Les 7 Fermentatie Hoofdstuk 5 en 6 Periode 8 RB 23-24_1535827104.pptx

Theorie Fermentatie, Metabolisme & Chromatografie (FerMetChro) Periode 8 2de leerjaar, profielfase BML R.Broer Kamer: T122 Email: [email protected]  Fermentatie Technieken Theoriemodule...

Theorie Fermentatie, Metabolisme & Chromatografie (FerMetChro) Periode 8 2de leerjaar, profielfase BML R.Broer Kamer: T122 Email: [email protected]  Fermentatie Technieken Theoriemodule Hoofdstuk 1 - Fermentatie Technieken Theorie Hoofdstuk 2 – Fermentatie – technieken en achtergronden Hoofdstuk 3 – Biomoleculen - de Sacchariden Hoofdstuk 4 – Metabolisme – de Cellulaire Respiratie Hoofdstuk 5 – Eiwitten in de praktijksituatie Hoofdstuk 6 – Eiwitzuiveringsmethoden Hoofdstuk 7 – Enzymkinetiek – de verdieping  H5 – Eiwitten in de praktijksituatie  Lesdoelen Na deze les weet je… … hoe de concentratiebepalingen van eiwitten worden gedaan … wat de invloed van temperatuur is op eiwitten … wat de invloed van pH is op eiwitten … hoe eiwitten bewaard kunnen worden  Eiwitten in de praktijk Concentratie bepalingen – UV-absorptie bij 280 nm Tyrosine en Tryptofaan gehalte De extinctiecoëfficiënt zegt iets over hoeveel tyr en trp er aanwezig is in het eiwit (hoge is veel tyr/trp) – E260/E280 Maat voor zuiverheid  OOK VOOR EIWITTEN!! Verhouding is dan ongeveer 0,56 (nucleïnezuren: 1,8) 280 – Waarom niet alleen E280 meten?  Eiwitten in de praktijk Concentratie bepalingen – E260/E280 Maat voor zuiverheid  OOK VOOR EIWITTEN!! Verhouding is dan ongeveer 0,56 UV spectrum van zuivere aminozure – Waarom niet alleen E280 meten? UV spectrum van DNA 280  Eiwitten in de praktijk Concentratie bepalingen – Blanco Bufferionen die binden aan glaswand dragen bij in de E280 meting Fosfaatbuffer NIET! Op nul stellen met buffer en met voorgespoelde cuvet, voorkomt bijdrage aan E280 meting!  Zijn we nog wakker ;-) ??? Dragen alle aminozuren in een eiwit bij aan de extinctie waarde die je krijgt bij het meten van de extinctie van een eiwitoplossing bij 280 nm ?  Eiwitten in de praktijk Invloed van temperatuur De conformatie van eiwitten verandert met de temperatuur Te hoge temperatuur denaturatie Gevoeligheid voor extreme veranderingen – irreversibel!!  Eiwitten in de praktijk Eigenschappen van enzymen Enzymen zijn eiwitten – dus eigenschappen komen overeen! – Temperatuurgevoeligheid – pH gevoeligheid – Ladingstoestand (ten gevolge van pH) – Stralingsgevoeligheid Enzymen hebben extra eigenschappen (functioneel) – Specificiteit – Invloed van effectoren – beïnvloeden werking  Eiwitten in de praktijk Eigenschappen van enzymen A – bij toenemende temperatuur Temperatuurgevoeligh zal de stabiliteit enzym afnemen eid (meer atoombewegingen, vorm verandert) B – bij toenemende temperatuur zullen meer substraatmoleculen botsen met de actieve plaats op het enzym (toename reactiesnelheid) D – denaturatie van enzymen, verlies van actieve plaats nemen overhand (snelle afname van reactiesnelheid) C – optimale temperatuur (balans  Eiwitten in de praktijk Eigenschappen van enzymen Temperatuurgevoeligheid – Conformatieveranderingen door temperatuur zijn niet altijd meetbaar Weergave enzymactiviteit algemeen Temperatuuroptimum kan verschille  Zijn we nog wakker ;-) ??? Waarom zal de activiteit van een enzym eerst stijgen, maar uiteindelijk toch afnemen, bij een geleidelijke verhoging van de reactie temperatuur ?  Eiwitten in de praktijk Eigenschappen van enzymen pH gevoeligheid – Optimum pH is voor verschillende enzymen anders – afhankelijk van voorkomen in natuur  Eiwitten in de praktijk Eigenschappen van enzymen pH gevoeligheid – Optimum pH is voor verschillende enzymen anders – afhankelijk van voorkomen in natuur – Is de pH waarde voor een enzym te anders  Zwavelbruggen breken  Denaturatie pH waarde extreem afwijkend aan optimum  Zijn we nog wakker ;-) ??? Waarom zal de activiteit van een enzym bij een toenemende pH waarde van het reactie mengsel eerst stijgen, maar uiteindelijk toch afnemen ?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Waarom hebben verschillende enzymen vaak verschillende optimale pH waarden ?  Eiwitten in de praktijk Zuiverheid van eiwitoplossingen Detectie van actieve eiwitten Diverse opties: activiteit van enzymen meten (als het eiwit een enzym is) verhouding enzymactiviteit en totale eiwitconcentratie  mate van zuiverheid molmassa (als het eiwit geen enzym is) lading eiwit (geen enzym) Methoden: Chromatografie (FPLC) – UV-spectrum (E 280) – ELEKTROFORESE  Eiwitten in de praktijk Bewaren van eiwitten NaN3 Afhankelijk van de vorm van voorkomen: toevoege n (= bacterie- Droge vorm (gevriesdroogd) Langere tijd stabiel remmer) of filtreren In oplossing (waterig) Grote variaties In de koelkast – enkele dagen tot soms weken lang Belangrijk – hoge concentratie (eventueel toevoegen albumine) Grootste gevaar – proteasen / micro-organismen Compact eiwit verkrijgen door toevoegen van zout: NaCl / (NH4)2SO4 In de diepvries – met glycerol bijv. restrictie-enzymen  Eiwitten in de praktijk Bewaren van eiwitten Afhankelijk van de vorm van voorkomen: Invriezen Langere tijd goed houdbaar Snel invriezen van belang (zouten en ijskristallen) Herhalen invriezen/ontdooien voorkomen (kleine aliquots maken) Ontdooien VOORZICHTIG! Niet in een warm waterbad ontdooien – Kans op denaturatie Ontdooien in je hand of (zeer langzaam) op ijs  Eiwitten in de praktijk Bereiding van eiwitoplossingen Eiwitten kunnen langzaam oplossen – NIET ROEREN ETC.!! Eiwitten kunnen een klein beetje bufferen (zure en basische groepen), maar is de concentratie laag, dan lukt dat niet! Oplosbaarheid eiwit – afhankelijk van IEP In een buffer met de pH waarde bij het IEP van het eiwit  het eiwit lost maar MINIMAAL op Adsorptie aan glas – let op glas is negatief geladen, eiwitten kunnen positief geladen zijn  aantrekking en neerslagvorming  Eiwitten in de praktijk Opdracht deel I : Lees Hfdst 5 Maak opgave 1  Hoofdstuk 6 Eiwitzuiveringsmethoden  Lesdoelen Na deze les weet je… … het algemene schema van eiwitzuiveringen … de termen specifieke activiteit, totale activiteit en zuiveringsfactor en weet je hoe je berekend worden … wat affiniteitschromatografie is en hoe het werkt  Eiwitzuiveringsmethoden Efficiëntie van zuiveringstappen Doel van eiwitzuivering: Het bepalen in hoeverre de concentratie van de gewenste component is toegenomen, in vergelijking met de andere biomoleculen in het oorspronkelijk monster Eiwitzuiveringsmethoden  Eiwitzuiveringsmethoden Efficiëntie van zuiveringstappen Isolatie van enzymen → twee criteria – Specifieke activiteit en totale activiteit Activiteit (U) → 1 unit is de hoeveelheid enzym die 1 µmol substraat per minuut omzet (1 µmol/min)  Eiwitzuiveringsmethoden Efficiëntie van zuiveringstappen Specifieke activiteit (S.A) → activiteit gedeeld door de hoeveelheid eiwit in de oplossing – U/mg eiwit of kat/kg eiwit – Dus maat voor de zuiverheid – Hoe zuiverder het enzym, des te minder andere eiwitten in de oplossing aanwezig zijn, des te hoger de S.A.  Eiwitzuiveringsmethoden Efficiëntie van zuiveringstappen Totale activiteit → aantal eenheden aan activiteit dat in de oplossing aanwezig is. Zuiveringsfactor → mate van zuiverheid –  Zijn we nog wakker ;-) ??? Wat is het doel van eiwitzuivering?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Wat is ook alweer de definitie van een unit (U) enzymactiviteit?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Hoe bereken je de Specifieke Activiteit van een enzym?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Waarom is de Specifieke Activiteit van een enzym een maat voor de zuiverheid ?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Hoe bereken je de zuiveringsfactor van een gezuiverd enzym?  Eiwitzuiveringsmethoden Zuiveringsmethode – Chromatografie – Voor chemische en biologische moleculen – Techniek waarbij van verschil in voorkeur van moleculen gebruik wordt gemaakt – Voorkeur  verblijf in de mobiele fase – Voorkeur  plakken aan de stationaire fase  Eiwitzuiveringsmethoden Zuiveringsmethode – Chromatografie – 4 verschillende fysisch-chemische processen (1)Verdelingschromatografie (2)Adsorptiechromatografie / Affiniteitschromatografie (3)Ionwisselingschromatografie (4)Gelpermeatiechromatografie  Eiwitzuiveringsmethoden Verschillende typen kolomchromatografie Stoffen hechten Geladen stoffen Scheiding op basis met verschillende hechten aan van molecuulgrootte. affiniteit (polair / tegengesteld Grote moleculen gaan apolair) aan het geladen kolom. sneller door de kolom kolommateriaal. Door de stoffen van omdat deze niet door Door wijziging in lading te laten alle kleine kanaaltjes de mobiele fase veranderen, komen gaan. aan te brengen, de eiwitten los van laten de stoffen de kolom.  Eiwitzuiveringsmethoden Affiniteits chromatografie Affiniteits Chromatografie Scheiding op basis van specifieke binding. Het te zuiveren molecuul bind specifiek aan een molecuul (ligand) gekoppeld aan de stationaire fase. De overige biomoleculen binden niet aan de kolom. Het specifieke gebonden molecuul kan daarna van de kolom worden geïsoleerd door de binding met het ligand te verbreken  Eiwitzuiveringsmethoden Affiniteitschromatografie – Principe Aan kolommateriaal wordt extra specificiteit toegevoegd  ligand Ligand kan specifiek een eiwit binden (antilichaam met antigeen) Alle andere eiwitten zullen niet worden gebonden en  Zijn we nog wakker ;-) ??? Noem 4 methoden van kolomchromatografie die gebruikt kunnen worden om biomoleculen te zuiveren ?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Adsorptie chromatografie is scheiding van de biomoleculen op basis van ?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Ion exchange chromatografie is scheiding van de biomoleculen op basis van ?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Gel filtratie / Size exclusion chromatografie is scheiding van de biomoleculen op basis van ?  Zijn we nog wakker ;-) ??? Affiniteits chromatografie is scheiding van de biomoleculen op basis van ?  Eiwitzuiveringsmethoden Affiniteitschromatografie – Principe Voorbeeld van liganden voor het zuiveren van verschillende soorten stoffen (blz. 73): Te zuiveren Ligand dat gebruikt kan component worden Enzym Substraat, substraat aanvlogen, remmer, cofactor Antilichaam Antigeen, virus, cel Nucleïnezuren Complementaire base volgorde, histonen, bindingsproteïne, nucleïnezuur- polymerase Hormoon, vitamine Receptor, carrier protein (drager eiwit)  Eiwitzuiveringsmethoden Affiniteitschromatografie - Zuiveren van antilichamen mbv antigeen als ligand De fases van affiniteits- chromatogra fie  Eiwitzuiveringsmethoden Opdracht deel II : Lees Hfdst 6 Maak opgave 1