Guía Espectrofotometría I y II 2024 PDF

**GUÍA ESPECTROFOTOMETRÍA I y II.**  1. Conocer los fundamentos básicos de la espectrofotometría UV-Visible (UV-VIS) y su aplicación en química clínica. 2. Conocimiento y manipulación de un espectrofotómetro. 3. Ej...

**GUÍA ESPECTROFOTOMETRÍA I y II.**  1. Conocer los fundamentos básicos de la espectrofotometría UV-Visible (UV-VIS) y su aplicación en química clínica. 2. Conocimiento y manipulación de un espectrofotómetro. 3. Ejecutar un espectro de absorción de 3 soluciones coloreadas 4. Realizar curva de Calibrado y determinar coeficiente de extinción molar. 5. Determinar la concentración en una muestra problema utilizando la ley de Lambert -- Beer. ***Figura 1. Onda electromagnética*** **ASPECTOS CUALITATIVOS DE LA ESPECTROSCOPÍA.** **Longitud de onda (nm)** 1. La relación de Lambert y Beer solo se puede aplicar cuando en esta técnica se trabaja con luz monocromática (única longitud de onda) ya que si se utilizan varias longitudes de onda se producen variaciones en el coeficiente de extinción dando lugar a variaciones significativas en la absorbancia. 2. A elevadas concentraciones se producen interacciones moleculares, que impiden la absorción de la energía respecto a soluciones diluidas. Por ello debemos asegurarnos de trabajar en un rango de concentraciones que presenten una relación lineal con la absorbancia. 1. Fuente de radiación (Lámpara). 2. Selector de longitud de onda (Monocromador). 3. Recipiente de la muestra. 4. Detector.  1. **Análisis cualitativos:** Se utiliza para determinar la presencia o ausencia de ciertos compuestos en diversas muestras a través de su espectro de absorción. 2. **Análisis cuantitativos:** Es una de las aplicaciones mas empleadas en el laboratorio, consiste en determinar la concentración de una sustancia en una muestra problema [siempre que se cumplan las condiciones de la ley de Lambert y Beer]. En laboratorio clínico, se utiliza para determinar proteínas, azúcares, lípidos, etc. en muestras tales como suero, plasma, orina y líquidos. Su aplicación es muy amplia tanto en muestras y en compuestos a determinar. **C~MP~ = [A~MP~] ó C~MP~ = [A~MP~]** +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | - ~M~-1 ~cm~-1 | - ~mM~ -1 ~cm~-1 | - dL g^-1^ cm ^-^1 | | | | | | - L moles^-1^ | - L mmoles^-1^ | - (g/100mL) ^--1^ | | cm^-1^ | cm^-^1 | cm^-1^ | | | | | | - mL milimoles^-1^ | - mL μmoles^-1^ | | | cm^-1^ | cm^-1^ | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ **Espectrofotometría 2.** **Aplicación de la Absorciometría al Análisis Cuantitativo.** A través de la Absorciometría o colorimetría es posible determinar la concentración de una sustancia siempre que cumpla con la condición de absorber luz en la región visible (también es posible determinar la concentración de sustancias que absorben en otras regiones del espectro electromagnético como por ejemplo la concentración de NAD a 180 nm (región UV). Para determinar la concentración de un cromóforo puro, se debe medir la absorbancia de la solución problema en un espectrofotómetro y conociendo el coeficiente de extinción molar del cromóforo se puede calcular la concentración usando la ley de Lambert-Beer. Se debe construir una curva de calibración de Absorbancia vs concentración, que si se cumple la ley de Lambert-Beer debe ser una recta (figura 5). El valor de la concentración de la muestra de concentración desconocida (muestra problema) se puede obtener de varias maneras (Ecuación de la recta; Interpolar; factor de calibración; regla de 3). **Para cuantificar una sustancia se requiere:** - **[Que la sustancia tenga color]**: la mayoría de las sustancias a cuantificar en bioquímica no poseen color. Por lo tanto es necesario acoplar algún tipo de reacción química, que involucre la aparición o desaparición de un cromógeno, con la sustancia a cuantificar. Generalmente se escogen cromógenos cuyo coeficiente de absortividad molar sea alto ya que mayor será la absorbancia a medir y por tanto la técnica tendrá mayor sensibilidad. - **[Corroborar las condiciones donde se cumple la ley de Lambert-Beer]:** **es decir la longitud de onda apropiada para realizar las mediciones y qué concentraciones son las adecuadas.** Para ello se determina la absorbancia de la sustancia usando diferentes concentraciones de una solución patrón; a esto se le denomina Curva de Calibración del método. Las soluciones de concentración conocida que se preparan para construir una Curva de Calibración se conocen como patrones, calibradores o estándares. La relación absorbancia versus concentración debe generar un gráfico que demuestre una línea recta cuyo intercepto en el eje de las abscisas y las ordenadas es cero (Fig. 6). Una vez que se ha realizado este paso se puede entonces determinar la concentración de una solución midiendo su absorbancia e interpolando dicho valor en el gráfico, o mediante la ecuación de la recta. Debido a que existe una relación lineal entre ambas variables, es posible relacionar la concentración desconocida a un solo estándar (generalmente el que tiene la absorbancia más similar a la muestra) mediante una simple relación de tres. Ejemplo: Se realizó una curva de calibración para un método colorimétrico que cuantifica calcio, utilizando un estándar de calcio de 20 mg/dl. Calcular la concentración de calcio de una muestra problema, si su absorbancia a 570 nm fue de 0,5. **Curva de Calibración del Método de Calcio:** +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | **(X)** | **(Y)** | **PAR ORDENADO** | | | | | | **CONCENTRACIÓN de | **ABSORBANCIA** | **(X;Y)** | | Calcio (mg/dl)** | | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | 0 | 0,000 | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | 5 | 0,200 | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | 10 | 0,400 | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | 15 | 0,600 | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ | 20 | 0,800 | | +-----------------------+-----------------------+-----------------------+ Por lo tanto, interpolando la absorbancia de la muestra problema, sabemos que tiene una concentración de 12.5 mg de calcio/dl. Ahora, también lo podemos calcular por la ecuación de la recta: y = bx + a Donde, ***y*** es la absorbancia de la muestra problema, ***b*** es la pendiente, ***x*** es la concentración desconocida de calcio y ***a*** es el intercepto: y = 0.04x + 0 Por lo tanto, la concentración de la muestra problema es de 12,5 mg/dl**.** Ahora, si solo consideramos una sola concentración utilizada en la curva de calibración, por ejemplo 10 mg/dl, y calculamos la concentración de calcio de la muestra problema por una regla de tres, debemos obtener el mismo resultado que interpolando en la recta o por ecuación de la recta: Si 10 mg/dl 0,4 X 0,5 De la ecuación de la recta, se puede extraer el factor de calibración (FC): FC = [X + C] Y Donde X es el promedio de las concentraciones de estándares, Y es el promedio de sus absorbancias y C es a/b, y se interpreta como el error de la curva de calibrado (idealmente igual a 0). Este FC, se multiplica por la absorbancia de la muestra problema y así conoceremos la concentración de calcio: FC = [12,5 mg/dl + 0] = FC = 25 mg/dl 0,5 FC x Absorbancia muestra problema: 25 mg/dl x 0,5 = 12,5 mg/dL. Resumiendo, existen diversas maneras de conocer la concentración de una muestra problema: interpolación en la recta de calibrado, ecuación de la recta, un solo estándar y FC. En el laboratorio clínico el método más utilizado es el factor de calibración, el cual se calcula de acuerdo a todo lo explicado anteriormente.