TEMA 4 TECNICAS OPTICAS ESPECTROSCOPICAS PDF

1. INTRODUCCION Se denomina espectrometría al método de medir la cantidad de energía radiante que absorbe o emite un sistema químico (átomos, iones o moléculas) a una determinada longitud de onda. Los métodos espectrométricos son un amplio grupo de métodos analíticos que se basan en las espectroscopias atómica y molecular. La espectroscopia es la ciencia que estudia las distintas interacciones que suceden entre la radiación electromagnética y la materia, con aplicaciones en química (análisis instrumental), física y astronomía, entre otras disciplinas científicas. Así, por ejemplo, mediante la espectroscopia se descubrió el helio antes en el sol que en la tierra. Las técnicas en las que se basan los métodos espectroscópicos, permiten detectar y medir la absorción o emisión de radiación electromagnética a ciertas longitudes de onda, y relacionar éstas con los niveles de energía implicados en una transición cuántica. Las técnicas espectroscópicas más ampliamente utilizadas son las relacionadas con la radiación electromagnética, que es un tipo de energía que toma varias formas, de las cuales las más fácilmente reconocibles son la luz y el calor radiante. Estos métodos se pueden clasificar de acuerdo con la región del espectro electromagnético que se utilice para hacer la medición: rayos gamma visible rayos X Infrarrojo radiaciones ultravioletas microondas y radiofrecuencia. 2. PROPIEDADES GENERALES DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA La radiación electromagnética (REM) es un tipo de energía que se transmite por el espacio a grandes velocidades. A diferencia de otras formas de energía, como el sonido, la radiación electromagnética no necesita un medio de apoyo para transmitirse y, por tanto, se propaga fá- cilmente a través del vacío. Además, la propagación de la radiación disminuye al atravesar cualquier medio material. Las manifestaciones más conocidas de la REM son la luz y el calor radiante. La interacción REM-materia da lugar a dos tipos de fenómenos: unos que son puramente ópticos (reﬂexión, refracción, dispersión, rotación, etc.) y otros que tienen que ver con fenómenos de absorción y emisión de REM por parte de la materia con la que interacciona. Todos estos fenómenos son la base de los métodos ópticos de análisis. 2.1 PROPIEDADES ONDULATORIAS DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA Muchas de las propiedades de la radiación electromagnética se explican considerándola una onda con forma sinusoidal formada por una combinación de campos eléctricos y campos magnéticos perpendiculares entre sí que se desplazan en el especio transportando energía de un punto a otro. El campo eléctrico es el responsable de la mayoría de los fenómenos que interesan en espectroscopia, como la transmisión y absorción de energía, la reﬂexión y la refracción. Sin embargo, cabe señalar que la componente magnética de la radiación es la responsable de la absorción de las ondas de radiofrecuencia en la espectroscopia de resonancia magnética nuclear. La radiación electromagnética considerada como una onda se puede caracterizar o describir en función de los siguientes parámetros físicos: Amplitud (A): Desplazamiento máximo de un punto respecto de la posición de equilibrio (punto en el que la onda pasa de positiva a negativa y viceversa). Longitud de onda (λ): Distancia entre dos puntos análogos consecutivos. Se mide en metros (m), aunque se suele emplear como unidad el nm (nanómetro), 1 nm equivale a 10-9 metros. También se puede medir en angstrom, A (10-10 m). Frecuencia (𝝊): Número de ciclos o vibraciones por unidad de tiempo. Se mide en hercios (Hz). 1 Hz equivale a 1 ciclo por segundo (1 Hz = 1 s-1). Período (T): Tiempo invertido en efectuar un ciclo o vibración completa, es la inversa de la frecuencia. T=1/f ; f=1/T. Número de onda (𝑣̅): Se deﬁne como el inverso de la longitud de onda en centímetros. La unidad es cm-1. El número de onda se usa mucho en espectroscopia infrarroja. El número de onda es una unidad útil porque, al revés que la longitud de onda es directamente proporcional a la frecuencia y a la energía de la radiación. Este hecho nos facilita la resolución del problema analítico en espectroscopia infrarroja. Velocidad (V): Velocidad con que se propaga la onda. La velocidad de propagación (𝑽) de la onda, en metros por segundo, se calcula multiplicado la frecuencia en ciclos por segundo por la longitud de onda en metros por ciclo: 𝑽 = 𝝊× 𝝀=𝒄 La velocidad con la que se propaga la radiación electromagnética se puede considerar aproximadamente igual a 3 × 10-8 m/s (𝒄). Es importante tener en cuenta que la frecuencia de un haz de radiación está determinada por la fuente y permanece invariable, es decir, no cambia al pasar de un medio a otro. Por el contrario, la velocidad de la radiación y la longitud de onda varían con la composición del medio que atraviesa a causa de la interacción con ese medio. 2.2 PROPIEDADES CORPUSCULARES DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA El modelo ondulatorio explica los fenómenos que tienen que ver con un cambio en la dirección de propagación de la REM cuando interacciona con la materia (refracción, dispersión, rotación), pero no explica los fenómenos de absorción y emisión de energía radiante. Para comprender estos procesos hay que acudir a un modelo corpuscular en el que la radiación electromagnética se considera como un flujo de partículas discretas de energía denominadas fotones, en los que la energía de un fotón es proporcional a la frecuencia de la radiación. El valor de la energía transmitida por la radiación es inversamente proporcional a la longitud de onda y directamente proporcional a su frecuencia. Esta afirmación explica porqué una exposición continua a rayos X provoca daños en nuestro organismo mientras que las ondas de radio son inocuas e invaden nuestra vida diaria. 2.3 EL ESPECTRO ELECTROMAGNETICO La distribución energética de las radiaciones electromagnéticas se conoce con el nombre de espectro electromagnético. Como se muestra en la figura 3, el espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y frecuencias y por tanto de energías, por lo que para su representación se necesita de una escala logarítmica. Algunas de las radiaciones más conocidas y utilizadas en la vida cotidiana, ordenadas en orden ascendente de longitud de onda, son: Rayos X: en medicina; ultravioleta: responsable de los efectos nocivos para la piel; visible: la luz que vemos; infrarrojo: imágenes de meteorología; microondas: utilizadas en la cocina; ondas de radio: para comunicación. 2.4 EFECTOS DE LA ABSORCION DE LA RADIACION ELECTROMAGNETICA SOBRE LAS MOLECULAS Considerando que un átomo o una molécula están formados por protones y neutrones que se localizan en el núcleo, en la parte central, y electrones que se disponen en orbitales alrededor del núcleo. En su estado de mínima energía, llamado estado fundamental, los electrones llenan los orbitales de menor energía situados más cerca del núcleo. Recuerda que en cada orbital se localizan como máximo dos electrones con espines opuestos (gráficamente los electrones se representan mediante flechas que apuntan hacia abajo o hacia arriba en función del signo del espín). Es posible aumentar la energía de un átomo o molécula haciendo incidir una determinada radiación electromagnética. Este estado de mayor energía se conoce con el nombre de estado excitado. Estos cambios energéticos que se producen en los átomos o moléculas dependen de sus propias características y de la longitud de onda de la radiación incidente. Los efectos que una radiación tiene sobre las moléculas dependen de la energía de la radiación utilizada: Las microondas aumentan el movimiento rotacional de las moléculas. Concretamente los hornos microondas utilizados en la cocina hacen girar las moléculas de agua aumentando así la temperatura de los alimentos. La radiación infrarroja estimula el movimiento vibratorio de las moléculas. Las radiaciones ultravioleta y visible tienen la energía suficiente para que los electrones pasen a orbitales de mayor energía y por tanto más alejados del núcleo. Este cambio en la energía que implica el salto de un electrón entre dos orbitales se llama transición electrónica. Los rayos X rompen los enlaces de las moléculas. Resumiendo, los efectos de las radiaciones sobre los átomos o moléculas dependen de la energía transportada por esa radiación, que es proporcional a la frecuencia e inversamente proporcional a la longitud de onda. Además, cuando una radiación electromagnética incide sobre una sustancia no toda ella se ve afectada, en función de la longitud de onda de la radiación habrá un átomo o conjunto de átomos que absorberán la radiación y al que se le llama cromóforo. Después de un proceso de absorción es necesario disipar el exceso de energía mediante procesos de relajación, donde las partículas excitadas tienden a volver a su estado fundamental desprendiendo o emitiendo energía. Esta emisión de energía para volver al estado fundamental se puede hacer de dos formas: Disipando la energía en forma de calor o emitiendo la energía remanente en forma de radiación electromagnética de distinta frecuencia que la absorbida, a una longitud de onda mayor, y que puede utilizarse con fines analíticos. 3. ESPECTROS DE ABSORCION Y EMISION Un espectro de absorción (o emisión) es una representación gráfica de la energía de la radiación absorbida (o emitida) por la sustancia en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Existen dos tipos de espectros de absorción (o emisión): MIRAR FOTOS EN EL TEMA Espectro de absorción atómica: cuando una radiación interacciona con un medio formado por partículas monoatómicas, éstas absorben sólo unas pocas frecuencias bien definidas de la radiación, los átomos se excitan y dan lugar a espectros bien definidos formados por líneas espectrales (espectro atómico o de líneas). Espectro de absorción molecular: las moléculas de la muestra son las que se excitan por la radiación, dando lugar a espectros de absorción con menor definición y más complejos que los atómicos, formados por bandas (espectro molecular o de bandas Del mismo modo se puede hablar de espectros de emisión atómica y espectros de emisión molecular, cuando lo que se representa es la radiación electromagnética emitida por un átomo y por una molécula respectivamente, en función de la longitud de onda o frecuencia. 4. ESPRECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION MOLECULAR ULTRAVIOLETA VISIBLE 4.1 FUNDAMENTOS CIENTIFICO-TECNICO La espectroscopía de absorción de la radiación electromagnética dentro la región de longitudes de onda comprendida entre 160 y 780 nm. Desde el punto de vista de la física y de la química, la absorción de radiación UV-visible por una molécula da como consecuencia la excitación de los electrones de enlace debida a la interacción con los fotones de la radiación (cesión de energía cinética). Los electrones que conforman la molécula “saltan” a otros estados superiores de energía. Son estos tránsitos electrónicos, que ocurren a determinadas longitudes de onda, los que caracterizan a una molécula o grupo funcional de la misma (cromóforo) y la hacen diferente a otra. Las transiciones electrónicas se pueden detectar y registrar gráﬁcamente en un espectro de absorción molecular, dando lugar a una serie de bandas energéticas o picos, característico de cada sustancia. Los espectros de absorción molecular son mucho más complejos que los espectros de absorción atómica, debido a que el número de estados de energía de las moléculas es, en general, enorme si se compara con el de átomos aislados. Para determinar la concentración de analito en una muestra midiendo la cantidad de energía que absorbe, es necesario relacionar estos dos parámetros. La ley analítica que relaciona la intensidad de la radiación que incide sobre la muestra con la intensidad de la radiación transmitida después de que se produzca la absorción de una parte de la energía en la muestra se denomina Ley de Lambert-Beer. La imagen muestra un haz de radiación antes y después de atravesar un medio que tiene un espesor de b cm y una concentración c de una especie absorbente. Como consecuencia de las interacciones entre los fotones de la radiación y las moléculas absorbentes, la potencia o intensidad del haz disminuye de I0 a I. La Transmitancia T de la disolución absorbente se deﬁne como la fracción de radiación incidente que pasa a través de la disolución: 𝐼(𝑃) 𝑇= 𝐼! (𝑃! ) 𝑰 La transmitancia se suele medir como % T = 100×T = 100 × 𝑰𝟎 La Absorbancia A representa la fracción de radiación incidente absorbida por la disolución. Viene dada por la siguiente ecuación matemática: 𝐼! 𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 × = − log 𝑇 𝐼 Donde I0 es la radiación incidente e I es la radiación después de pasar por la muestra. Teniendo en cuenta todas estas ecuaciones, otra manera de expresar la absorbancia es: 𝐼! %𝑇 𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 = −𝑙𝑜𝑔𝑇 = −𝑙𝑜𝑔 𝐴 = 2 − 𝑙𝑜𝑔%𝑇 𝐼 100 Obsérvese que, al contrario que con la transmitancia, la absorbancia de un medio aumenta cuando la atenuación del haz se hace mayor. Ambos términos son adimensionales, no tienen unidades. La ley de Lambert-Beer se puede enunciar como sigue: Supongamos una disolución de una especie absorbente de concentración c contenida en un recipiente de espesor b. Si sobre dicha disolución incide una radiación monocromática, la absorbancia es directamente proporcional al camino óptico b a través del medio y a la concentración c de la especie absorbente. Matemáticamente la ley se puede expresar mediante la siguiente ecuación: 𝐴 =∈× 𝑏 × 𝑐 Donde: 𝐛 es la longitud recorrida por la radiación. En el caso de una medida analítica corresponde a la anchura de la cubeta. 𝐜 es la concentración del analito en la muestra en moles/L. 𝛜 es una constante de proporcionalidad denominada absortividad molar que depende de las características de la muestra y de la longitud de onda de la radiación incidente. Se determina experimentalmente y se expresa en L/moles × cm. Nos informa sobre la cantidad de radiación que absorbe una sustancia a una determinada longitud de onda. La ley de Lambert-Beer es la base para el análisis cuantitativo por espectrofotometría UV-vis. Si partimos del espectro de una sustancia (representación gráﬁca de absorbancia A frente a longitud de onda λ) este gráﬁco presenta ondulaciones con máximos y mínimos. Para hacer las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda correspondiente a un máximo, pues el error de medición es mínimo y la sensibilidad máxima (Observa la ﬁgura) Para veriﬁcar el cumplimiento de la ley de Beer, se debe realizar la curva de calibración, donde se representa la absorbancia (A) en función de la concentración (c), para lo cual se preparan soluciones del analito de concentraciones conocidas (soluciones patrón o referencia) y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida. Si es válida la ley de Beer, para ese analito a esas concentraciones, la relación debe ser una recta, que pase por el origen de los ejes cartesianos; a menudo se observan desviaciones debidas a diversos factores. La ley se cumple para una radiación monocromática que atraviesa disoluciones diluidas. Las desviaciones que presenta la ley son las siguientes: A concentraciones muy elevadas de analito, superiores a 0,01 M, se pierde linealidad, aumentando la desviación si la sustancia dispersa mucho la luz. Los cambios químicos asociados con cambios de concentración. Si la molécula absorbente participa en un equilibrio químico que depende de su concentración, la absorbancia no será constante y cambiará con la concentración. (desviación química) Forma en que se realizan las medidas de absorbancia (desviación instrumental) Cubetas rayadas o sucias. Las longitudes de onda parásitas Ruido del instrumento 4.2 DESCRIPCION DEL INSTRUMENTAL Y DE LA TECNICA ANALITICA 4.2.1 INSTRUMENTACION: ESPECTROFOTOMETROS UV-vis Un equipo de espectrofometría típico está incluye los siguientes componentes: una fuente estable de radiación, un dispositivo que seleccione la longitud de onda, recipientes transparentes para contener la muestra, un detector de radiación que convierta la energía radiante en una señal utilizable, normalmente en una señal eléctrica y un sistema de salida de datos (procesador de señal y dispositivo de lectura). FUENTES DE RADIACION Se encargan de proporcionar la energía radiante (UV y visible) necesaria para estimular el analito. Deben generar un haz de radiación con potencia suﬁciente para ser detectada y medida con facilidad. Además tienen que ser estables (sin cambios bruscos de potencia) y no provocar ﬂuctuaciones. Pueden ser de dos tipos: fuentes continuas y discontinuas o de líneas. Las fuentes continuas emiten radiación en amplio rango de longitudes de onda dentro de una región particular del espectro electromagnético. Las lámparas más comunes utilizadas como fuente continua son: Lámparas de arco de deuterio: que emiten radiación ultravioleta desde 200 nm a 400 nm. Lámparas de ﬁlamento de wolframio: es la fuente más común en el visible e IR. Es útil para la región de longitudes de onda comprendidas entre 350 y 2500 nm. Los ﬁlamentos de wolframio/halógeno son los más efectivos. Lámpara de ﬁlamento de tungsteno: adecuadas para longitudes de onda comprendidas entre 350 y 2200 nm (visible e IR) Lámparas de arco de xenón: útiles para ﬂuorescencia molecular (350-600 nm) Es conveniente saber que todas estas lámparas trabajan a altas temperaturas (! Precaución ¡). En los espectrofotómetros UV-Vis el paso de la lámpara de deuterio a wolframio se realiza entre 325-360 nm de forma que para una misma radiación se utilice el mismo tipo de fuente. Existen también fuentes discontinuas o de líneas que emiten un número determinado de bandas de radiación, cada una de las cuales abarca un margen muy reducido de longitudes de onda. La lámpara más común es la de vapor de mercurio o de sodio. Los láseres también se utilizan como fuentes debido a su elevada intensidad, pequeña anchura de bandas y naturaleza coherente en sus señales de salida. Deben de ser manejados por especialistas con este tipo de fuentes. SELECTORES DE LONGITUD DE ONDA O ANALIZADORES Para seleccionar una longitud de onda se utilizan monocromadores y/o ﬁltros que permiten separar la radiación en las longitudes de onda que la forman y seleccionan una longitud de onda, o un grupo limitado, estrecho y continuo de longitudes de onda denominado banda. Esta longitud de onda o banda es la que se hace pasar a través de la muestra. Una anchura de banda estrecha aumenta la sensibilidad de las medidas de absorbancia, puede proporcionar selectividad tanto a los métodos de absorción como a los de emisión y, con frecuencia, es un requisito para obtener una relación lineal entre la señal óptica y la concentración. La radiación que sale de un selector de longitud de onda correspondería a una radiación de una única longitud de onda o frecuencia denominada radiación monocromática. Sin embargo, no existe ningún selector de longitud de onda que se aproxime al caso ideal. La anchura de banda efectiva, deﬁnida en la Figura 7-11, es una medida inversa de la calidad del dispositivo, siendo la resolución mejor cuanto más estrecha es la anchura de banda. Existen dos clases de selectores de longitud de onda, los ﬁltros y los monocromadores. Los primeros se utilizan en fotómetros y los segundos en espectrofotómetros. Los ﬁltros están compuestos por un material que transmite selectivamente una banda, absorbiendo todas las demás. Se emplean dos tipos de ﬁltros para la selección de la longitud de onda: los ﬁltros de interferencia (llamados a veces ﬁltros de Fabry-Perot) y ﬁltros de absorción. Los ﬁltros de absorción se limitan a la región visible del espectro; mientras que los ﬁltros de interferencia operan en la región ultravioleta, visible y buena parte del infrarrojo. Como su nombre indica, los ﬁltros de interferencia se fundamentan en las interferencias ópticas para producir bandas estrechas de radiación. Los ﬁltros de absorción, que en general son más baratos que los ﬁltros de interferencia se han utilizado mucho para la selección de bandas en la región visible. Estos ﬁltros funcionan absorbiendo una amplia gama de longitudes de onda del espectro, las anchuras de banda efectivas oscilan entre 30 y 250 nm. Tienen un ancho de banda mayor que los de interferencia. El tipo más habitual es un vidrio coloreado o una suspensión de un colorante en gelatina que se coloca entre dos placas de vidrio. Las ventajas de los ﬁltros es que son sencillos, resistentes y baratos, uno de los inconvenientes es que para cada banda se necesita un ﬁltro. Los monocromadores permiten variar, de forma continua y en un amplio intervalo, la longitud de onda de la radiación. Los monocromadores se diseñan para realizar barridos espectrales, y los utilizados para las radiaciones ultravioleta, visible e infrarroja son similares en cuanto a construcción mecánica, ya que todos ellos utilizan rendijas, lentes, espejos, ventanas y redes o prismas. Los monocromadores dan bandas espectrales mucho más estrechas que los ﬁltros y además pueden ajustarse dentro de la zona del espectro que seleccionemos. La calidad de un monocromador depende de la pureza de la radiación de salida, de su capacidad para resolver longitudes de onda adyacentes, de su poder de captación de la radiación y de su anchura de banda. Existen dos tipos, de red y de prisma. RECIPIENTES PARA MUESTRAS En espectroscopía UV-Vis se analizan normalmente muestras líquidas que se colocan en una celda o cubeta. La cubeta es un pequeño tubo de sección cuadrada u ocasionalmente cilíndrica hecho de vidrio, plástico o en el mejor de los casos de cuarzo. Para trabajar en la región ultravioleta se requiere cuarzo o sílice fundida; cualquiera de estas sustancias son también transparentes en la región visible y en la región del infrarrojo. Los vidrios silicatados son adecuados para análisis en la región del visible pero no para radiaciones ultravioleta ya que absorbe radiación. En la región visible también se pueden utilizar los reci- pientes de plástico. Las mejores cubetas tienen ventanas perfectamente perpendiculares a la dirección del haz para minimizar las pérdidas por reﬂexión. La longitud de la cubeta más común para los estudios en las regiones ultravioleta y visible es de 1 cm. También se pueden adquirir cubetas de otros espesores, desde 0,1 cm (o más estrechas) hasta 10 cm. Y también es posible disponer de espaciadores transparentes para acortar el camino óptico de las cubetas de 1 cm y convertirlo en 0,1 cm. En algunos equipos es posible garantizar una temperatura constante de la muestra mediante cubetas termostatizadas con un líquido procedente de un baño exterior y que pasa por una camisa exterior de la cubeta. Por razones de economía, a veces se emplean las cubetas cilindricas en las regiones ultravioleta y visible. Hay que poner especial cuidado en reproducir la posición de la cubeta con respecto al haz; de lo contrario, las variaciones en el camino óptico y en las pérdidas por reﬂexión en las superﬁcies curvas pueden causar errores signiﬁcativos. Las huellas dactilares, la grasa u otras señales sobre las paredes de las cubetas alteran notablemente las características de transmisión. Por ello, es indispensable una limpieza completa antes y después de su uso; la superﬁcie de las ventanas no debe tocarse durante su manipulación. Las cubetas contrastadas nunca deben secarse mediante la acción del calor, en un horno o sobre una llama, este tratamiento puede causar daños físicos o cambios en el camino óptico. Las cubetas deberían calibrarse regularmente entre sí con una disolución absorbente. DETECTORES DE RADIACION El detector es un instrumento que produce una señal eléctrica cuando sobre él inciden los fotones de una radiación. Existen dos tipos generales de detectores de radiación; uno responde a los fotones y el otro al calor. Un ejemplo de detector fotoeléctrico es un fototubo (ﬁgura 7-27) o tubo fotomultiplicador, que consiste en una superﬁcie fotosensible que emite electrones proporcionalmente a la intensidad de la radiación incidente. Estos detectores trazan todo el espectro midiendo una longitud de onda después de otra. Actualmente es posible encontrar detectores, como la ﬁla de fotodiodos, que permiten medir todo el espectro de una solo vez. Los detectores de fotones son muy usados para medir las radiaciones ultravioleta, visible e infrarroja cercana. Los detectores de calor se emplean mucho en la detección de la radiación infrarroja. PROCESADORES DE SEÑALES Y DISPOSITIVOS DE LECTURA El procesador de señal es generalmente un dispositivo electrónico que ampliﬁca la señal eléctrica, la modiﬁca convenientemente y la ﬁltra para eliminar los componentes no deseados. Además, el procesador de señal puede utilizarse para llevar a cabo operaciones matemáticas en la señal como diferenciar, integrar o convertir a logaritmo. La señal obtenida del procesador se visualiza a través de un dispositivo de lectura, como puede ser un medidor digital, un potenciómetro, registrador o un tubo de rayos catódicos Los sistemas de lectura pueden ser de lectura directa (utilizado en equipos con detectores del tipo fotocélulas) y de ampliﬁcación previa (utilizados en equipos con fototubos). TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS Un espectroscopio es un instrumento óptico utilizado para la identiﬁcación visual de líneas de emisión atómicas. Consta de un monocromador, en el que la rendija de salida se reemplaza por un ocular que se puede mover a lo largo del plano focal. La longitud de onda de la línea de emisión se puede determinar a partir del ángulo formado entre el haz incidente y el haz dispersado, cuando la línea se centra en el ocular. Un fotómetro consta de una fuente, un ﬁltro y un detector fotoeléctrico, además de un procesador de señales y un sistema de lectura. Debería tenerse en cuenta que algunos cientíﬁcos y fabricantes de instrumentos se reﬁeren a los fotómetros como colorímetros o colorímetros fotoeléctrico. Los fotómetros diseñados para medidas de ﬂuorescencia se denominan también ﬂuorómetros. Un espectrómetro es un instrumento que proporciona información sobre la intensidad de la ra- diación en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Un espectrofotómetro es un espectrómetro equipado con una o más rendijas de salida y detectores fotoeléctricos que permiten la determinación de la relación entre la potencia de dos haces en función de la longitud de onda como en la espectroscopia de absorción. Un espectrofotómetro para análisis por ﬂuorescencia se denomina, a veces, espectroﬂuorímetro. Existen muchos tipos de fotómetros y espectrofotómetros de absorción molecular, diferenciar unos de otros depende del ﬁn que se quiera conseguir y del aspecto económico. Muchos de ellos se utilizan, con pocos cambios, en ﬂuorescencia molecular e infrarrojo cercano. Existen tres tipos generales de espectrofotómetros de absorción molecular: ESPECTROFOTOMETROS DE HAZ SIMPLE Un instrumento de haz sencillo para medidas de absorción. Consta de una fuente de radiación, un ﬁltro (fotómetro) y/o un monocromador (espectrofotómetro) para la selección de la longitud de onda deseada, cubetas contrastadas que pueden interponerse alternativamente en el haz de radiación, un detector de la radiación no absorbida y un dispositivo de lectura. Entre los instrumentos de haz sencillo hay grandes diferencias en cuanto a su complejidad y características de funcionamiento. El más sencillo y más barato consta de una bombilla de wolframio conectada a una batería, como fuente de radiación, un conjunto de ﬁltros de vidrio para la selección de la longitud de onda, tubos de ensayo para contener la muestra, una célula fotovoltaica como detector, y un pequeño microamperímetro como dispositivo de lectura. ESPECTROFOTOMETROS DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO Un instrumento de doble haz en el espacio en el cual, mediante un espejo en forma de V llamado divisor de haz, se forman dos haces en el espacio. Un haz pasa a través de la disolución de referencia y continúa hasta un fotodetector, simultáneamente el segundo atraviesa la muestra hasta un segundo detector contrastado. Las dos señales de salida se ampliﬁcan y su cociente (o el log de su cociente) se determina electrónicamente y se visualiza mediante un dispositivo de lectura. ESPECTROFOTOMETROS DE DOBLE HAZ EN EL TIEMPO En este caso, los haces se separan en el tiempo mediante un espejo en sectores rotatorio (chopper) que dirige todo el haz que emerge del monocromador, primero a través de la cubeta de referencia y luego a través de la cubeta de la muestra. Los impulsos de radiación se recombinan mediante otro espejo en sectores que transmite un impulso y reﬂeja el otro hacia el detector, que detecta alternativamente el haz de luz de la muestra y el de referencia. 4.2.2 DESCRIPCION DE LA TECNICA ANALITICA Primero se mide la absorbancia, P0 (I0), al pasar el haz de luz por la cubeta de referencia que contiene únicamente el disolvente puro (blanco). A continuación se mide la absorbancia, P (I), al pasar el haz de luz a través de la muestra. Por último, se calcula el valor de la absorbancia debida al analito restando P-P0. Si tenemos un espectrofotómetro con un haz simple como el del esquema del apartado anterior es necesario colocar alternativamente en el haz la cubeta con la muestra y la cubeta de referencia. Esto se puede evitar si disponemos de un equipo de doble haz que mediante un motor permite que la luz pase de forma alternada por la cubeta de la muestra y por la cubeta de referencia. Además este tipo de equipos permite realizar la corrección de una forma automática. Las primeras etapas de un análisis fotomètrico o espectrofotométrico incluyen el establecimiento de las condiciones de trabajo y la preparación de una curva de calibrado que relacione la absorbancia con la concentración. En cualquier caso, para determinar la concentración de un analito mediante espectroscopía UV-Vis se deben de tener en cuenta las siguientes precauciones: Selección de la longitud de onda: se debe escoger la longitud de onda de máxima absorbancia ya que ésta varía muy poco alrededor del máximo, aunque el monocromador cambie ligeramente su posición. Además se consigue la máxima respuesta del analito y la sensibilidad es máxima. En estas condiciones se puede esperar que se cumpla la ley de Beer. En este punto hay que considerar la disminución de la sensibilidad debido a las limitaciones que tenga el instrumento para reproducir con precisión la longitud de onda seleccionada. Variables que influyen en la absorbancia: Las variables que suelen inﬂuir en el espectro de absorción de una sustancia son: la naturaleza del disolvente, el pH de la disolución, la tempera- tura, las concentraciones de electrolito y la presencia de sustancias interferentes. Los efectos de estas variables deben conocerse; y deben elegirse las condiciones para el análisis de manera que la absorbancia no se vea prácticamente afectada por las pequeñas e incontroladas variaciones en sus magnitudes. Limpieza y manipulación de las cubetas: Los elementos internos del equipo y la cubeta deben estar limpios de polvo para evitar la dispersión de la luz. Para conseguir exactitud en el análisis, es necesario el uso de cubetas contrastadas de buena calidad. Éstas deben calibrarse con regularidad, una frente a la otra, para detectar las diferencias que pueden surgir por ralladuras, ataques por ácidos y desgaste por el uso. Es importante que las cubetas de la muestra y de la referencia sean idénticas y además se manipulen con sumo cuidado. El uso de técnicas de limpieza y secado de las cubetas. Se recomienda la siguiente secuencia de limpieza para las caras externas de las cubetas. Antes de la medida, las superﬁcies de la cubeta se limpian con un papel para lentes empapado con metanol de calidad para espectrometría. El papel se coge con una pinza; después de la limpieza, el metanol se evapora, dejando las superﬁcies de la cubeta libres de contaminantes. También es importante que el compartimiento donde se encuentra la cubeta está totalmente cerrado en el momento del análisis para evitar que la luz exterior pueda falsear los resultados. Determinación de la relación entre absorbancia y concentración: Calibración del método. La determinación de la tranmitancia o absorbancia de una muestra a nivel experimental supone en primer lugar conocer el funcionamiento del espectrofotómetro. En este sentido, es obligatorio leerse el manual o instrucciones de uso y mantenimiento del aparato y, en cualquier caso, seguir las indicaciones del profesor. Una vez encendido el equipo, se selecciona la longitud de onda de trabajo y se deja estabilizar la lámpara durante unos 20 minutos, a continuación se mide la transmitancia o absorbancia de las disoluciones patrón y muestras, previo ajuste del cero con el blanco. En algunos espectrofotómetros, es necesario realizar un ajuste previo en modo transmitancia, para ello se sigue, de forma general, los tres pasos siguientes: I. Ajuste del 0 %T (obturador cerrado) con el disolvente o ajuste de corriente oscura. Se realiza apantallando el detector respecto de la fuente por medio de un obturador mecánico. En ausencia de radiación muchos detectores presentan una pequeña corriente oscura. II. Ajuste del 100 %T con el disolvente. Se realiza con el obturador abierto y con el disolvente en la trayectoria de la luz. III. Medición de la absorbancia de la muestra. a) CURVA DE CALIBRADO Establecidas las condiciones para el análisis, es necesario preparar la curva de calibrado a partir de una serie de disoluciones patrón que abarquen el intervalo de concentración esperado en las muestras. Rara vez, o nunca, es seguro asumir el cumplimiento de la ley de Beer y utilizar sólo un único patrón para determinar la absortividad molar. Los resultados de un análisis nunca deberían basarse en los valores de absortividad molar encontrados en la literatura. Lo ideal es que los patrones de calibración tengan una composición parecida a la de las muestras a analizar, no sólo en cuanto a la concentración del analito sino también con respecto a la concentración de las otras especies presentes en la matriz de la muestra, para minimizar los efectos de los distintos componentes de la muestra en la absorbancia medida. b) METODO DE ADICION ESTANDAR A adición un volumen variable Vs mL de disolución estándar del analito de concentración conocida cs a alícuotas idénticas Vx mL de la solución problema con una concentración cx. Se añaden entonces los reactivos que desarrollan el color y cada disolución se diluye hasta un volumen ﬁjo Vt mL antes de medir su absorbancia. Si sigue la ley de Beer, la absorbancia de las disoluciones vendrá dada por: ∈× b × V$ × c$ ∈× b × V& × c& A𝑺 = + V% V% La representación de As, en función de Vs, es una linea recta de la forma: 𝒚 = 𝒎 · 𝑽𝒔 + 𝒃, donde m es la pendiente y b la ordenada en el origen. Su determinación puede realizarse aplicando el método de mínimos cuadrados; entonces cx puede obtenerse mediante la ecuación: 𝑏 × 𝑐( 𝑐' = 𝑚 × 𝑉' Cuando interesa ahorrar tiempo o muestra, es posible realizar un análisis de adición estándar utilizando sólo dos volúmenes de muestra. En este caso, se haría una única adición de Vs mL de patrón a una de las dos muestras. La ecuación que se ha de utilizar para calcular la concentración del analito (x) es: A1 es la absorbancia del estándar, A 2 la absorbancia de la muestra, Vs volumen añadido del estándar (mL), Vx volumen de muestra utilizado (mL) y cs concentración (mg/mL) del estándar añadido. Otro método consiste en preparar una serie de disoluciones patrón de concentraciones exactamente conocidas y que cubran el rango de concentración del analito en la muestra. La recta de calibrado se obtiene al representar absorbancia frente a concentración de los patrones. La cantidad de sustancia en la muestra se calcula llevando la absorbancia de ésta a la curva de calibrado. LA PREPARACION DE LA MUESTRA La preparación de la muestra y de las disoluciones patrón o estándar para obtener la curva de calibrado se ha de hacer de forma lo más exacta posible. Los reactivos deben de tener la pureza adecuada. Es necesario conservarlos de forma idónea. Si cambiamos de reactivos, hay que hacer una nueva curva de calibrado. 4.3 INTERPRETACIONES DE DATOS, REGISTROS GRAFICOS Y RESULTADOS La curva de calibrado es un tipo de registro gráﬁco utilizado en análisis cuantitativo, donde se observa la variación de la energía absorbida con respecto a la concentración de analito. Este registro es la expresión gráﬁca de la ley de Beer. En análisis cualitativo existen diferentes tipos de registros llamados registros espectrales. Lo más habitual es representar en ordenadas el porcentaje de transmitancia, la absorbancia, el logaritmo de la absorbancia o la absortividad molar. En abscisas es habitual representar la longitud de onda, el número de onda o la frecuencia, obteniéndose lo que denominamos espectro (molecular o atómico). El registro espectral es característico de cada molécula y principalmente nos va a servir para determinar la longitud de onda a la que la sustancia tiene su máxima absorción de energía. La Figura 14-11 muestra tres modelos de registros espectrales donde se observa el efecto de la concentración de analito. Al comparar los registros (a) y (b) se ve que en el registro de absorbancia las diferencias entre las alturas de los picos en función de la concentración son mayores que en el registro de transmitancia. Por otra parte, las diferencias entre las curvas son mayores cuando las transmitancias son elevadas. Un registro en el que en ordenadas se representa el logaritmo de absorbancia, conduce a una pérdida de detalle espectral, pero es conveniente para comparar espectros de disoluciones de distintas concentraciones, ya que las curvas se desplazan la misma magnitud a lo largo del eje vertical para múltiplos iguales de concentración. 4.4 CRITERIOS DE ELECCION DE UNA TECNICA Los criterios para elegir entre todas las técnicas ópticas espectroscópicas son básicamente: la calidad de funcionamiento del equipo, la precisión y el precio. También tienen en la elección del método, el problema analítico que se trate, la exactitud, sensibilidad, límite de detección, intervalo de concentraciones y selectividad. 4.5 APLICACIONES La espectroscopia de absorción es una de las herramientas más útiles y más utilizadas en el análisis de especies químicas. Las aplicaciones de los métodos de absorción ultravioleta/visible cuantitativos no sólo son numerosas, sino que abarcan todos los campos en los que se demanda información química cuantitativa. Entre estos campos de aplicación cuantitativa están: análisis de aguas y aguas residuales, análisis clínicos, de fármacos, agroalimentarios, medioambientales y análisis industriales. Otras aplicaciones cuantitativas son la medida de constantes de equilibrio, cálculo de la constante de una reacción química y la determinación de los componentes de una muestra. Numerosas especies inorgánicas se pueden determinar de forma directa; metales de transición, iones nitrito, nitrato y cromato; los tetróxidos de osmio y rutenio; el yodo molecular y el ozono. Un gran número de agentes complejantes se utilizan para la determinación de especies inorgánicas. Los reactivos inorgánicos típicos incluyen el ion tiocianato para el hierro, cobalto y molibdeno; el anión de peróxido de hidrógeno para el titanio, vanadio y cromo; y el ion yoduro para el bismuto, paladio y teluro. Los agentes quelantes orgánicos, que forman complejos coloreados estables con los cationes, son incluso más importantes. Como ejemplos se pueden incluir la o-fenantrolina para la determinación de hierro, la dimetilglioxima para el níquel, el dietilditiocarbamato para el cobre y la difenilditiocarbazona para el plomo. Entre las aplicaciones cualitativas están la determinación de grupos funcionales. La determina- ción espectrofotométrica de cualquier compuesto orgánico que contiene uno o más de estos grupos es potencialmente posible. Otra aplicación es la determinación de sustancias con espectros típicos y en condiciones ﬁjas de pH, disolvente y concentración. 4.6 RIESGOS ASOCIADOS Y MANTENIMIENTO PREVENTIVO I. RIESGOS ASOCIADOS A LOS PRODUCTOS QUIMICOS Y SU MANIPULACION Identificación de productos químicos: etiquetas, fichas de seguridad. Peligrosidad de los productos químicos y sus preparados. Almacenamiento de productos químicos: incompatibilidades. Derrames y atmosferas contaminadas. II. RIESGOS ASOCIADOS CON LA INSTRUMENTACION (ESPECTROFOTOMETROS UV-vis) Y SU UTILIZACION: contacto eléctrico, quemadura térmica y exposición a radiación UV. El control de estos riesgos supone: Instalación adecuada. Mantenimiento preventivo eficaz. Instrucciones de uso y procedimientos normalizados de trabajo con las adecuadas instrucciones de seguridad que contemplen la especificidad de cada técnica. Recomendaciones del fabricante III. RIESGOS MEDIOAMBIENTALES ASOCIADOS A LA PREPARACION DEL ANALISIS: en este sentido es necesario una buena gestión de los residuos que se producen en el laboratorio. Su eliminación pasa por separarlos tal y como se tiene establecido en el laboratorio de trabajo. 4.7 PROPUESTA DE PRACTICAS DE LABORATORIO Obtención de espectros de absorbancia en el UV-visible de permanganato potásico y dicromato potásico. Aplicación a la determinación cuantitativa de estas especies químicas. Determinación de una mezcla de permanganato y dicromato Determinación de nitratos en aguas por espectrofotometría UV-visible. Determinación de nitritos en aguas por espectrofotometría UV-visible Determinación de fosfatos en aguas por espectrofotometría UV-visible Determinación de hierro en aguas por espectrofotometría UV-visible Determinación del color en vinos tintos: IPT y antocianos. Determinación de Fe (III) en vinos tintos por espectrofotometría de absorción molecular en el UV- visible Medidas espectrofotométricas de la absorción en la región UV del aceite de oliva. Determinación de prolina en vinos. 5. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA 5.1 FUNDAMENTO CIENTIFICO-TECNICOS La espectrofotometría de absorción atómica se fundamenta en la absorción de radiación electromagnética por parte de especies atómicas. En la espectroscópica de absorción atómica las muestras se vaporizan entre 2000-6000 K, de esta manera los elementos a analizar se encuentran en forma de “vapor de átomos”, a continuación se mide la absorción de la radiación incidente por parte de los átomos de la muestra en estado gaseoso. Estas muestras suelen ser metales en solución. Mediante esta técnica, al igual que en la espectroscopia UV, podemos conocer la concentración de analito mediante la ley de Lambert-Beer a partir del valor de la absorbancia de la muestra. Sin embargo, no podemos conocer las estructuras ya que se rompen debido a las altas temperaturas lo que diﬁculta la determinación de un valor constante de absortividad molar para una sustancia. Esta falta de uniformidad de la muestra nos obliga a interpolar nuestro valor de absorbancia en una curva de calibración. 5.2 DESCRIPCION DEL INSTRUMENTAL Y DE LA TECNICA ANALITICA Los equipos de medida de espectroscopia de absorción atómica son más complejos que los de espectroscopia UV-Vis, ya que la mayoría de las muestras se encuentran en estado líquido o sólido y en esta técnica la muestra debe encontrarse en un estado gaseoso. Con el ﬁn de obtener temperaturas suﬁcientemente altas para vaporizar la muestra o realizar su conversión a fase gas, estos equipos incorporan un atomizador que permite que el líquido de la disolución se evapore y que las partículas sólidas resultantes se atomicen, es decir, se descompongan en átomos. Para conseguir la atomización de las muestras existen diferentes opciones; Una llama que es la opción más común Un horno de graﬁto La mayor parte de los espectrofotómetros utilizan una llama generada mediante un quemador o mechero de premezcla. Este mechero realiza la mezcla del combustible y comburente antes de introducirla en la llama. La combinación más utilizada de combustible y comburente es acetileno y aire. Sin embargo, existen varias opciones para obtener llamas más calientes. 1. El oxígeno da una temperatura aproximadamente de 1000 ºC superiores al aire, debido a que la combustión es más rápida con oxígeno que utilizando aire. Parte del calor se consume en calentar el 80% (v/v) de nitrógeno que lleva el aire. 2. El N2O (óxido nitroso o protóxido de nitrógeno) se descompone en la llama dando doble cantidad de nitrógeno que de oxígeno, por ello la temperatura con este oxidante es intermedia. La conclusión es que existe una temperatura optima de llama para cada metal. La disolución de la muestra se aspira mediante una corriente de aire y se introduce en el quemador a través de un nebulizador neumático que rompe el líquido en pequeñas gotitas. Este nebulizado se proyecta a gran velocidad sobre una bola de vidrio donde las gotitas se rompen en partículas aun más pequeñas formando un aerosol. Este aerosol juntamente con el combustible y el comburente chocan con unos ﬁltros que favorecen la mezcla y retienen las partículas más grandes. El exceso de líquido se va recogiendo en el fondo del nebulizador. La mezcla que llega a la llama contiene solamente un 5% de la muestra inicial aspirada. Cada cierto tiempo de uso es necesario limpiar los capilares y el fondo del nebulizador. Esta mezcla llega al mechero vaporizándose el líquido mientras las partículas sólidas se vaporizan y se descomponen en átomos. El mechero se dispone lateralmente y no en profundidad. La altura de la llama sobre la cabeza del quemador se puede controlar mediante un ajuste del ﬂujo de mezcla de combustible. La llama generada tiene la misma función que la cubeta en la espectroscopia UV-vis. El camino óptico vendrá dado por el tamaño del mechero, normalmente 10 centímetros. Otra opción para atomizar la muestra es utilizar un horno de graﬁto. Este se ha desarrollado principalmente para evitar los problemas que conlleva el uso de llama. Se trata un cilindro hueco de graﬁto de pocos cm de longitud y unos mm de sección, que se coloca en el camino del haz y consta de dos ventanas que permiten el paso de la luz. La muestra que puede ser líquida, sólida o una mezcla de ellas se pone, a través de un oriﬁcio, en el centro del cilindro y se calienta eléctricamente hasta conseguir una atomización rápida y eﬁciente. Para evitar la oxidación de la muestra y del tubo, se pasa una corriente de gas inerte que puede ser Ar o N2, con ello el horno se purga y se elimina cualquier material volátil. Además y con el ﬁn de evitar quemaduras y disminuir rápidamente la temperatura, y poder así analizar la muestra siguiente, la envoltura metálica del cilindro se refrigera con agua. El horno de graﬁto se utiliza mucho en muestras orgánicas ya que se requiere menos cantidad de muestra y su sensibilidad es mayor al poder controlar la temperatura y el tiempo de mejor manera que en el método de atomización por llama. También se usan otros métodos de atomización, como, por ejemplo, el generador de hidruros, que utiliza una reacción química que produce un compuesto volátil. Elementos como As, Se, Sb, Bi, Ge, Sn, Te y Pb forman hidruros volátiles cuando reaccionan adecuadamente con NaBH4 en medio ácido. Un gas inerte transporta estos hidruros volátiles a un tubo de cuarzo calentado y situado en el camino óptico. Otros quemadores- atomizadores son la navecilla de Khan o de Tántalo y el generador de vapor frío de mercurio. Para que se produzca la absorción es necesario una fuente que emita radiación y ésta incida sobre la muestra que se encuentra atomizada en la llama. Las fuentes de energía son la parte más crítica en espectrofotometría de absorción atómica y entre las más comunes están: Lámparas de cátodo hueco: son las fuentes de emisión más seguras, rápidas y convenientes que existen. Están formadas por un cátodo con forma de copa y fabricado con el mismo metal que se va a analizar y, un ánodo que suele ser un hilo de wolframio, todo sellado en un tubo de vidrio que contiene un gas inerte como neón o argón a baja presión. La ventana frontal es de vidrio o cuarzo, en función de la longitud de onda. Cuando se aplica un alto voltaje a través del ánodo y el cátodo, los átomos de metal en el cátodo se excitan y producen una radiación con una determinada longitud de onda. La anchura de banda de la radiación obtenida es suﬁcientemente estrecha en relación a la anchura espectral de las transiciones atómicas para que la radiación se pueda considerar prácticamente monocromática. La anchura de banda es la diferencia entre las longitudes de onda mayor y menor de una radiación formada por varias ondas. Las lámpara de cátodo huecon son muy caras y de vida corta. Además, como el tipo de tubo catódico depende del metal que se analiza, se requiere uno para cada tipo de metal. También se utilizan las lámparas de multielementos o lámparas múltiples, con más de un elemento en el cátodo que permiten analizar varos metales diferentes. Son más económicas pero dan lugar a pérdidas de intensidad o interferencias espectrales. Ejemplos de lámparas multielementos son: Cr+Mn+Cu; Ca+Mg+Al; Ca+Zn. Lámpara de descarga sin electrodos: una sal del metal que interesa se encierra en un tubo de cuarzo con un gas inerte. El gas se excita con un campo magnético, provocando la ionización del metal. Las intensidades de luz son entre 10 y 100 veces mayores que con la lámpara de cátodo hueco, pero la fuente es menos estable. Finalmente, antes del detector hay un monocromador que permite seleccionar la longitud de onda para cada muestra y eliminar la radiación de emisión procedente de la llama o del horno. Recuerda que la elección del combustible y del comburente depende de la temperatura que se desee obtener en la llama. Antes de iniciar un análisis por absorción atómica es importante seleccionar la lámpara adecuada para el metal a determinar. 5.3 RUIDOS E INTERFERENCIAS: CORRECCION DE FONDO En espectroscopia de absorción atómica tenemos la fuente de radiación y la llama que atomiza la muestra. La pregunta que surge es: ¿Cómo podemos distinguir la señal del analito de la absorción, emisión y dispersión de la llama, plasma u horno de graﬁto? Este fenómeno se conoce como corrección de la absorción de fondo. La absorción de fondo se produce por la absorción, emisión y dispersión producida por todo lo que hay en la muestra diferente del analito y por la absorción, emisión y dispersión producida por la llama, el plasma o el horno de graﬁto. La dispersión es especialmente importante en el caso de los hornos de graﬁto debido a los humos que se originan durante la fase de calcinación. Estas causas de interferencias se evalúan y corrigen utilizando lámparas auxiliares (corrector de ruido de deuterio), mediante un barrido en la región espectral interferente o aplicando el método de la línea base (determina la línea base o cero de absorción) Una forma sencilla de corregir la emisión de la llama es mediante un interruptor del haz que consiste en interrumpir periódicamente la luz procedente de la lámpara mediante un sistema rotatorio. De esta forma se consigue que la señal que llegue al detector cuando no se bloquea el haz de luz se deba a la lámpara y la llama, mientras que cuando se bloquea se deba únicamente a la llama. La diferencia entre estas dos señales nos dará la señal corregida. Las interferencias químicas son las que producen una disminución de la población de átomos metálicos libres en la llama, debido a la presencia o formación de compuestos químicos (óxidos e hidróxidos fundamentalmente). Para minimizarlas se utilizan llamas lo más calientes posibles, ya que el grado de disociación de estos compuestos químicos interferentes aumenta con la temperatura de la llama. La alteración de las propiedades físicas de la disolución (viscosidad, tensión superﬁcial, densidad, presión de vapor) producida por la presencia de sales, ácidos o sustancias orgánicas pueden alterar la temperatura de la llama, velocidad de evaporación del disolvente y la altura y forma de la llama. Para minimizarlas se han de utilizar patrones y disolventes puros y diluyendo convenientemente las soluciones. 5.4 CRITERIOS DE ELECCION DE UNA TECNICA APLICACIONES La espectrometría de absorción atómica es una técnica que permite analizar la concentración de más de 62 metales diferentes en solución y. Todos los metales de transición que se pueden determinar por esta técnica emiten en el ultravioleta. Esta técnica presenta la ventaja de tener una alta reproducibilidad (debido al buen control de las variables analíticas). También se trata de una técnica con una gran sensibilidad, con una exactitud a nivel de partes por billón (ppb) y que permite realizar análisis de varios elementos simultáneamente. Además, permite realizar de una forma automática análisis rutinarios por lo que tiene una gran aplicación a nivel industrial. 5.5 RIESGOS ASOCIADOS Y MANTENIMIENTO PREVENTIVO Además de los riesgos asociados a los productos químicos y su manipulación y las acciones para minimizarlos (etiquetas, ﬁchas de seguridad y almacenamiento adecuado), los riesgos asociados con la utilización de un espectrofotómetro de absorción atómica son: desprendimiento de vapores irritantes y corrosivos, quemaduras térmicas (llama, horno de graﬁto, zonas calientes), fugas de gases (propano, acetileno, protóxido de nitrógeno, etc.), posible formación de hidrógeno cuando se utiliza el sistema de generación de hidruros, explosión por acumulación de gases, exposición a radiaciones UV y riesgo eléctrico. El control de estos riesgos supone: utilizar equipos de protección personal adecuados (guantes, gafas, etc.), sistema de extracción sobre la llama o el horno de graﬁto, buena ventilación (especialmente cuando se trabaje con el generador de hidruros), tomar las precauciones adecuadas cuando se trabaje con acetileno y protóxido de nitrógeno, no mirar directamente a la llama ni a las lámparas y seguir escrupulosamente los protocolos de encendido y apagado establecidos por el fabricante. En cuanto a los riesgos medioambientales asociados a la preparación y realización del análisis, es necesario considerar la gestión correcta de los residuos que se producen en el laboratorio. Su eliminación pasa por separarlos tal y como se tiene establecido en el laboratorio: compuestos orgánicos, colorantes, disolventes clorados, sales cianuradas, sales en disolución, etc. 6. ESPECTROSCOPIA DE EMISION ATOMICA: FOTOMETRIA DE LLAMA La espectroscopia de emisión atómica se diferencia de la de absorción atómica en que no es necesario utilizar una lámpara para producir una radiación ya que, como cualquier técnica espectroscópica de emisión, se basa en analizar las longitudes de onda de los fotones emitidos por los átomos o moléculas durante su transición desde un estado excitado a un estado de inferior energía. Cuando un átomo se excita mediante energía térmica o eléctrica, un electrón externo del átomo es promocionado a algún nivel energético superior. Casi inmediatamente después (aproximadamente 1 nanosegundos: 10-8 s) regresa a su nivel original o a uno de los niveles intermedios mediante un proceso de relajación. En este proceso, el átomo emite una sola línea de radiación para cada transición cuya energía viene dada por la ecuación: 𝐸 = 𝐸2 − 𝐸1 = h × 𝑓𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 Donde E1 y E2 son las energías de los niveles inferior y superior implicados en la transición cuántica y h es la constante de Planck. Los espectros de emisión son característicos de los átomos y no de las moléculas, pues se requiere gran cantidad de energía para excitar y disociar cualquier compuesto químico en sus elementos. En espectroscopía de emisión atómica se excitan fundamentalmente los electrones de valencia y la radiación emitida está formada por líneas agudas y bien deﬁnidas. Los átomos tienen solo niveles de energía electrónicos y de las transiciones entre dichos niveles, resultan las emisiones en forma de líneas discretas características de la espectroscopía de emisión. Todas estas líneas del espectro se corresponden con energías emitidas en el ultravioleta (180-350 nm aproximadamente), visible e infrarrojo cercano, del espectro. La identiﬁcación de las longitudes de onda para esas líneas sirve para el análisis cualitativo y su intensidad para análisis cuantitativo. Para que un elemento en estado fundamental (estado de oxidación 0) emita una línea espectral debe de absorber la energía correspondiente a su potencial de excitación: energía necesaria para llevar un electrón de valencia del estado fundamental al primer estado excitado. Para producir un espectro de emisión completo (multilineal) de un elemento, éste debe de absorber la energía equivalente a su potencial de ionización: energía necesaria para “arrancar” un electrón de valencia e ionizar el elemento. 6.1 METODOS DE EMISION ATOMICA La espectroscopía de emisión atómica abarca una serie de técnicas basadas en la obtención del espectro de emisión de los elementos mediante la excitación de la muestra utilizando fuentes de excitación mediante energía térmica o eléctrica: llamas, plasma, arcos eléctricos o chispas eléctricas. Midiendo la energía emitida por la muestra, estos espectros permiten la determinación cualitativa y cuantitativa de elementos metálicos presentes en diferentes tipos de muestras. FUENTE DE ENERGIA TECNICA Llama Fotometría de llama Radiación electromagnética Fluorescencia atómica Eléctrica Espectrometría de emisión Plasma ICP (Plasma Acoplado Inductivamente) Rayos X Fluorescencia de Rayos X Con una fuente suﬁcientemente energética pueden excitarse casi todos los elementos de la tabla periódica dando lugar a sus correspondientes espectros de emisión atómica. La complejidad de estos espectros depende de la conﬁguración electrónica del elemento implicado. A mayor complejidad del espectro menor sensibilidad tiene la espectroscopía de emisión atómica. En espectroscopía de emisión atómica la atomización y excitación se puede realizar de varias formas: Mediante una llama: en la que se quema un aerosol de la muestra a analizar utilizando el mismo procedimiento que hemos descrito en espectroscopía de AA. Mediante una fuente de plasma: el plasma es un gas ionizado. Una corriente de argón de gran pureza se ioniza haciendo circular una corriente eléctrica. Los electrones generados chocan a gran velocidad con los átomos de la muestra transmitiendo su energía al gas. Para mantener las elevadas temperaturas, del orden de 6000 a 10000 K, es necesario el aporte continuo de energía eléctrica. El quemador de cuarzo debe ser refrigerado con argón frío. Esta opción permite obtener temperaturas más uniformes evitando que una parte de la energía emitida por los átomos excitados de la parte central de la llama más caliente sea absorbida por la parte exterior más fría. Este fenómeno se conoce con el nombre de autoabsorción. Actualmente son las fuentes de plasma las más importantes y ampliamente utilizadas. Sin embargo, en este apartado se describirá la técnica fotometría de llama. 6.2 FOTOMETRIA DE LLAMA La fotometría de llama (FLL) es una técnica espectroscópica de emisión atómica que utiliza una llama como fuente de atomización y excitación y un fotodetector electrónico como dispositivo de medida. Es un método cuantitativo y muy sensible para analizar metales alcalinos (Li, Na y K) y algunos de los alcalinotérreos. Todos estos metales emiten en el visible. Esta técnica también se puede utilizar para análisis cualitativo examinando las longitudes de onda del espectro de emisión. En fotometría de llama la sensibilidad es proporcional al número de átomos excitados, mientras que en absorción atómica la sensibilidad depende del número de átomos que se encuentran en el estado fundamental. Debido a que solo un pequeño porcentaje de átomos están en estado excitado en la llama, la espectrofotometría de absorción atómica es más sensible que la fotometría de llama para elementos tales como Mg, Zn, Cd, Pb, etc, y presenta menos interferencias. 6.2.1 DESCRIPCION INSTRUMENTAL Y DE LA TECNICA ANALITICA La llama es la fuente de atomización y excitación. LA LLAMA La llama tiene que cumplir dos condiciones básicas, que la temperatura sea la adecuada y que se forme un ambiente gaseoso adecuado para que se den los siguientes procesos: 1o Evaporar o pasar la muestra del estado líquido (o sólido suspendido) al gaseoso. 2o Descomponer y atomizar, la llama descompone los compuestos moleculares que contienen el elemento que nos interesa en especies más sencillas y átomos. 3o Proporcionar la energía de excitación e ionización a través de la energía térmica de la llama: estas especies químicas sencillas y/o átomos se excitan por la energía de la llama. Una llama típica consta de un cono interno, un cono externo y una zona interconal (entre conos). La ﬁgura 9-2 representa las regiones de una llama. En el cono interno se produce una combustión parcial (zona de combustión primaria). Aquí se produce gran emisión de luz (a partir del combustible y no de la muestra), una gran ionización y una gran concentración de radicales libres. Es poco utilizada para análisis. Inmediatamente por encima está la zona interconal, que es la parte caliente de la llama, donde tiene lugar una combustión completa y la que se utiliza en absorción atómica (con quemador) y fotometría de llama. La zona más externa o cono externo es de combustión secundaria y poco útil desde el punto de vista analítico. La altura de llama sobre el quemador varía con el tipo de quemador utilizado, la naturaleza de la mezcla combustible más comburente y el ﬂujo utilizado (velocidad de ﬂujo). Una de las propiedades más importantes de una llama es su temperatura, ya que es la energía térmica la responsable de la descomposición de la muestra en átomos individuales y de la excitación de los átomos formados. La temperatura de la zona interconal se usa para caracterizar las llamas. SECUENCIAS DE FENOMENOS QUE TIENEN LUGAR EN LA LLAMA Evaporación de la muestra en forma de aerosol al entrar en contacto con la llama: primero se evapora el agua o los otros disolventes dejando como residuo diminutas partículas de sal seca. En segundo lugar, la sal seca se vaporiza, pasa a gas. Atomización: parte de las moléculas gaseosas se disocian progresivamente dando lugar a átomos neutros o a radicales. Estos átomos neutros son las especies absorbentes en absorción atómica y las potencialmente emisoras en fotometría de llama. Para la formación de átomos libres existe una temperatura óptima de llama para cada elemento metálico. Por ello, la eﬁcacia con que las llamas producen átomos neutros tiene gran importancia en absorción atómica y fotometría de llama. Excitación: los electrones de los átomos experimentan transiciones electrónicas pasando a estados excitados, con ello se consigue que los átomos neutros se exciten térmicamente o se ionizan. La fracción de átomos libres que se excitan térmicamente depende de la temperatura y la diferencia de energías entre los niveles implicados en las transiciones electrónicas. Como la fracción de átomos excitados depende críticamente de la temperatura, es fundamental un control cuidadoso de la llama, sobre todo en fotometría de llama. Emisión: se producen transiciones electrónicas de los estados excitados al estado fundamental emitiendo energía que se mide mediante un detector. La fracción excitada térmicamente es importante en fotometría de llama, ya que el retorno al estado fundamental de los electrones excitados es el responsable de la emisión de la radiación que se emite. Finalmente, un monocromador permite seleccionar la longitud de onda adecuada para cada analito. Por último, parte de los átomos neutros o de los radicales que se encuentran en la llama pueden combinarse para formar nuevos compuestos gaseosos, dando lugar a interferencias químicas. Formación de átomos ionizados: la ionización de los átomos del analito reduce la concentración de átomos neutros de analito en la llama. La formación de átomos ionizados aumenta con la temperatura de la llama, sin embargo, el grado de ionización del elemento a analizar se puede disminuir por adicción de una elevada concentración de otro elemento que sea más fácilmente ionizable (tampón de radiación o supresor de ionización). Cuando se necesita suprimir la ionización se preﬁere añadir un tampón de radiación que disminuir la temperatura, ya que las temperaturas bajas de llama aumentan las interferencias. LOS QUEMADORES Se utilizan dos tipos de quemadores fundamentalmente: Quemador de consumo total o de ﬂujo turbulento (también denominado quemador de difusión): el combustible y el comburente se mezclan en el momento de entrar en la llama. Los quemadores de consumo total aspiran la muestra y la introducen directamente en la llama por efecto Venturi. La muestra que atraviesa el capilar llega a la llama en ﬂujo turbulento debido a la alta velocidad, donde se consume de forma total. Quemador de premezcla o de ﬂujo laminar: en este caso, el combustible y el comburente se mezclan antes de llegar a la llama. El quemador de premezcla o ﬂujo laminar es más reciente que el primero y se usa habitualmente. En este tipo de quemador la muestra aspirada, el combustible y el comburente se mezclan totalmente, antes de alcanzar la llama. El oriﬁcio o cámara es una especie de rendija larga y estrecha por donde los gases pasan de una manera sueva y no turbulenta. EL FOTOMETRO DE LLAMA Quemador-atomizador: una de las características críticas en fotometría de llama es la regulación del ﬂujo combustible + comburente, que afectará a la velocidad de atomización de la muestra y a la estabilidad de la llama. Por ello se necesitan válvulas reguladoras de gran calidad y compresores (en el caso de utilizar aire) además de los correspondientes manómetros y manoreductores. Los valores óptimos de ﬂujo y presión se determinan en cada caso, de manera experimental. Sistema óptico: Recoge la radiación procedente de la parte posterior de la llama y la envía hacia un monocromador (espectrofotómetro) o un ﬁltro (fotómetros). Se suele usar un espejo colimador cuyo centro de curvatura se sitúa dentro de la llama. Así, la intensidad de la radiación emitida es casi el doble de la que obtendríamos al considerar sólo la emitida directamente por la llama. Detectores: Los más utilizados son los tubos fotomultiplicadores. Ampliﬁcan la señal de manera que se pueden detectar incluso emisiones muy débiles. Sistema de registro: Suelen tener incorporados un microprocesador con programas de PC que procesan los datos obtenidos a partir de la señal emitida y ampliﬁcada por el detector, transformándola en una señal gráﬁca en pantalla o en un número. Pueden llevar acoplados una impresora, para imprimir los resultados. TECNICA ANALITICA Se requiere la mínima preparación de las muestras, a veces ninguna. En fotometría de llama el analito está generalmente en disolución acuosa. Una vez encendido el espectrofotómetro o el fotómetro y ajustada la llama con la mezcla combustible más comburente, se ajusta a cero con agua desionizada. Al igual que en otros métodos, es imprescindible realizar una curva de calibrado utilizando los patrones adecuados. En este sentido es conveniente recordar el método de las adiciones estándar, debido a que preparar patrones que tengan una composición muy parecida a la de la muestra es difícil, el método de las adiciones estándar minimiza este problema 6.2.2 CRITERIOS DE ELECCION DE UNA TECNICA DE APLICACIONES Si comparamos los límites de detección podemos decir que la fotometría de llama es la mejor técnica para metales alcalinos (Li, Na y K), ya que se excitan a temperaturas relativamente bajas para dar espectros muy sencillos y libres de interferencias de otras especies. La espectrofotometría de absorción atómica es superior para casi todos los demás metales. La cuantiﬁcación del analito se realiza a través de la curva de calibrado donde se representa emisión frente a concentración (o volumen de estándar añadido). Existe una buena linealidad a bajas concentraciones. Una de las aplicaciones cuantitativas más importantes es la determinación de sodio y potasio en sangre y orina. A continuación se propone un ejemplo de aplicación de la fotometría de llama, donde se determinará por emisión atómica un metal alcalino utilizando el método de las adiciones estándar. El procedimiento es similar al que se utiliza en un análisis mediante espectroscopía AA. Primero se pone en marcha el equipo. A continuación, se abren las llaves de gas, se acciona el compresor y se enciende el mechero, regulando el caudal de gas y aire y ajustando la altura de la llama siguiendo las indicaciones del fabricante. Es conveniente que esté encendido unos minutos para que la llama se estabilice. En el caso de una espectroscopia de AA se deberá seleccionar y encender la lámpara adecuada. 6.2.3 RIESGOS ASOCIADOS Y MANTENIMIENTO PREVENTIVO Riesgos asociados a los productos químicos y su manipulación: es necesario tener presente lo que indican las etiquetas y las fichas de seguridad química respecto a las precauciones y peligros que representan la manipulación de productos químicos. Es también importante almacenar los productos químicos de forma adecuada. Riesgos asociados con la instrumentación (fotómetro de llama): desprendimiento de vapores irritantes y corrosivos, quemaduras térmicas (llama, zonas calientes), fugas de gases inflamables (propano), explosión por acumulación de gases, exposición a radiaciones UV y riesgo por contacto eléctrico. El control de estos riesgos supone: utilizar equipos de protección personal adecuados (guantes, gafas, etc.), sistema de extracción sobre la llama, buena ventilación, no mirar directamente a la llama y seguir escrupulosamente los protocolos de encendido y apagado establecidos por el fabricante. Instalación de gas propano: El fotómetro de llama utiliza una mezcla de aire y propano. El aire se introduce a través del compresor mientras para el propano existe una instalación aparte. Tanto el montaje como el mantenimiento de las instalaciones de gas propano deben realizarse por empresas autorizadas por el Ministerio de Industria. Las principales normas de seguridad para su uso se recogen a continuación: I. Antes de abrir las canalizaciones generales del gas, cerciorarse que todas las tomas están cerradas. II. Mantener el mechero encendido solo el tiempo necesario III. No calentar nunca líquidos inflamables con la llama, pueden arder o explotar. IV. No colocar frascos o botellas de líquidos inflamables cerca de focos caloríficos, con llama o sin ella, pueden originarse explosiones. V. Asegurarse de que queda cerrado el mechero una vez terminada la tarea, cerrando todas las tomas y llaves que se han abierto. Riesgos medioambientales asociados a la preparación del análisis: es necesario una buena gestión de los residuos que se producen en el laboratorio. Su eliminación pasa por separarlos tal y como se tiene establecido en el laboratorio. 6.3 PROPUESTA DE PRACTICAS Determinación de sodio y potasio en aguas naturales por fotometría de llama. Determinación de potasio en vinos, mostos y zumos por fotometría de llama. 7. ESPECTROFOTOMETRIA INFRARROJA 7.1 FUNDAMENTO La región infrarroja del espectro es la que corresponde a longitudes de onda que van de 0,78 a 1000 μm. Desde el punto de vista de las aplicaciones como de los instrumentos utilizados, es conveniente subdividir el espectro infrarrojo en tres regiones denominadas infrarrojo próximo o cercano (0,78-2,5 μm), medio (2,5-50 μm) y lejano (50-1000 μm). La región más utilizada en análisis instrumental es la comprendida entre 2,5 y 25 μm por ser la que da mayor información sobre las vibraciones de las moléculas y, por lo tanto, sobre la estructura de las mismas. Por lo general, la radiación infrarroja no es suﬁcientemente energética como para producir las transiciones electrónicas que se dan cuando se trata de radiaciones ultravioleta y visible. La absorción de radiación infrarroja provoca transiciones entre niveles de energía vibracionales y rotacionales de la molécula (modos normales de vibración). Para la mayoría de las moléculas las diferencias de energía entre los diferentes estados vibracionales corresponden a la región del infrarrojo medio. Los espectros de absorción y emisión en el infrarrojo, de especies moleculares, se pueden explicar asumiendo que todos son consecuencia de los distintos cambios energéticos producidos en las transiciones de las moléculas de unos estados de energía vibracionales y rotacionales a otros. TRANSICIONES VIBRACIONALES Y ROTACIONALES Las sustancias de las que deseamos obtener espectros en el infrarrojo se componen de moléculas y estas a su vez de átomos. Pero los átomos no están unidos rígidamente entre sí, sino que oscilan o vibran alrededor de los enlaces que los unen con una frecuencia determinada, denominada frecuencia natural de vibración, y una intensidad característica. Si este sistema se somete a una perturbación, por ejemplo, radiación infrarroja, con una frecuencia próxima a la frecuencia natural del sistema, las dos oscilaciones se sumarán produciendo un desplazamiento o cambio vibracional que puede detectarse. Las moléculas tienen frecuencias naturales de vibración y rotación que se conocen con el nombre modos normales de vibración y la espectrofotometría IR se basa en las transiciones entre estos niveles de energía. Es decir, consiste en ampliﬁcar una de estas vibraciones o rotaciones de un determinado enlace (en esto consiste una transición entre niveles energéticos) aplicando una radiación IR que tenga una longitud de onda similar a la frecuencia natural del enlace. Las bandas que aparecen en un espectro IR corresponden a estas transiciones entre estados vibracionales. Aunque el número total de vibraciones de una molécula es 3n-6 (3n-5 si la molécula es lineal), donde n es el número de átomos, las vibraciones las podemos clasiﬁcar en dos grupos básicos: Tensión (streching): la distancia entre los dos átomos aumenta y disminuye alternativamente, pero los átomos se mantienen en el mismo eje de enlace. Puede ser simétrica o asimétrica. Flexión (bending): se mantiene la distancia interatómica, pero la posición de los átomos cambia respecto al eje del enlace. Se modiﬁca el ángulo de enlace. Pueden ser de balanceo, aleteo, tijera, torsión. No obstante, hay que tener en cuenta que para que una molécula absorba energía IR debe producirse un cambio en su momento dipolar. Esto explica porque las moléculas homopolares como el O2, N2, Cl2 no presentan absorción en la región IR. Recuerda: la energía de la radiación infrarroja no es suﬁciente para producir transiciones electrónicas. Sí que es suﬁciente para ampliﬁcar el movimiento vibracional de las moléculas. 7.2 REGISTROS GRAFICOS: ESPECTRO IR Las frecuencias de vibración dependen fundamentalmente del peso de los átomos que vibran y de la fuerza del enlace que los une. Las frecuencias se ven solamente afectadas ligeramente por el resto de átomos de la molécula. De esta forma los modos normales de vibración son característicos de los grupos funcionales o tipos de enlaces de la molécula y nos sirven por tanto para su identiﬁcación. Un espectro de absorción en el infrarrojo, a diferencia de lo que sucede en la mayoría de los espectros obtenidos en el ultravioleta y visible, se observan una gran cantidad de picos. Los picos que aparecen en un espectro IR se denominan bandas. Una banda es una zona del espectro donde se produce una absorción considerable de radiación IR. En estos gráﬁcos, en el eje de las abcisas se representa la longitud de onda o el número de onda y en de las ordenadas la absorbancia o la transmitancia. Un valor del 100% de transmitancia o del 0% de absorbancia signiﬁca que la radiación no se ha absorbido, sino que se ha transmitido totalmente. Se preﬁere utilizar el número de onda debido a la proporcionalidad que existe entre esta magnitud y la energía o frecuencia absorbida. Un espectro de IR se compone de dos secciones: Zona de frecuencia de grupo: 4000-1200 cm-1. En esta zona se encuentran las frecuencias correspondientes a los grupos funcionales. Las bandas de absorción suelen ser características de grupos especíﬁcos de átomos y son relativamente independientes del resto de átomos y enlaces de la molécula. Zona de huella digital o dactiloscópica: 1200-600 cm-1. En esta zona se localizan las frecuencias correspondientes a las vibraciones del esqueleto de la molécula (donde vibra la totalidad de la molécula) y nos sirve para caracterizar la molécula que estamos analizando lo mismo que una huella digital. Las frecuencias están muy afectadas por la estructura molecular y por tanto las bandas de esta zona se consideran especíﬁcas más para una molécula en particular que para un grupo funcional especíﬁco. Hay que tener en cuenta que el estado físico de la muestra afecta a las frecuencias de grupo y a la forma de las bandas. Además si la molécula es poliatómica las bandas de absorción son muy complejas ya que se incrementan el número de vibraciones posibles (recuerda que el número total es 3n-6) y a veces la energía de una vibración puede afectar a otra vibración produciéndose acoplamientos que complican aun más el espectro IR. Para un mismo grupo la frecuencia varía en función de la estructura molecular donde se encuentre. Las tablas de correlación pocas veces son suﬁcientes para establecer la identidad de un compuesto orgánico a partir de su espectro en el IR, en este sentido existen colecciones de espectros que ayudan a la identiﬁcación del compuesto por comparación de los espectros. 7.3 INSTRUMENTACION Espectrofotómetro dispersivo: los componentes básicos de este tipo de equipo son los mismos que los de un espectrofotómetro UV-Vis, es decir, una fuente de infrarrojos, monocromador, cubetas de medición para las muestras, un transductor o detector sensible en el infrarrojo y un registrador. A continuación se describen algunos de estos componentes. o Fuente de energía: debe ser continua, de gran intensidad y con una longitud de onda estable. Las fuentes de infrarrojo consisten en un sólido inerte que se calienta eléctricamente a una temperatura comprendida entre 1500 y 2200 K, de esta forma la fuente comienza a irradiar. Existen varios tipos. § Emisor Nersnt: ﬁlamento incandescente construido con una mezcla de óxido de zirconio e itrio, presenta una máximo de radiación a 7100 cm-1 al calentarse a 1.500- 2.000 ºC. § Fuente globar: formado por varillas de carburo de silicio que producen una radiación próxima a 5200 cm-1 cuando se calienta a 1300-1400 ºC por el paso de una corriente eléctrica. § Calentadores de Nicrom: ﬁlamentos de níquel-cromo calentados a 800-900 ºC. o Monocromador: se trata de cristales iónicos como cloruro de sodio, vidrio, ﬂuoruro de calcio, que permiten aislar una banda estrecha de energía radiante. o Detector: miden la energía transmitida a través de la muestra. En el caso de los equipos de IR dispersivos los más utilizados son detectores térmicos, como los termopares, formados por la unión de dos metales distintos que generan un pequeño potencial al cambiar la temperatura; termistores o bolómetros, donde la resistencia varía al cambiar la temperatura; detectores de dilatación o neumáticos de Golay, donde un gas se expande al aumentar la temperatura. A diferencia de los espectrofotómetros UV-Vis en los equipos IR la muestra puede ir situada entre la fuente y el monocromador, ya que la energía de la radiación IR no es suﬁcientemente grande para descomponer la muestra. Un esquema de espectrofotómetro dispersivo de doble haz, la radiación se divide en dos haces, el primero pasa a través de la cubeta de medición y el otro a través de la cubeta de referencia. Un espejo giratorio dirige los rayos de una y otra cubeta, alternativamente, a través del monocromador hacia el detector. El monocromador selecciona una longitud de onda determinada, de esta forma si la muestra absorbe más radiación de una determinada longitud de onda que la referencia, se emite una señal en el detector. Las señales del detector se ampliﬁcan y por último se registran de forma conveniente. También se pueden utilizar fotómetros de IR, cuya diferencia con el espectrofotómetro dispersivo es que la longitud de onda se selecciona mediante un ﬁltro. Con los espectrofotómetros dispersivos con monocromador es difícil acceder a la zona de 10 a 400 cm-1. Para conseguirlo actualmente se utilizan espectrofotómetros de transformada de Fourier que constituyen el segundo grupo de equipos de IR que vamos a explicar. Espectrofotómetro de transformada de Fourier (TSIF): la transformada de Fourier es una operación matemática que permite descomponer una onda compleja en componentes más simples. Los equipos con transformada de Fourier obtienen la información espectral sin necesidad de ﬁltrar con el monocromador la radiación para obtener longitudes de onda de interés. Se trata de un dispositivo que permite obtener todos los componentes de la respuesta analítica simultáneamente, es decir barrer toda la región IR. Los equipos con transformada de Fourier presentan las siguientes ventajas respectos a los dispersivos con monocromador: Al no tener monocromador la potencia que llega al detector es mayor y por tanto aumenta la sensibilidad. Todas las radiaciones llegan al detector al mismo tiempo lo que permite obtener un espectro IR en un segundo o menos. Una mayor resolución de espectros. En la mayoría de los instrumentos modernos, existe un microprocesador capaz de presentar la señal de salida en varios formatos: trasmitancia frente a longitud de onda y absorbancia frente a número de onda o longitud de onda. En la ﬁgura 16 -8 se muestra un esquema de espectrofotómetro con transformada de Fourier. 7.4 CRITERIOS DE LA ELECCION DE LA TECNICA Los límites de detección y sensibilidad de la espectrofotometría infrarroja son menores que la espectrofotometría UV-Vis. Además, la radiación infrarroja es de baja energía lo que provoca algunos problemas de instrumentación debido a: El ruido electrónico de la instrumentación del equipo tiene un valor muy similar a la señal medida. El ruido térmico debido a la energía infrarroja que emiten los componentes del equipo al calentarse. 7.5 APLICACIONES La región más utilizada es el IR medio, que sirve fundamentalmente para análisis cualitativos y cuantitativos de numerosas especies, siendo la principal herramienta para la determinación estructural de moléculas orgánicas y bioquímicas. Determinación de estructuras de compuestos orgánicos y bioquímicos: en este caso las muestras deben ser muy puras y la región más útil es la característica de las frecuencias de grupo. Consiste en asignar las bandas del espectro obtenido a grupos funcionales. Análisis cualitativo: permite identiﬁcar sustancias desconocidas y mezclas. Se basa en el hecho de que dos sustancias diferentes no absorben con la misma intensidad y en las mismas frecuencias. Un espectro IR de una determinada sustancia se puede considerar la "huella dactilar" de la sustancia. Por tanto, el criterio de identiﬁcación es que el espectro problema coincida de forma precisa con un patrón o espectro conocido, tanto en la posición de las bandas como en las intensidades. Análisis cuantitativo: no es una aplicación muy extendida ya que presenta algunos problemas debido a la diﬁcultad del ajuste de la lectura al 0% de transmitancia. La región del infrarrojo cercano tiene utilidad en la determinación cuantitativa de rutina de ciertas especies, como el agua, dióxido de carbono, azufre, hidrocarburos de bajo peso molecular, nitrógeno amínico y muchos otros compuestos sencillos que tienen interés en agricultura e industria. La principal utilidad de la región del infrarrojo lejano consiste en la determinación de estructuras de especies inorgánicas y organometálicas. Detección de impurezas: la presencia de impurezas normalmente provoca un ensanchamiento de las bandas que provocan una pérdida de resolución y incluso la aparición de nuevas bandas. Por tanto, consiste en comparar el espectro problema con un espectro patrón. El espectro de infrarrojo no solo sirve para caracterizar al compuesto, sino que indica su grado de pureza y proporciona frecuentemente alguna orientación acerca de la naturaleza de las impurezas presentes. Como ejemplo de aplicación se propone analizar los siguientes espectros: Espectro IR correspondiente al etanol, CH3-CH2OH Espectro IR correspondiente a un copolímero de estireno y acrilonitrilo 7.6 TRATAMIENTO DE LA MUESTRA La realización de un IR no es tan fácil como poner la muestra en un soporte o cubeta y apretar un botón. Teniendo en cuenta lo que hemos explicado anteriormente, existen dos problemas que se deben tener en cuenta: El espesor de la muestra que debe atravesar la radiación IR, recuerda que se trata de una radiación poco energética. El recipiente o soporte utilizado para poner la muestra en el equipo de medida, ya que se debe evitar que absorba radiación en la región donde se efectúa la medida. El tratamiento y soporte utilizado depende del estado físico de la muestra: Gases: se utilizan cubetas de unos 10 cm de longitud. Para llenarlas se hace el vacío y después se llenan con la muestra a la presión de trabajo en función de las características de la muestra. Presión baja de unos 5 mmHg o menores si la sustancia es fuertemente absorbente en la región del IR. Presión moderada, hasta media atmósfera, si la sustancia es poco absorbente. Líquidos: en el análisis cualitativo de líquidos de baja volatilidad se coloca una gota del líquido entre dos placas de sal de roca (cristales de cloruro de sodio cristalizado de pureza 98-99%). Es importante que las placas estén muy limpias y secas. La limpieza se debe efectuar con un papel absorbente húmedo con acetona, nunca con agua ya que disolverían las placas. En el caso de líquidos volátiles, con temperaturas de ebullición alrededor de 70oC, el método anterior no garantiza que la muestra quede perfectamente retenida entre las dos placas produciéndose la evaporación de la muestra antes de la ﬁnalización del análisis. En el caso de disoluciones, los disolventes utilizados deben estar secos y ser transparentes a la absorción a la región de IR de interés. Además deben ser inertes respecto a la muestra. Los más utilizados son el tetracloruro de carbono, el disulfuro de carbono o el cloroformo. Sólidos: existen diferentes técnicas dependiendo de la naturaleza de la muestra. Las dos técnicas más importantes son: Pastillas de bromuro de potasio: se mezcla 1 mg de la muestra ﬁnamente dividida con 300 mg de polvo de KBr de alta pureza en un mortero de ágata o mármol y por compresión durante un minuto aproximadamente se realiza una pastilla transparente. Antes de proceder a la compresión de la mezcla en el molde, se debe eliminar todo el aire que pueda quedar atrapado. Hay que asegurarse que el KBr esté totalmente seco ya que es una sustancia muy higroscópica. Dispersión en aceites minerales: se realiza, en un mortero de ágata o de mármol, una mezcla de la muestra ﬁnamente dividida con aceites minerales, por ejemplo, el Nujol que es una mezcla muy reﬁnada de varios hidrocarburos de cadena lineal. Si se desea analizar el enlace –CH, se utilizan aceites clorados o ﬂuorados. El procedimiento para obtener la dispersión consiste en polvorizar la muestra seca hasta obtener un polvo ﬁno. Posteriormente se añaden unas gotas de aceite dispersante y se continúa polvorizando hasta obtener una pasta ﬁna. El análisis se realizará colocando sobre las placas de cloruro de sodio unas gotas de esta pasta. 7.7 RIESGOS ASOCIADOS Y MANTENIMIENTO PREVENTIVO Además de los riesgos asociados a los productos químicos y su manipulación y las acciones para minimizarlos (etiquetas, ﬁchas de seguridad y almacenamiento adecuado). Los riesgos asociados con la utilización de un espectrofotómetro infrarrojo son: quemaduras térmicas (lámparas y zonas calientes), exposición a radiación IR y riesgo eléctrico. El control de estos riesgos supone: utilizar equipos de protección personal adecuados (guantes, gafas, etc.), buena ventilación, no mirar directamente a las lámparas y seguir escrupulosamente los protocolos de encendido y apagado establecidos por el fabricante. En cuanto a los riesgos medioambientales asociados a la preparación y realización del análisis, es necesario considerar la gestión correcta de los residuos que se producen en el laboratorio. Su eliminación pasa por separarlos tal y como se tiene establecido en el laboratorio: compuestos orgánicos, colorantes, disolventes clorados, sales cianuradas, sales en disolución, etc. 8. ESPECTROMETRIA DE LUMINISCENCIA MOLECULAR: FLUORESCENCIA MOLECULAR 8.1 FUNDAMENTO TEORICO La espectrometría de luminiscencia molecular abarca tres técnicas ópticas muy relacionadas entre sí́: ﬂuorescencia y fosforescencia molecular y quimioluminiscencia. A menudo, los fenómenos de ﬂuorescencia y fosforescencia se nombran bajo el término general de fotoluminiscencia. A diferencia de la espectroscopía UV-Vis donde se mide la fracción de la radiación incidente que llega al detector (absorbancia) en la ﬂuorescencia y la fosforescencia se mide la intensidad de la radiación emitida por la muestra. Por tanto, se trata de dos procesos de emisión, muy importantes en análisis químico, en los que los átomos o las moléculas se excitan mediante la absorción de radiación electromagnética; posteriormente, la energía absorbida se disipa por emisión de radiación que se produce cuando las especies excitadas regresan al estado fundamental o por un proceso de relajación no radiante. El estado electrónico en el que todos los espines electrónicos están apareados, se conoce como estado de singulete. Cuando uno de los electrones de un par electrónico de una molécula se excita a un nivelsuperior de energía, se puede dar un estado desingulete o de triplete. En el estado excitado desingulete, el espín del electrón promovido se encuentra en dirección contraria al del electrón no excitado. En cambio, en el estado de triplete, los espines de los dos electrones están desapareados y son paralelos. Además el estado excitado de triplete es menos energético que el estado excitado de singulete. Una de las formas de disipar este exceso de energía es emitiendo una radiación de menor energía que la que inicialmente provocó la excitación. Y es en este punto donde podemos distinguir dos situaciones en función de si el estado excitado es singulete o triplete: Fluorescencia: la transición se produce entre un estado singulete excitado y un estado fundamental singulete en el que todos los orbitales ocupados tienen dos electrones con espín opuesto. La probabilidad de que se lleve a cabo esta transición es muy alta; por lo tanto, el tiempo de vida de un estado excitado de singulete es muy breve (de 10-5 s o menos). Fosforescencia: la transición se produce entre un estado excitado triplete y un estado fundamental singulete. Como esta transición lleva cambio de espín, la probabilidad de que suceda es muy baja; por lo tanto, el estado excitado de triplete tiene una vida media mucho mayor (de 0,1 ms a 104 s). Se puede aﬁrmar que la diferencia fundamental entre ﬂuorescencia y fosforescencia radica en el tiempo que tarda en producirse la emisión de energía: La fluorescencia sucede más rápidamente que la fosforescencia y generalmente ﬁnaliza unos 10-5 s después del inicio de la excitación. La emisión de fosforescencia tiene lugar durante períodos más largos de 10-5 s y, de hecho, puede continuar durante minutos o incluso horas después de que la irradiación haya cesado. La espectrometría de ﬂuorescencia consiste en excitar los electrones de las moléculas de ciertos compuestos mediante un haz de luz, normalmente radiación ultravioleta, y provocar la emisión de luz de una menor energía, generalmente luz visible. Para medir la ﬂuorescencia molecular de una sustancia, la muestra se excita con radiación de una longitud de onda determinada (o longitud de excitación) y posteriormente se mide la emisión a una longitud de onda denominada de ﬂuorescencia o emisión. Se puede comprobar experimentalmente que para concentraciones pequeñas de analito en una muestra, la energía radiante de la ﬂuorescencia (F) es proporcional a la energía radiante del haz de excitación absorbido por el medio, es decir, la intensidad de la luz ﬂuorescente es proporcional a la concentración de analito. Esta relación se aprovecha para análisis cuantitativo de especies que exhiban ﬂuorescencia. 𝐹 = 𝐾 × 𝐼0 × 𝑐 Donde: 𝐼0 es la intensidad de la radiación incidente, K es una constante y c la concentración de la especie ﬂuorescente (analito). Esta ecuación indica que, si se duplica la intensidad de la luz incidente se duplicará la intensidad de la luz emitida por la sustancia ﬂuorescente, lo que nos servirá para aumentar la sensibilidad hasta cierto punto. Esto no ocurre en el caso de la espectroscopia de absorción, ya que al aumentar la intensidad de la radiación incidente, no se produce un cambio en la absorbancia, ya que este valor es una relación de dos intensidades, la incidente (I0) y la transmitida una vez atravesada la muestra, (I). Un aumento de I0 supone un aumento inmediato en la intensidad transmitida I, manteniéndose constante el valor de la absorbancia. Existen una serie de factores que pueden afectar a la ﬂuorescencia: Inﬂuencia del disolvente: la eﬁcacia de la ﬂuorescencia aumenta si disminuye la viscosidad del disolvente. Inﬂuencia de la temperatura: la eﬁcacia de la ﬂuorescencia disminuye si aumenta la temperatura. Inﬂuencia del pH: la ﬂuorescencia de compuestos aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos en el anill

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