale)

Teams del corso

• Codice: f8b88tp

Materiale del corso

• File PowerPoint caricati nel canale Teams

Classificazione del Laboratorio Biomedico sulla Base della Matrice Biologica

• Rientrano l'area siero e/o plasma (Li eparina oe/o plasma EDTA), area ematologia (EDTA), area coagulazione (Na citrato), area esami urine standard

Classificazione del Laboratorio Biomedico sulla Base delle Attività Tecniche Analitiche/Strumenti Impiegati

• Aree presenti: accettazione campioni, chimica clinica, immunochimica, emocromocitometrica, proteine, tossicologia, microbiologia, immunoematologia, biologia molecoaere e/o citogenetica

Laboratori

• Possono essere pluridisciplinari o specialistici

Funzione del Laboratorio Biomedico

• Assistere il medico nella diagnosi, prognosi, scelta e monitoraggio della terapia, e screening

Tecnico di Laboratorio Biomedico

• Genera numeri che diventano informazioni cliniche qualificate solo se ottenuti con criteri ben precisi
• Questi dati sono il risultato di misurazioni che rappresentano il compito principale del tecnico sanitario di laboratorio biomedico.
• Deve conoscere le variabili che possono influenzare una misura, trattare correttamente i campioni in esame, e conoscere le tecniche di misura manuale e i principi di funzionamento degli strumenti di laboratorio

Definizioni di Metrologia

• Misurazione: processo per descrivere quantitativamente una proprietà o grandezza di un oggetto o fenomeno
• Misura: risultato di una misurazione, composto da valore numerico, unità di misura e grado di incertezza
• Grandezza: attributo qualitativo o quantitativo di un oggetto o fenomeno
• Misurando: grandezza oggetto della misurazione, definita nel suo stato
• Unità di misura: grandezza convenzionale per esprimere grandezze della stessa dimensione
• Incertezza di misura: stima dell'intervallo di valori in cui cade il valore più probabile del misurando

Processo di Misurazione

• Individuazione del misurando, definizione dello stato, motivo della misurazione, scelta del metodo di misura

Metodi di Misura Diretti

• Esempi includono la potenziometria per misurare la ddp dovuta a cariche elettriche di ioni trasportati in soluzione e l'abbassamento del punto criogenico
• Questi metodi permettono di ottenere risultati rapportabili tra loro con bassa incertezza di misura

Metodi di Misura Indiretti

• Richiedono vari passaggi prima di ottenere il segnale da misurare
• È fondamentale conoscere le relazioni fra i prodotti che si formano nelle reazioni
• Ogni passaggio introduce un grado di incertezza, che contribuisce all'imprecisione totale

Metodi Indiretti

• La grandezza non è misurabile direttamente ma richiede reagenti specifici che formano prodotti misurabili con strumenti di laboratorio.
• La strumentazione idonea rileva un segnale trasformato in MISURA tramite la calibrazione.
• Il rapporto segnale-grandezza è stabilito da reazioni chimiche/fisiche; la spettrofotometria usa spesso la legge di Lambert-Beer

Legge di Lambert-Beer

• Descrive l'assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche, fondamentale in spettrofotometria.
• Se una luce monocromatica di intensità I₀ colpisce una soluzione, e I è l'intensità della radiazione uscente, allora:
  • La trasmittanza T è il rapporto tra I e I₀
  • L'assorbanza Aabs è il logaritmo in base 10 dell'inverso di T

Correlazione tra Aabs e T

• Sono correlate rispettivamente alla frazione di energia radiante assorbita o trasmessa dal campione e sono quindi numeri puri. L'assorbimento è descritto dalla legge di Bouguer-Lambert-Beer.
• La legge di Beer è generale per l'assorbimento di radiazione elettromagnetica.
• È stato dimostrato che l'intensità I dipenda dalla radiazione incidente I₀, dal cammino ottico b e dalla concentrazione dell'analita.

Coefficiente di assorbimento molare

• Dipende dalla radiazione assorbita, dal solvente e dalla specie chimica

• La legge di Beer si scrive: ε

• Poiché NON è noto, è necessario costruire una curva di taratura con soluzioni standard dell'analita

• Rappresenta l'assorbanza di una soluzione a concentrazione 1M e cammino ottico unitario (1cm).

• La radiazione assorbita dipende dal cammino ottico, dalla concentrazione delle molecole che assorbono, e dalle condizioni in cui si trova la sostanza.

Assorbimento in Funzione

• La risposta dell'assorbanza in funzione della concentrazione è lineare solo in un intervallo di valori

Utilità della Misurazione dell'Assorbimento di una Soluzione

• Il coefficiente di assorbimento molare rappresenta la pendenza della retta di calibrazione che mette in relazione l'assorbanza rispetto alla concentrazione

Dipendenza della Legge di Beer dalla Concentrazione

• Gli spettri di assorbimento del MnO₄⁻ a diverse concentrazioni mostrano che i numeri adiacenti alle curve indicano la concentrazione del Mn in ppm.
• In questo caso, la specie assorbente è lo ione permanganato con un cammino ottico della cella di 1 cm.
• ll grafico dell'assorbanza alla del picco a 525 nm in funzione della concentrazione è lineare dimostrando che la relazione soddisfa la legge di Beer.

Deviazioni dalla Linearità: Fattori Fisici e Chimici

• Concentrazioni troppo elevate causano cambiamenti nell'indice di rifrazione della soluzione.
• Concentrazioni eccessive di assorbente o elettrolita.
• Variazioni del pH (HIn + H₂O ⇄ H₃O⁺ + In⁻).
• La temperatura può influenzare l'equilibrio chimico.
• Soluzioni torbide causano scattering della luce.

Deviazioni dalla Linearità: Fattori Strumentali

• L'aderenza alla legge di Beer è stretta solo con radiazioni monocromatiche.
• La luce diffusa contamina la radiazione uscente dal monocromatore.
• I rumori strumentali influenzano la misurazione.
• Se è elevata la concentrazione, I tende a 0, aumentando l'influenza degli errori sull'assorbanza

Applicazioni Quantitative della Spettroscopia di Assorbimento

• Ampia applicabilità
• Alta sensibilità: i limiti di rivelabilità variano da 10⁻⁴ a 10⁻⁵ M, arrivando a 10⁻⁶ e 10⁻⁷ M con accorgimenti.
• Selettività da moderata ad alta
• Elevata accuratezza con errori tra l'1-5% (fino a 0.1% con precauzioni adeguate)
• Facilità e convenienza

Spettrofotometro

• Strumenti per misurare l'assorbimento della luce nelle soluzioni con vari elementi:
  • Sorgente di luce, monocromatore, compartimento campioni (porta cuvette), rivelatore, indicatore del segnale

Applicazioni Quantitative della Spettroscopia di Assorbimento

• Selezione della lunghezza d'onda
• Ottimizzazione delle variabili (pH e mascheramento interferenti)
• Determinazione della relazione tra assorbanza e concentrazione tramite calibrazione
• I kit di immunochimica forniscono calibratori per generare curve di calibrazione a più punti (calibrazione con standard esterno).

Standard del campione

• È di centrale importanza che la composizione degli standard sia simile a quella del campione incognito, poiché' soluzioni diverse possono dare tipi di interferenze che influenzano il segnale

Chimica Clinica

• Le analisi misurano concentrazioni o attività di sostanze (ioni, molecole, complessi) nei fluidi corporei.
• Possono essere utilizzati diversi tipi di fluidi corporei, ad esempio: sangue intero, plasma, siero, urine e liquido cerebrospinale
• L'interpretazione si basa sul confronto con un intervallo di riferimento o un livello deciso dai medici per la diagnosi.
• Si quantificano analiti che sono biologicamente rilevanti. I metodi sono progettati per fornire una stima rigorosa e accurata della loro concentrazione
• Il laboratorio si occupa principalmente delle molecole
• Le analisi consentono di misurare le concentrazioni di ioni biologicamente significativi (sali e minerali), piccole molecole organiche e macromolecole (soprattutto proteine).