Tema 1: Introducción a la Bioquímica Industrial PDF

TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA INDUSTRIAL La bioquímica industrial es la disciplina que estudia el empleo de las capacidades de las enzimas en las aplicaciones industriales. Por tanto, los objetivos de ésta son el uso industrial de los procesos bioquímicos en los que intervienen las enzimas p...

TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA BIOQUÍMICA INDUSTRIAL La bioquímica industrial es la disciplina que estudia el empleo de las capacidades de las enzimas en las aplicaciones industriales. Por tanto, los objetivos de ésta son el uso industrial de los procesos bioquímicos en los que intervienen las enzimas para la obtención de nuevos productos y/o las mejoras de las características tecnológicas de los elaborados tradicionalmente. 1. EVOLUCIÓN HISTÓRICA Con relación a la evolución de la bioquímica industrial podemos diferenciar varias etapas. Antes de 1800. Hasta este siglo se realizaban diferentes procesos industriales empleando procesos biológicos, a pesar de que no se tenía el conocimiento del porqué, de cuáles eran las bases fisiológicas de los mismos. Desde los albores de la civilización se han empleado reacciones enzimáticas en procesos como la elaboración del queso, pan o bebidas alcohólicas. Los sumerios y los babilonios en el 6000 a.C. empleaban levaduras para fabricar cerveza. En el 4000 a.C. Los egipcios descubrieron la manera de fermentar pan con levadura cervecera. Entre 1800-1900. En el siglo XIX se descubrieron y establecieron cuáles eran las bases biológicas y bioquímicas de los mismos. Algunos de los hitos de esta época fueron los siguientes: ○ 1833-35. Payen y Persoz. Obtención de un complejo enzimático activo a partir de levaduras. Conversión del almidón gelatinizado en azúcares simples. ○ 1836. Cristian Hansen. Obtención de renina en solución salina a partir de estómagos de rumiantes lactantes. ○ 1897. Hermanos Buchner/Louis Pasteur. Elaboración de un extracto de levaduras capaz de transformar la glucosa en etanol. ○ 1876. William Kühner. Propuso el término enzima. ○ 1883. Johan Kjeldahl. Determinación analítica de proteínas. ○ 1894. Dr. Jokichi Takamina. Producción comercial de “koji” a partir de Aspergillus oryzae. Después de 1900. En este periodo se produce una gran explosión en el campo de la bioquímica industrial adaptando infinidad de procesos industriales con procesos biológicos hasta llegar a la industria enzimática que tenemos en la actualidad. 2. ENZIMAS Las enzimas son grupo de macromoléculas de naturaleza proteica (heteropolisacáridos formados por la unión de aminoácidos por enlaces peptídicos). Están presentes en las células vivas donde controlan la inmensa mayoría de los procesos fisiológicos de ellas, como el metabolismo, el crecimiento, la división, la expresión génica, etc. La secuencia de aminoácidos forma la denominada estructura primaria. El plegamiento y las interacciones entre los aminoácidos que forman la estructura primaria originan las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas. Y finalmente, la interacción entre varios polipéptidos da lugar a la estructura cuaternaria de las proteínas. Una de las características principales y más definitoria de las enzimas es su capacidad catalítica. La presencia de enzimas en las reacciones bioquímicas produce una gran disminución de la energía de activación, lo que se traduce en un gran aumento de la velocidad de la reacción (1012 -1020). Además, al ser catalizadores no se consumen en el proceso que catalizan y tras él recuperan su estado original, quedando así activas tras la reacción (recordar que tienen una capacidad catalítica finita marcada por el turn over). Existe una gran cantidad diferente de enzimas, y todas ellas con una especificidad de actuación sobre un determinado sustrato muy alta. Esto es una característica muy importante en la industria, porque genera altos rendimientos con escasos subproductos. Otras características que hacen de las enzimas componentes de gran interés para la industria son: Alta eficacia. 1 mol de enzima puede llegar a catalizar 103 -106 moles de sustrato. Forman parte de un ambiente sostenible. Al tratarse de material biológico se degrada e incorpora a la naturaleza sin dejar residuos contaminantes al medio ambiente. Actividad en condiciones moderadas. Las enzimas trabajan en unas condiciones limitadas de presión, pH y temperatura. 2.1. TIPOS DE ENZIMAS Proteasas. Son aquellas enzimas que catalizan la rotura hidrolítica de las proteínas actuando sobre el enlace peptídico. Ejemplos: catepsina, calpaína, proteasas ácidas o neutras… Entre las aplicaciones de este grupo están la fabricación de detergentes, queserías, curtido, modificación de ingredientes, desarrollo de aromas… Amilasa. Son aquellas enzimas encargadas de la hidrólisis de los almidones. Existen varias enzimas dentro de este grupo cuya diferencia primordial es la parte del almidón que sirve como sustrato de la reacción. Tiene un gran interés en la industria de los siropes de maíz, en la panificación o en la elaboración de detergentes. Celulasas. Catalizan la degradación de las fibras de celulosa y derivados. o ○ Celulasa. Esta enzima es la que degrada la celulosa. Se distinguen exocelulasas o endocelulasas según si rompe un enlace 1-4 terminal o un enlace 1-4 endo, respectivamente. Se emplea en el lavado a la piedra para el procesamiento de textil vaquero o para rejuvenecimiento de fibras de algodón. ○ Hemicelulasas. Degradan la hemicelulosa (xilanos, mananos, glucomananos, galactoglucomananos). La aplicación principal es en la industria de alimentación animal. ○ Pectinasas. Degradación de pectinas (ácido galacturónico). Existen varias enzimas dentro de este grupo con interés como: endopectinasas, exopectinasas, pectinesterasas, o pectato liasa. Aplicaciones: extracción de zumos de frutas, de-pectinización de zumos, alimentación animal. ○ Beta-gluconasa. Aplicaciones: elaboración de vino, clarificación, ayuda a filtración, alimentación animal. Isomerasas. Isomerizan moléculas. Como ejemplo tenemos la glucosa isomerasa que isomeriza la glucosa a fructosa. Esta se emplea en la industria del almidón. Lipasas. Hidrólisis de lípidos. Se emplea en detergentes, quesería, panificación.  Oxidoreductasas. ○ Glucosa oxidasa. Cataliza la transformación de la glucosa en ácido glucónico. Se emplea en la eliminación de la glucosa del huevo y en la prevención de aromas indeseables en zumos. ○ Catalasa. Aplicaciones: teñido de algodón, desinfección de lentes de contacto. ○ Lacasa (polifenol oxidasa). Aplicaciones: teñido de jeans y pelo PRODUCCIÓN DE ENZIMAS. PERSPECTIVA ECONÓMICA En la producción de enzimas podemos diferenciar entre: Grandes productores. En este caso, las enzimas producidas son de bajo coste y una alta demanda. Están destinadas principalmente a ser catalizadores industriales. Un ejemplo de estas enzimas es la alfa-amilasa. Pequeños productores. Estas enzimas responden a una escasa demanda con un alto coste. Son enzimas muy especializadas empleadas en la manipulación de material biológico y analítico. Como ejemplo de este grupo, ornitina-carbamil transferasa.  TEMA 2. FUENTES DE ENZIMAS. Existen tres fuentes de enzimas diferenciadas: - Animal - Vegetal - Microbiano (de esta fuente procede el 90% de las enzimas para el procesado industrial) 1. ENZIMAS DE ORIGEN ANIMAL 1) Lipasas, amilasas y proteasas pancreáticas: Algunas de las enzimas de este grupo son alfa-amilasa, ácido graso esterasa carboxílico éster hidrolasa, fosfolipasa A2-fosfatidil 2 acil-hidrolasa, quimotripsina, tripsina. 2) Esterasas pregástricas: aril éster hidrolasas 3) Pepsina. Mucosa intestinal: Un ejemplo es la heparina que se obtiene de la mucosa intestinal. 4) Quimosina (renina, cuajo): abomaso lactantes 5) Otras: Catalasa (peróxido de hidrógeno óxidoreductasa): hígado de bóvidos Lactoperoxidasa: leche de vaca Lisozima (mucopéptido N-acetil muramoilhidrolasa): albumen huevo de gallina Fitasa Urokinasa Se está observando un descenso en el uso de estas enzimas de origen animal. Las causas son varias: - Los fabricantes de enzimas deben aceptar precios de las materias primas fijadas por otros sectores - Variaciones estacionales - Aspectos sanitarios (vehiculación de virus, restricciones a la entrada de productos de origen animal en determinados países) - Aspectos sanitarios: necesidad deL sacrificio de animales 1. 2. ENZIMAS DE ORIGEN VEGETAL 1. Látex de: Papaya (carica papaya): papaína: 7% proteína soluble son enzimas. Higuera (ficus glabrata, ficus carica): ficina: 90% proteína soluble son enzimas. Piña (ananas corosus): bromelaína Cardo (Cynara cardunculus): proteasas 2. Cebada malteada: Alfa-amilasa-1,4-alfa-glucanglucano hidrolasa Beta-amilasa-1,4-beta-glucano hidrolasa Ambas enzimas hidrolizan el almidón. 3. Soja: lipoxigenasa 4. Rábano: peroxidasa_peróxido de hidrógeno oxidoreductasa 5. Cítricos 6. Algunas enzimas muy especializadas También se está experimentando un importante descenso en su uso en los últimos años. Las causas son varias: - Producción en regiones tropicales y subtropicales: falta de infraestructuras, inestabilidad económica y política. - Variaciones estacionales: necesidad de almacenamiento de materias primas, lo que lleva a incremento en costes de producción e inactividad de equipos de extracción de enzimas llevando al incremento en los costes de producción. 3. ENZIMAS DE ORIGEN MICROBIANO Estas enzimas se producen a partir de un número determinado de microorganismos. Se incluyen nuevas especies productoras, que requieren largos tiempos de investigación y fuertes inversiones económicas. El uso de enzimas de origen microbiano tiene una serie de ventajas: 1. Producción de un gran número de enzimas 2. Gran cantidad de enzimas son extracelulares. Se produce la secreción al exterior de la célula sin necesidad de técnicas de extracción. Son de fácil aislamiento por ausencia de interferencias (no gran número de proteínas extracelulares); en intracelulares, DNA, RNA, enzimas y proteínas. Presentan alta estabilidad a la desnaturalización (poseen una estructura compacta). 3. Fácil y rápido desarrollo de microorganismos. 4. Elevado desarrollo de la tecnología de producción industrial de microorganismos. En cuanto a las ventajas técnicas del empleo de microorganismos se señalan las siguientes: 1. Gran variedad de rutas metabólicas: Gran número de enzimas susceptibles de ser producidas. 2. Amplio rango de condiciones de crecimiento: Posibilidad de encontrar enzimas estables en diferentes condiciones de pH, temperatura, inhibidores… etc Ejemplo: en el caso de las enzimas de origen animal, generalmente se deberán trabajar a un pH neutro y a una temperatura de 37 ºC; sin embargo, a la hora de trabajar con microorganismos el rango de temperatura es mucho mayor. 3. Mayor flexibilidad genética. En su manipulación se seleccionan cepas o mutantes, se produce inducción, alteración del medio de cultivo, transferencia genética, clonación. 4. Tiene un tiempo corto de generación: pueden alcanzar la etapa de crecimiento exponencial en apenas unas horas,a diferencia de las de origen animal que pueden tardar semanas e incluso meses. Por otro lado, en relación a las ventajas económicas se encuentran las siguientes: 1. Posibilidad de producción a gran escala 2. Facilidad de extracción. Esto varía según la localización, según si es extracelular (aislamiento del medio de cultivo) o intracelular (similares etapas de extracción que para enzimas animales y vegetales). No tiene necesidad de ser eliminadas de tejidos, ni de ser transportadas y almacenadas. Integración de procesos de producción de microorganismos y extracción de enzimas. 3. Rendimiento predecible; podemos obtener las curvas de producción y de crecimiento de nuestras enzimas. 3.1. APLICACIONES INDUSTRIALES DE ENZIMAS MICROBIANAS 3.2. APLICACIONES TERAPEÚTICAS DE ENZIMAS MICROBIANAS 4. BÚSQUEDA DE NUEVAS FUENTES DE ENZIMAS Se realiza por diseño de superenzimas gracias a la ingeniería genética; estas enzimas se caracterizan por ser termo-resistentes, ser capaces de trabajar a bajas temperaturas y capaces de resistir a ácidos, bases y/o sales. En estos procesos se implica un largo tiempo de estudio (años) e importantes inversiones económicas. Una solución es la búsqueda de fuentes de enzimas con características adecuadas a las exigencias de los procesos a las que se destinan. Tener en cuenta el crecimiento del microorganismo y la clonación del gen y posterior expresión en otro microorganismo productor. 4.1 ORGANISMOS MARINOS PSICRÓFILOS Las enzimas de los organismos marinos psicrofílicos presentan en comparación con sus homólogas de animales de sangre caliente: - Alta actividad molecular. Buena tasa de conversión de sustrato a producto - Temperatura óptima de actuación relativamente baja: no todos los procesos tienen por qué realizarse a altas temperaturas permitiéndonos realizar procesos con temperaturas próximas a la refrigeración. - Estabilidad térmica relativamente baja - Su parámetros termodinámicos son los siguientes: o Tienen inferiores energías libres de activación (G*): pequeñas diferencias en G* se traducen en grandes diferencias de catálisis o Tienen inferiores entalpías de activación (H*) - Estabilidad térmica: o Inactivación térmica a bajas temperaturas (temperatura óptima de tripsina y fosfatasa alcalina de peces de agua fría se encuentra a 30ªC por debajo del óptimo de sus homólogas de mamíferos). Se realiza la inactivación con tratamiento térmico moderado. Otras propiedades de los organismos marinos psicrófilos: - Resistencia a los fenómenos de proteolisis. LDH de peces de aguas profundas presentan estructura polipeptídica compacta. - Las proteasas gástricas activas en presencia de NaCl (homólogas de mamíferos son inhibidas). - Tripsina de peces estables a pH alcalinos y muy inestables a pH ácidos (homólogas de mamíferos son estables a pH ácidos). - Alta sensibilidad a inhibidor de la tripsina - Alta efectividad en la hidrólisis de proteínas nativas (inactivación de enzimas en alimentos mediante fenómenos de proteolisis) (organismos sin estómago). - Se tratan de cisteín-proteasas en lugar de serin-proteasas (tripsina, quimotripsina, colagenasa digestiva, mamíferos). Algunos ejemplos son: 4.2 ORGANISMOS EXTREMÓFILOS Los organismos extremófilos son organismos capaces de vivir donde otros no pueden. Su supervivencia se logra gracias a extremozimas. Son de gran interés debido a que tienen numerosas aplicaciones prácticas debido a sus características (temperaturas, ebullición o congelación, químicos, ácidos o bases, elevada salinidad), se piensa que estos organismos pueden tener vida en otros planetas. Se han estudiado durante 20 años, sospechando de su existencia 30 años atrás. Dentro del grupo de los extremófilos existen organismos que resisten temperaturas extremas y extremófilos químicos: 1) Temperaturas extremas: Termófilos: resisten temperaturas extremas. Viven en fumarolas y géiseres. Suelen asociarse a extremófilos químicos. Psicrófilos: resisten a bajas temperaturas. Se suelen encontrar en el Ártico y Antártida. 2) Extremófilos químicos: Acidófilos: resisten en medios ácidos. Habitan en fumarolas y geiseres Alcalófilos: Resisten en medios alcalinos en África y oeste EEUU. Halófilos: Alta salinidad. Habitan en lagos salados naturales y piscinas saladas artificiales. Junto con alcalinidad extrema. 4.2.1 Supervivencia de los extremófilos Los extremófilos que resisten temperaturas extremas deben funcionar de una forma concreta para poder cumplir su objetivo de sobrevivir en esos tipos de medios. Cada parte del microorganismo debe funcionar al límite. Para los organismos termófilos, las enzimas deben ser resistentes a la desnaturalización a las temperaturas de actuación, y en los psicrófitos, es necesario que las enzimas sean eficientes, a pesar de trabajar a temperaturas bajas. Los organismos que son extremófilos químicos también deben funcionar de una forma concreta para poder cumplir su objetivo. El interior de la célula es normal; el exterior protege la célula. Los acidófilos y alcalófilos excretan sustancias protectoras y enzimas. Los halófilos tienen altas concentraciones de solutos intracelulares que evitan el salado de la célula. Algunas son enzimas de interés industrial. En las siguientes tablas se recogen organismos termófilos e hipertermófilos. 4.3. APLICACIONES EN LA INDUSTRIA DE LAS EXTREMOZIMAS En cuanto a los organismos termófilos, este grupo tienen las aplicaciones industriales más interesantes. Algunos procesos industriales implican altas temperaturas. 45º C es una temperatura que es un problema para la mayoría de las enzimas, sin embargo, las enzimas de este grupo pueden trabajar a estas temperaturas. Entre la aplicación más destacada de las enzimas de este grupo de microorganismos es la PCR, que permite la amplificación de ADN empleando altas temperaturas. En cuanto a los organismos psicrófilos, este grupo son enzimas que trabajan en frío, por lo que son enzimas que funcionan en alimentos refrigerados. La mayoría de los perfumes no toleran altas temperaturas. Detergentes en frío. 5. ENZIMA TAQ POLIMERASA Es una enzima procedente de un organismo termófilo (Thermophilus aquaticus), Gram-, aerobio y heterótrofo. Habita en manantiales de agua caliente en Yellowstone. Es una enzima termoestable cuya temperatura óptima es de 75-80ºC. Su tiempo de vida media es menor de dos horas a 92,5ºC, menor de 40 min a 95ºC y menor de 9 min a 97,5ºC. En PCR hay tres etapas (desnaturalización, alineación y elongación). La desnaturalización de la Taq polimerasa se realiza a 94-96ºC en 15 min, la alineación se realiza a 50-65ºC en 20 min y la elongación se realiza a 72 ºC en menos de 1 min. (rojo- extremófilos)  TEMA 3: MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ENZIMAS 1. DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA PREPARACIÓN DE ENZIMAS Diagramas de flujo para la manufactura de enzimas extra e intracelulares: *Problemas: en la obtención de extracelulares solo conseguiremos un número reducido de esas enzimas. En el caso de la extracción de enzimas intracelulares, a parte de extraer esa enzima también nos llevaremos el medio intracelular, por tanto habrá que hacer una limpieza de tids los restos celulares que no nos interesen. Un ejemplo real de la obtención de una proteína o enzima: 2. EXTRACCIÓN DE ENZIMAS INTRACELULARES 2.1. FACTORES DE LOS QUE DEPENDE LA ELECCIÓN DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN. Consideraciones previas para saber qué método utilizar: debemos preguntarnos si hay pérdida del producto por inactivación debido al pH, temperatura, formación de espuma, proteasas o agentes quelantes; si hay necesidad de purificar en etapas posteriores y tener en cuenta las consideraciones particulares en función de la fuente de enzima (tejido animal, vegetal, células microbianas, etc). Susceptibilidad de la célula: características de estabilidad de los productos, velocidad del método, facilidad de extracción de los restos celulares o coste económico del proceso. 2.2.FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN. 2.3. DIVERSIDAD DE MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DEL MATERIAL INTRACELULAR. Dependientes de: Naturaleza de la fuente: Células animales. Células vegetales. Células microbianas: levaduras, mohos, bacterias gram+/gram-. Estabilidad de la enzima. Pureza requerida: en función de eso, los métodos de purificación requeridos serán más o menos sencillos. 2.4. CARACTERÍSTICAS DE LOS MATERIALES DE PARTIDA: Células animales: Los problemas van a estar asociados, generalmente, a proteasas presentes en las células (hidrólisis de la enzima). Por tanto, el objetivo es contrarrestar las mismas. La solución es el uso de proteínas adicionales (albúmina), mantenimiento de tejidos a bajas temperaturas (menor velocidad de reacción del proceso de hidrólisis disminuyendo la pérdida de la enzima de interés), tener un método que permita el aislamiento de enzimas en el menor tiempo posible. Células vegetales: no son materiales adecuados para el aislamiento de enzimas, se necesita gran cantidad de enzima para romper la pared celular y liberan sustancias contenidas en las vacuolas como fenol oxidasas (los productos de oxidación del fenol destruyen enzimas) cuya actividad se diferencia según sean plantas jóvenes o adultas, su género y su especie. La solución para contrarrestar el efecto de las polifenoles oxidasas es el uso de agentes reductores como mercaptoetanol, ascorbato o tioglicolato. Células microbianas: gran número de microorganismos con diferentes características y sensibilidades de las enzimas. Los problemas asociados a la presencia de proteasas y fenol oxidasa, es decir, hidrólisis de enzimas y compuestos de oxidación del fenol. Las soluciones para evitar la pérdida de las enzimas que queremos aislar son: uso de proteínas adicionales (albúmina), mantenimiento de los tejidos a bajas temperaturas, empleo de agentes reductores para las polifenol reductasas o aislamiento de enzimas en el menor tiempo posible. 2.5. MÉTODOS DE LISIS CELULAR: DIFICULTAD DE RUPTURA La tecnología idea de disrupción celular debería producir la máxima liberación del producto de interés, no desnaturalizar térmica o mecánicamente el producto durante la disrupción, producir la mínima liberación de proteasas que puedan degradar el producto y la mínima liberación de partículas o contaminantes solubles que puedan alterar los procesos posteriores. Esto se puede conseguir con una sola tecnología o con la combinación de varias.  3. MÉTODOS MECÁNICOS: 3.1 CIZALLA SÓLIDA: Molinos de bolas: es un método abrasivo (cristal, alúmina kieselgurh). Son dispositivos de funcionamiento continuo como el agitador Mickle (vibratorio) o el Dyni-mill (discos giratorios). La efectividad depende del tipo y concentración del abrasivo; del tipo, concentración y edad de las células, ya que en fase de crecimiento exponencial son más sensibles que en fase estacionaria y las bacterias son más sensibles que las levaduras; de la velocidad de agitación; de la cantidad y flujo a través de la cámara; de la temperatura; y del dispositivo de discos. Prensa X-Alta presión: se pasa la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho, como el homogeneizador de Manto-Gaulin. El mecanismo se basa en una rotura celular por caída brusca de presión y choque. El modo de uso es en un único paso, series de reciclaje y reciclaje continuo con eliminación de sustancia. La efectividad depende del tipo de organismo (los gram + son más sensibles que los gram -) y del historial de la materia de partida, condiciones de crecimiento y congelación/descongelación.  Se pasan las células congeladas a través de orificio, el mecanismo se basa en la agitación en presencia de un abrasivo (cristal de hielo) más rotura por cizalla líquida, no produce desnaturalización de las enzimas, no se puede utilizar a gran escala por el complicado manejo y el coste. 3.2 CIZALLA LÍQUIDA: Ultrasonidos: se aplican frecuencias superiores a 25kHz, pueden aparecer áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades, el colapso de cavidades provoca ondas de choque y daño celular. Se aplica de forma continua o discontinua. La eficacia depende del tipo de microorganismo, Gram- >Gram +; Bacilos > Cocos. También depende del pH, la temperatura, la fuerza iónica del medio, el tiempo de exposición, y la densidad de la célula. Se utiliza a pequeña escala, no a gran escala, debido a varios problemas: necesita elevados requerimientos de energía, dificultad de transmisión y problemas de disipación del calor producido. 4. MÉTODOS NO MECÁNICOS 4.1 FÍSICOS Termólisis: congelación-descongelación: Se basa en la formación y fusión de cristales de hielo que provoca la rotura celular y liberación de proteínas. Se combina con otros métodos como la congelación de sedimentos bacterianos. Las ventajas son su simplicidad y las bajas temperaturas de trabajo (inhiben la acción de proteasas). No se usa a gran escala debido al elevado tiempo de tratamiento, la resistencia de algunos microorganismos y la sensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación. Choque osmótico. Basado en una suspensión de células, en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%). De esta manera la célula se deshidrata. Pasos: 1) Equilibrio osmótico: 2) Centrifugación: para concentrar las células; 3) Resuspensión en agua (4ºC) 4) Rotura celular por entrada de agua en el interior celular (turgencia). Tiene mayor sensibilidad frente a GRAM -, ya que GRAM+ tiene mayor presión osmótica interna. Las ventajas son la extracción de enzimas del espacio periplasmático, y la simplificación de los procesos de purificación. No es a gran escala debido a que se necesitan grandes volúmenes (400l/10kg pasta celular), elevado número de pasos de centrifugación, y necesidad de refrigeración. 4.2 QUÍMICOS Tratamiento con álcalis. Tratamiento de las células con soluciones alcalinas (KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min) dando lugar a la hidrólisis de la pared celular. Las ventajas son la simpleza, coste barato, fácil aplicación a gran escala, reducción de la contaminación con pirógenos en preparación de uso terapéutico, aplicación sólo si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino. Tratamiento con detergentes. Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros (especialmente GRAM-). Hay dos tipos: Iónicos: provoca desnaturalización proteica. Aniónicos: Lauril sulfato sódico, colato sódico (TDOC), SDS, taurocolato sódico. Catiónicos: Bromuro de cetil-trimetil-amoniaco (CTAB). No iónicos: preservan la estructura nativa e interacciones de la enzima como Tween, Spam y Tritón. Los inconvenientes son la precipitación de proteínas y la necesidad de eliminación de esos detergentes por cromatografía o ultrafiltración. 4.3 ENZIMÁTICOS Tratamiento con lisozima + EDTA. Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlaces beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido. Presenta una mayor susceptibilidad la GRAM+. La combinación con EDTA, que es un quelante de Ca2+/Mg2+, desestabiliza la membrana externa de Gram- exponiendo los peptidoglicanos. Otros métodos: GRAM+: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antibióticos. GRAM-: lipasas, fosfolipasas, policationes. Hongos/levaduras: quitinasa/glucanasas, β 1,3-glucanasa, β 1,6-glucanasa manasa, quitinasa. Las características son: no necesita un choque osmótico. No se emplea a gran escala por el alto precio de enzimas (excepto lisozima), se necesita eliminar la lisozima tras la extracción.