Fixácia - Hitko. PDF

4.2 ZÁKLADNÉ FIXAČNÉ TEKUTINY 1. FORMALDEHYDOVÉ ZMESI A) Formaldehyd: - jedna z najviac používaných fixačných tekutín. Je pomerne lacný, príprava roztoku je rýchla a ľahká. Východiskom pre jeho výrobu je aldehyd kyseliny mravčej - formaldehyd, triviálne sa volá formol. Je to biely prášok rozpustný...

4.2 ZÁKLADNÉ FIXAČNÉ TEKUTINY 1. FORMALDEHYDOVÉ ZMESI A) Formaldehyd: - jedna z najviac používaných fixačných tekutín. Je pomerne lacný, príprava roztoku je rýchla a ľahká. Východiskom pre jeho výrobu je aldehyd kyseliny mravčej - formaldehyd, triviálne sa volá formol. Je to biely prášok rozpustný vo vode. - Do laboratória sa dostáva ako 40% vodný roztok, čo je nasýtený roztok a označuje sa ako 100%. - Fixácia tkaniva formalínom vedie k zmenám konfigurácie bielkovín, najmä enzýmov, čo vedie k okamžitému zastaveniu autolytických procesov. - Je to bezfarebná kvapalina dráždivého zápachu, silne dráždiaca sliznice. Pri styku s kožou spôsobuje jej stvrdnutie, preto je potrebné používať ochranné gumové rukavice a rúško. - Účinkom denného svetla vzniká vo formalíne kyselina mravčia (zmení sa pH), ktorá nepriaznivo ovplyvňuje fixáciu. Preto ho uchovávame v tmavej fľaši s vrstvou mletého CaCO3 (MgCO3). Tmavé sklo bráni oxidácii a mletý vápenec viaže vzniknutú kyselinu mravčiu (vzniká nerozpustný mravenčan vápenatý). - Dodávaný formalín už ale obsahuje malé množstvo kyseliny mravčej a aby sme ho zneutralizovali riedime ho vodovodnou vodou (pretože obsahuje látky, ktoré udržujú formol v neutálnom stave). Pred použitím sa 100% formol riedi na roztok s koncentráciou 10-25% (čo je asi 4-10% roztok formaldehydu), v pomere 1:9. Fixácia trvá (podľa veľkosti vzorky) asi 24 hodín. Rýchlosť' prieniku fixačnej tekutiny do tkaniva je asi 1 mm za hodinu, malá vzorky sa zafixujú rýchlejšie. Po fixácii tkanivo vypierame vo vodovodnej vode. -​ Výhody formalínu: - rýchlo preniká tkanivom, - zachováva dobrú farbiteľnosť tkaniva, - pri krátkej fixácii nerozpúšťa tuky, - tkanivo dobre vytvrdzuje a konzervuje. - vhodný na prehl'adné histologické preparáty. -​ Nevýhody formalínu: - spôsobuje napučanie tkaniva, - bunky nadobúdajú sklovitý vzhľad (preto pri niektorých metodikách radšej používame neutrálny formalín). - V tkanivách, ktoré obsahujú veľa krvi vznikajú hrdzavo-hnedé zrazeniny: formol -pigment. (Zrazeniny sa dajú odstrániť tak, že tkanivové bločky alebo rezy vložíme do 1% KOH v 80 % alkohole, necháme pôsobiť 5 - 10 hodín. Potom vypierame vo vodovodnej vode.) - Formalín nie je vhodný na fixáciu tkaniva v ktorom chceme dokázať glykogén. - nehodí sa na fixáciu svalov, pečeňových a obličkových punktátov. B) Neutrálny formalín: - spoľahlivejšie neutralizovaný formalín. - Na neutralizáciu sa používa uhličitan vápenatý: na dno nádoby sa nasype 1-2 cm vrstva práškového uhličitanu vápenatého a zaleje sa koncentrovaným (40%) formalínom. Občas pretrepeme a v priebehu niekoľkých dní sa formalín zneutralizuje (reakciu formolu zisťujeme neutrálnou červeňou, ktorá sa pri kyslej reakcii sfarbí na karmínovočerveno, pri alkalickej reakcii na oranžovožlto). - Neutrálny formalín riedime vodovodnou vodou v pomere 1: 9. C) Nárazníkový formalín: TLMVY - používa sa vtedy, keď potrebujeme dosiahnuť konštantné pH fixačného roztoku napr. pri dôkaze hormonálnych receptorov - hydrogénfosforečnan sodný NaHPO4+ dihydrogénfosforečnan sodný NaH2PO4+ koncentrovaný 40% formalin + destilovaná voda D) Brómformol: - používa sa najmä v neurohistológii na fixáciu neuroglie - koncentrovaný formalín + bromid amónny + destilovaná voda E) Backerov formalín: - používa sa pri fixácii materiálu na histochemické vyšetrenia (dôkaz lipidov). - Využíva sa aj pri punkčnej biopsii, ide o veľmi šetrnú fixáciu - pečeň, pankreas - koncentrovaný neutrálny formalín + chlorid vápenatý + destilovaná voda !!! Po fixácii vo formolových zmesiach treba formalin z tkaniva dokonale odstránit' vypieraním vo vodovodnej vode !!! 2. FIXAČNÉ ZMESI S ALKOHOLOM - alkohol veľmi málo mení chemickú skladbu tkaniva, preto sa používa pri histochemických metódach. - Zachováva látky, ktoré formalín rozpúšťa alebo poškodzuje (glykogén, mucin). - Rozpúšťa tuky. - najväčšia nevýhoda - tkanivo v ňom tvrdne a scvrkáva sa. - Najčastejšie sa používa 70 % etylalkohol. -​ A) Carnovova tekutina: patrí medzi najrýchlejšie prenikajúce fixačné tekutiny. Bielkoviny vykazujú malú denaturáciu, preto je vhodná pri štúdiu detailov jadier. vhodná aj na fixáciu materiálu na IHCH. -​ B) Methacarn: používa sa na zvýraznenie lymfatických uzlin v axilárnom tuku alebo v omente mehylalkohol chloroform + kyselina octová !!! Po fixácii v alkoholových zmesiach tkanivo vypierame v absolútnom alkohole !!! 3. FIXAČNÉ ZMESI S KYSELINOU PIKROVOU - kyselina pikrová je triviálny názov pre trinitrofenol. - Je to prášok ostro žltej farby, takže všetky fixačné roztoky, ktoré ju obsahujú sú žlté (Bouinova, Gendreova, Pasteelsova tekutina). - Vo vzorkách veľmi dobre zachováva polysacharidy. -​ A) Bouinova tekutina: (Buen) výborne preniká, dobre fixuje cytoplazmatické detaily, tkanivo sa po fixácii dobre farbí. Nie je vhodná na fixáciu krvnatých orgánov napr. slezina, lebo krv sa hemolyzuje a zráža sa na tvrdú ťažko rezateľnú hmotu. Nehodí sa ani na fixáciu tkanív určených na zaliatie do celoidínu (zabraňuje prenikaniu celoidínu do tkaniva). Čas fixácie je asi 24 hodín nasýtený roztok kyseliny pikrovej + formol + na každých 100 ml roztoku 5 ml kyseliny octovej l'adovej -​ B) Alkoholický bouin: - často sa používa na fixáciu tkaniva, v ktorom chceme dokázať glykogén (materničná sliznica pri datácii endometria). !!! Po použiti fixačných zmesí s kyselinou pikrovou tkanivá vypierame v 70-80 % alkohole !!! (tkanivo nesmieme vypierať vo vode lebo by napučalo väzivo) 4. FIXAČNÉ ZMESI SO SUBLIMÁTOM - často používané, dobré fixačné tekutiny. - Rýchlo prenikajú, tkanivo sa po nich dobre farbí. - Kovové prístroje pri práci nesmú prísť do styku s tekutinou, lebo spôsobuje ich koróziu. - Sublimát (chlorid ortut'natý) je prudký jed. - Nevýhodou fixácie je, že v tkanive vznikajú tzv. sublimátové zrazeniny - čierne zhluky (odstraňujú sa jódovaním Lugolovým roztokom, alebo jódovou tinktúrou.) -​ A) SUSA": - fixačná tekutina na priečne pruhovanú svalovinu - (sublimát+ formalín). -​ B) Stieveho fixačná tekutina: - dobre preniká - vhodná na fixovanie veľkých objektov. 5. FIXAČNÉ ZMESI SO SUBLIMÁTOM A DVOJCHRÓMANOM DRASELNÝM -​ A) Zenkerova fixačná tekutina: - (Cenkerova) je vhodná na fixáciu tkaniva, ktoré budeme farbiť' anilínovou modrou (s kyselinou octovou). -​ B) Hellyho fixačná tekutina: - vhodná na fixovanie krvotvorných orgánov (miesto kyseliny octovej sa pridá koncentrovaný formalín). !!! Po fixácii s dvojchrómanom draselným tkanivo pláchame vo vodovodnej vode!!! 6. FIXÁCIA PRE ELEKTRÓNOVÚ MIKROSKOPIU - používa sa glutaraldehyd a kyselina osmičelá (osmium tetroxidem) pre jeho šetrné vlastnosti. 7. FIXÁCIA PRE CYTOLÓGIU Spútem: formol - metanol 1:9 Gynekologická cytológia: metanol Ostatné nátery, odtlačky: metanol-éter 1:1 4.1 ROZDELENIE FIXAČNÝCH PROSTRIEDKOV 1. Fyzikálne metódy Činnost enzýmov v bunkách je viazaná na vodné prostredie, v ktorom sú prenášané molekuly substrátu a produktu. Aktivita enzýmov prestane, keď ovplyvníme transportnú funkciu vody. A) fixácia varom - hrubo poškodzuje tkanivá, v histológii je menej používaná. - Používa sa len fixácia horúcim formalínom zahriatym na teplotu 80°C (peroperačná biopsia). - V súčasnosti sa využíva aj mikrovlnné žiarenie. Riadený ohrev v mikrovlnnej rúre v rozmedzí 45-55°C jemne denaturuje bielkoviny tkaniva, dobre zachováva štruktúru tkaniva aj jeho farbitel'nost' (histopatologické metódy, peroperačná biopsia). B) fixácia mrazením - rýchle zmrazenie tkaniva inaktivuje enzýmy. - Používajú sa: -​ a) tekutý dusík (kvapalné plyny, menej ako -180°C) alebo tzv. suchý ľad (pevná kyselina uhličitá, menej ako -75°C). -​ V tkanive dochádza k rýchlemu prechodu bodu tuhnutia vody a vytvorí sa amorfný ľad, ktorý bunkové štruktúry nepoškodí. Takáto fixácia sa využíva pri histochemickom dôkaze enzýmov a pri imunofluorescenčných metódach. -​ Zmrazenie tkaniva musí prebiehať čo najrýchlejšie, aby nevznikli mrazové artefakty, spôsobené pomalým rastom kryštálom l'adu v tkanive (čím pomalšie sa tkanivo mrazí, tým väčšie a ostrejšie kryštály l'adu sa tvoria, a ničia bunky, potrhajú sa ich membrány). -​ Pri vyšetrení svalovej biopsie sa tkanivo rýchlo mrazí na teplotu tekutého dusika (tkanivo sa nesmie ponoriť priamo, lebo sa okolo neho vytvorí plynný obal, ktorý zmrazenie spomaluje). -​ Zmrazenie na -170°C sa používa pri histochémii a imunohistochémii.  -​ b) freezing-drying, tj. zmrazenie tkaniva a jeho vákuové vysušenie v zmrazenom stave (vysušenie za mrazu), kedy nastáva rýchla sublimácia vody. -​ Je to rýchly postup, ale na úkor výslednej kvality a je to drahá metóda. 2. Fyzikálno-chemické metódy -Metódy kombinujú zníženú teplotu s účinkom chemických fixačných prostriedkov, napr. veľmi vychladená fixačná tekutina (0-4°C). -Tento postup rýchlo znižuje aktivitu enzýmov -používa sa na fixáciu malých vzoriek na enzymatickú histochémiu a elektrónovú mikroskopiu. 3. Chemické metódy - Molekula enzýmu sa skladá z bielkoviny apoenzýmu, a z nebielkovinovej zložky koenzýmu. Činnosť enzýmu môžeme úspešne zablokovať' denaturáciou bielkoviny. - Aldehydové fixačné prostriedky pôsobia tak, že vytvárajú mostíky medzi bielkovinovými rat'azcami, nastane zosieťovanie bielkovín. V dôsledku toho sú väzobné miesta na molekulách enzýmov neprístupné, sú blokované (toto ale vadí pri iminohistochemických dôkazoch, kde sa používajú metódy pre tzv. antigen retrieval, kedy sa väzobné miesto opäť sprístupní). Navonok sa to prejaví tým, že tkanivo vo fixačnej tekutine stuhne. - Tieto prostriedky sú najbežnejšie, l'ahko sa pripravujú a fixácia s nimi je jednoduchá. - Sú to roztoky jednej alebo niekoľkých chemických zlúčenín. V niektorých prípadoch sa môžu na fixáciu použiť aj pary fixačných roztokov. -​ a) Chemická imerzná fixácia: vloženie tkaniva do fixačného prostriedku. -​ b) Chemická perfúzna fixácia: prepláchnutie cievneho riečišť'a fixačným roztokom. Delíme ich: A) organické kyseliny - spôsobujú denaturáciu bielkovín a pridávajú sa do niektorých fixačných roztokov. Využívajú sa: kyselina octová, kyselina trichlóroctová, kyselina pikrová. B) zlúčeniny r'ažkých kovov - oxid osmičelý (OsO4), chlorid ortutnatý (HgCl2), dvojchróman draselný (K2Cr2O7), zlúčeniny chrómu, manganistan draselný (KMnO4). C) organické redukujúce fixačné prostriedky - nízkomolekulové látky prenikajú do buniek a rýchlo nahrádzajú v tkanive vodu.  -​ Etylalkohol, metylalkohol, formaldehyd, acetón (šetrná fixácia, dobre zachováva aktivitu enzýmov, zároveň však dochádza k extrakcii membránových lipidov). Samostatne sa tieto látky používajú len zriedkavo, používajú sa ich zmesi, kde sa vyrovnávajú priaznivé a nepriaznivé účinky jednotlivých zložiek. Zvyčajne sa fixuje pri izbovej teplote, mierne zahriatie ul'ahčuje prenikanie roztoku do tkaniva.