Guía de Prácticas 2024-2024 (Bioquímica Médica) PDF

NN UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO FACULTAD DE MEDICINA HUMANA PROGRAMA DE MEDICINA HUMANA BIOQUÍMICA MÉDICA DR. JUAN JORGE HUAMAN SAAVEDRA COORDINADOR DEL CURSO TEC. ANILU LILIANA MANTILLA BUENAÑO COLABORADORA...

NN UNIVERSIDAD PRIVADA ANTENOR ORREGO FACULTAD DE MEDICINA HUMANA PROGRAMA DE MEDICINA HUMANA BIOQUÍMICA MÉDICA DR. JUAN JORGE HUAMAN SAAVEDRA COORDINADOR DEL CURSO TEC. ANILU LILIANA MANTILLA BUENAÑO COLABORADORA 2024 20 2 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA INDICE 1. BIOSEGURIDAD....................................................................................... 6 2. CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR GRUPO DE RIESGO.......................................................................... 8 3. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD. MANEJO DE PRINCIPALES EQUIPOS DE LABORATORIO.........................................12 4. DETERMINACION DE LDH. INHIBICIÓN ENZIMATICA. UBICACIÓN DE CADENA RESPIRATORIA 15 5. EFECTOS DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN PROCESOS BIOENERGÉTICOS............................................................................... 22 6. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES....................................... 25 7. CUANTIFICACIÓN DE UREA Y CREATININA SÉRICA......................... 32 8. CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA, BILIRRUBINA Y ÁCIDO ÚRICO..................................................................................................... 36 9. CUANTIFICACIÓN DE BILIRRUBINA.................................................... 38 10. CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO................................................. 41 11. CUANTIFICACIÓN DE GLICEMIA........................................................ 44 12. DEMOSTRACIÓN EXPERIMENTAL DEL METABOLISMO DEL GLUCÓGENO EN EL HÍGADO.............................................................. 48 13. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA.......................................52 14. DETERMINACIÓN DEL PERFIL LIPÍDICO...........................................54 15. DETERMINACIÓN DEL HDL COLESTEROL....................................... 58 16. DETERMINACIÓN DEL LDL COLESTEROL........................................ 60 17. EVALUACIÓN ANTROPOMÉTRICA Y GASTO ENERGÉTICO DE UN ADULTO................................................................63 18. CUANTIFICACIÓN DE HIERRO SÉRICO............................................ 70 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 3 INTRODUCCIÓN La Guía de Prácticas de la experiencia curricular de Bioquímica Médica de la Escuela Profesional de Medicina Humana, Facultad de Medicina Humana de la Universidad Privada Antenor Orrego, 2024, actualizando la guía del 2018 de Bioquímica y Nutrición Humana que contó con la colaboración de la Tec. Paula Solano y la de 2022 y ahora solo de Bioquímica Médica ha sido elaborada para orientar a docentes, personal técnico y alumnos en el desarrollo de las diversas actividades de laboratorio en concordancia a las clases teóricas. Las actividades de prácticas de laboratorio están enmarcadas dentro del desarrollo de las competencias de la asignatura declarada en el syllabus: Aplican sus conocimientos sobre las característica y el metabolismo de las biomoléculas, describiendo e interpretando sus interrelaciones metabólicas, infiriendo algunas alteraciones bioquímicas y , desarrollando habilidades con actitud científica, responsabilidad y solidaridad en su equipo. Incluyen determinaciones enzimáticas como de LDH, transaminasas, de diversas biomoléculas como glucosa, colesterol, triglicéridos, HDL colesterol, LDL, urea, creatinina, hemoglobina, bilirrubina, proteínas totales, albúmina, calcio y fósforo de acuerdo a los temas desarrollados en las clases teóricas en las cuatro unidades. Asimismo fraccionamiento celular, inhibición enzimática, ubicación e ihibición de la cadena respiratoria. En las prácticas de laboratorio el estudiante además de aplicar los conocimientos teóricos, aprende el manejo de material y equipos en la resolución de problemas, el razonamiento científico en la interpretación de resultados, la redacción de informes científicos con uso adecuado de la bibliografía y a trabajar en equipo en un ambiente de exigencia y de cordialidad. Todas las actividades se desarrollan bajo el respeto a las normas de bioseguridad y de hecho la primera práctica desarrolla este aspecto. Esta guía será actualizada permanentemente con el apoyo de las autoridades académicas, del personal docente y técnico para cumplir cada vez mejor con su importancia en la formación científica y humana del estudiante de medicina. 4 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA CONTENIDO BIOQUÍMICA. ENZIMAS Y BIOENERGÉTICA 1.1. Medidas de Bioseguridad. Estructuración de equipos de trabajo. 1.2. Determinación de un marcador enzimático (LDH, CPK) 1.3. Inhibidores enzimáticos 1.4. Ubicación de cadena respiratoria 1.5. Inhibidores de cadena respiratoria UNIDAD II METABOLISMO DE LOS COMPUESTOS NITROGENADOS DE BAJO PESO MOLECULAR. NUTRICIÓN APLICADA. 2.1. Determinación de proteínas totales, albúmina y transaminasa séricas. 2.2. Cuantificación de urea y creatinina sérica. 2.3. Cuantificación de hemoglobina, bilirrubinas y ácido úrico en sangre. UNIDAD III METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS Y LÍPIDOS. 3.1. Cuantificación de glicemia. 3.2. Azúcares reductores en la orina 3.3. Demostración experimental de metabolismo de glucógeno hepático. 3.4. Prueba de tolerancia de glucosa. 3.5. Lipemia postprandfial 3.6. Determinación de perfil lipídico: 3.4.1 Determinación de Colesterol total 3.4.2 Determinación de Triglicéridos 3.4.3 Determinación de HDL colesterol 3.4.4 Determinación de LDL colesterol 3.7. -Determinación del índice de masa corporal, diámetro de la cintura y relación cintura – cadera (Antropometría) UNIDAD IV  GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 5 METABOLISMO DE AGUA Y SALES. COMUNICACIÓN CELULAR E INTEGRACIÓN METABÓLICA. 4.1. Cuantificación de calcio Cuantificación de hierro en suero sanguíneo 6 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA SEMANA N° 1 LABORATORIO N° 1 BIOSEGURIDAD DEFINICIÓN La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común para proteger la salud y la seguridad del personal de salud, frente a diferentes riesgos producidos por agentes biológicos. Complementariamente, se incluyen normas contra los riesgos producidos por agentes físicos, químicos y mecánicos. También se puede definir como el conjunto de normas, procedimientos, dispositivos a fin de controlar los factores de riesgo que se encuentran durante a la atención de un paciente. El laboratorio es un área de alto riesgo que requiere cumplimiento estricto de las normas de bioseguridad AGENTES DE RIESGO Agentes biológicos, transmitidos por ingestión, inhalación, inoculación y por contacto directo a través de piel o mucosas Agentes físicos y mecánicos: temperaturas extremas, radiaciones ionizantes, contactos eléctricos o conexiones defectuosas, y vidrios resquebrajados de recipientes dañados o tubos rotos Agentes químicos: corrosivos, tóxicos (vías de exposición), carcinogénicos, inflamables, explosivos CONTENCIÓN Métodos seguros para el manejo de agentes infecciosos en el laboratorio Técnicas de procesamiento de muestras Equipos de seguridad Diseño del edificio Reducir la exposición del personal - Contención Primaria Protección del personal y del medio ambiente inmediato contra la exposición a agentes infecciosos y/o productos químicos de riesgo técnicas, equipo de seguridad y vacunas. - Contención Secundaria Protección del medio ambiente externo contra la exposición de material infeccioso: edificio y prácticas. GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 7 RUTAS DE INFECCIÓN Ingestión: pipeteo con la boca, salpicadura de material infeccioso en la boca, dedos o artículos contaminados colocados en la boca, consumo de alimentos en el lugar de trabajo. Inhalación de aerosoles. Inoculación: accidentes por pinchazos, lesiones con objetos cortantes, picaduras de insectos, mordeduras de animales y rascado. Contaminación de la piel o mucosas: derramamientos o salpicaduras en la piel intacta o no intacto, derramamientos o salpicaduras en los ojos, boca, nariz. Mordedura o arañazo de animales. Picadura de insectos. FORMAS DE TRANSMISIÓN DE LA ENFERMEDAD Contacto directo. Contacto indirecto. Vehículo común. Vector. TIPOS DE LESIONES O DAÑOS Cortaduras. Quemaduras. Micro traumas. Envenenamientos. Intoxicaciones. FACTORES AMBIENTALES Ventilación. Tipo de equipo. Procedimientos riesgosos. Control ambiental. Hacinamiento. FACTORES BIOLÓGICOS Patogenicidad del microorganismo. Dosis infectante. Rutas de infección. Susceptibilidad del hospedero. Reacciones alérgicas 8 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR GRUPO DE RIESGO Esta clasificación solo se aplica al laboratorio: Grupo de Riesgo I: escaso riesgo individual y comunal. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales Ej: Bacillus cereus, Naegleria, protozoarios y helmintos intestinales Grupo de Riesgo II: riesgo individual moderado, pero limitado para la sociedad. Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado. Ej: Bartonella, Clostridium, Entamoeba histolytica, E.coli enteropatógena, Pseudomona, Salmonella, Virus de la Hepatitis B. Grupo de Riesgo III: riesgo individual elevado, pero limitado para la comunidad. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces Ej: Brucella, Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, Tripanozoma cruzi, Yersinia pestis, Taenia solium. Grupo de Riesgo IV: alto riesgo para los individuos y para la comunidad. Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente, no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces. Ej: HIV, Dengue, Clasificación de los laboratorios de acuerdo a los niveles de bioseguridad (OMS) - Los laboratorios se clasifican como sigue: Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 1 Laboratorio básico – nivel de bioseguridad 2 Laboratorio de contención – nivel de bioseguridad 3 Laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4. Las designaciones del nivel de bioseguridad se basan en una combinación de las características: GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 9 De diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos De operación, necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo. Para una mejor comprensión mostramos el siguiente cuadro: 10 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA INFECCIONES ESPECÍFICAS EN EL LABORATORIO De los estudios realizados en diferentes países, las infecciones bacterianas en el laboratorio más comúnmente reportadas son: La brucelosis, tuberculosis, salmonelosis, shigelosis y sífilis. Las infecciones virales más frecuentemente adquiridas en el laboratorio: Hepatitis B, C, HIV. El riesgo de un pinchazo para el HIV es de 0.4 %, para hepatitis B 6-30 %, 2-10 % para la hepatitis C. CONCEPTOS - Limpieza: es el proceso físico por el cual se elimina de los objetos en uso, las materias orgánicas y otros elementos sucios, mediante el lavado con agua con o sin detergente (eliminación por arrastre). - Desinfección: es un proceso que compromete medidas intermedias entre limpieza y esterilización. Se efectúa mediante procedimientos en que se utilizan principalmente agentes químicos en estado líquido, la pasteurización a 75°C y la irradiación ultravioleta. - Esterilización: es un proceso que tiene por objeto la destrucción de toda forma de vida. En los laboratorios se realiza preferentemente por medio del vapor saturado a presión (autoclave), por calor seco (horno). - Antisépticos: Se definen como agentes germicidas, para ser usados sobre la piel y los tejidos vivos a diferencia de los desinfectantes que se utilizan sobre objetos inanimados. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD DEL AMBIENTE: - Ventilación - Iluminación - Cámaras de bioseguridad - Luz ultravioleta - Mesas de trabajo con superficie sólida lavables - Paredes y pisos lavables - Eliminación por desagüe previa desinfección o esterilización - Tránsito limitado por áreas de riesgo - Uso de extinguidores - Señal de riesgo biológico GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 11 DEL PERSONAL: - Examen médico periódico (semestral) - Exámenes de laboratorio: evaluación de probable daño (marcadores virales de Hepatitis B, C, HIV, VDRL, hemoglobina, etc.) - Inmunización para la Hepatitis B - Vestido: mandil con mangas largas - Zapatos cerrados, antideslizantes - Uso de guantes, mascarillas, lentes según la ocasión - Pelo recogido. EN MANEJO DE MUESTRAS BIOLÓGICAS: - Considerarlas altamente infecciosas - Uso de mascarillas y guantes - Cuidado con jeringas o tubos al vacío, evitando generar aerosoles - No volver a tapar las agujas con el capuchón - No comer ni beber en áreas de trabajo - Lavarse las manos - Limpieza de equipos - Evitar sonidos fuertes MANEJO DE RESIDUOS: - Segregación adecuada y recolección en bolsas negras (basura común, administrativa), rojas (residuos biocontaminados) y amarillas (medicamentos, reactivos). - Tratamiento: existen tres procedimientos aceptados, que son la esterilización, la incineración y el enterrado a 50 m de profundidad. Tomado de: Jorge Huamán Saavedra. Laboratorio Clínico. Procedimientos e Interpretación, 2 ed 2018 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: - Ministerio de Salud del Perú. Instituto Nacional de Salud. Bioseguridad en laboratorios de ensayo, biomédico y clínicos. Serie de Normas Técnicas N°18. Lima, Perú, 2005. - OMS Manual de Bioseguridad en el laboratorio clínico, Ginebra 2005. - INS Chile. Guía de Bioseguridad para los laboratorios clínicos. Santiago de Chile 2013 - OMS-CDC.Clinical and Laboratory Standards Institute. Laboratory Quality Management Systems.France, 2011. 12 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA LABORATORIO N° 1 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD. MANEJO DE PRINCIPALES EQUIPOS DE LABORATORIO 1. BIOSEGURIDAD Introducción. La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido común para proteger la salud y la seguridad del personal de salud, frente a diferentes riesgos producidos principalmente por agentes biológicos y también físicos, químicos y mecánicos. El laboratorio es un área de alto riesgo que requiere cumplimiento estricto de las normas de bioseguridad. Procedimiento 1. Los estudiantes por grupos revisarán una nota técnica sobre bioseguridad que se les hará entrega.1. Además, darán lectura al Manual de Seguridad para Laboratorio de Bioquímica. Escuela profesional de Medicina Humana2 2. Harán una discusión bajo la guía del docente sobre los principales aspectos de la nota técnica, contestando el cuestionario siguiente 1. ¿Qué es bioseguridad? 2. ¿Cuáles son los principales agentes de riesgo? 3. ¿Qué es contención? 4. ¿Cuáles son las principales formas de trasmisión de las enfermedades en el laboratorio? 5. ¿Cómo se clasifican los microorganismos implicados en la trasmisión de infecciones? 6. ¿Cómo se clasifican los laboratorios de acuerdo a s u bioseguridad? 7. ¿Cuáles son las normas de bioseguridad específicas del laboratorio? 8. ¿Cómo se deben seleccionar y desechar los residuos biológicos? 9. ¿Qué barreras de protección deben usar los estudiantes y en qué casos? 3. Elaborarán un informe personal que se entregará al docente GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 13 2. PROCEDIMIENTOS PARA MANEJO DE EQUIPOS Y MATERIAL DE LABORATORIO 1. Introducción En el laboratorio de Bioquímica se requiere el manejo de diversos equipos para la realización de las prácticas y exámenes bioquímicos. Es importante que el estudiante de medicina conozca los aspectos básicos de su empleo y el procedimiento para su uso adecuado, para obtener buenos resultados y a la vez para evitar riesgos. 2. Procedimiento 2.1. El docente mostrará a los alumnos los principales equipos con los protocolos de su funcionamiento: centrífuga, baño maría, micropipeta, espectrofotómetro, balanza. 2.2. El docente hará las recomendaciones sobre el manejo del material de vidrio: pipetas, tubo, etc. 3. Informe. El estudiante hará un informe sobre los procedimientos para manejo de equipo 3. El alumno firmará un documento que ha recibido la capacitación en Bioseguridad y manejo de equipo Referencias 1. Huamán-Saavedra J. Laboratorio Clínico. Procedimientos e interpretación, 2 da edición, Editorial Universitaria UNT, Trujillo, 2018 2. UPAO. Manual de Seguridad para Laboratorio de Bioquímica. Escuela profesional de Medicina Humana. 2021 14 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA SEMANA N° 2 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 15 LABORATORIO N° 2 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. APLICACIÓN EN MEDICINA DESHIDROGENASA LACTICA (LDH) Enzima responsable de la conversión del piruvato a lactato empleando NADH. Enzima citosólica. Distribución: amplia. Hígado, músculo, corazón. Isoenzimas por subunidades H y M. Determinación: colorimétrica o cinética. Al alcance de cualquier laboratorio de mediana complejidad. Existen métodos automatizados. Valores normales: depende de metodología Inicio de elevación en Infarto de miocardio agudo: 12 a 24 horas. Pico: 2-3 días. Duración: 8-10 días. Empleo: diagnóstico tardío. También se usa en líquidos serosos como el pleural para diferenciar exudado de trasudado cuando LDH de líquido/ LDH suero >0.6 ó LDH del líquido pleural >2/3 parte del valor normal del LDH sérico. FUNDAMENTO DEL MÉTODO Piruvato + NADH+ H+ Lactato + NAD+ La conversión del NADH a NAD+ se mide a 340 nm REACTIVOS A.-REACTIVO A: NADH B: REACTIVO B: Buffer tris y piruvato pH 7.2 Se mezcla 4 partes de A y 1 parte de B para el reactivo final y se obtiene reactivo de trabajo MUESTRA Suero obtenido de sangre venosa, con el procedimiento establecido. Dejar coagular y centrifugar a 3500 rpm por 15 minutos. Se separa el suero. 16 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA VALORES DE REFERENCIA: Cálculo de los resultados LDH (U/I) =Absorbancia/min x factor INTERPRETE LOS RESULTADOS. CUESTIONARIO 1. ¿A qué vía pertenece la LDH? 2. ¿Qué son isoenzimas? 3. ¿Cuáles son las isoenzimas de la LDH y cuál es su distribución en los tejidos? ¿Cuál isoenzima predomina en el corazón? 4. ¿Qué factores que afectan la actividad de la enzima determinada en el laboratorio? 5. ¿Cuáles son las principales aplicaciones de la LDH en el diagnóstico médico? REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Harper, Bioquímica ilustrada, 30 edición, 2016. 2. Vademecum Wiener Lab, Rosario, Argentina. 3. Huamán-Saavedra J. Laboratorio Clínico. Procedimientos e interpretación, 2 da edición, Editorial Universitaria UNT, Trujillo, 2018  GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 17 INHIBICION ENZIMÁTICA INTRODUCCIÓN Las enzimas puede sufrir la acción de inhibidores que afectan su actividad sea en su velocidad máxima como en su Km. Los inhibidores pueden ser fisiológicos o productos químicos de medicamentos o productos naturales. En general la inhibición puede ser reversible o irreversible. En la primera el efecto inhibitorio puede ser competitivo, no competitivo o acompetitivo. El clásico inhibidor competitivo es el malonato de sodio que afecta a la Succinatyo deshidrogenasa del Complejo II de la cadena respiratoria; se parece al sustrato que es el succinato y compite con él por unirse al centro activo. En la inhibición competitiva aumenta el Km pero se mantiene la velocidad máxima(Vmax). En la inhibición no competitiva disminuye la Vmax sin afectar el Km y en la acompetitiva disminuyen tanto la Vmax como el Km.. En la inhibición irreversible existe unión del inhibidor en forma covalente al sitio activo o la acción de metales pesados como el mercurio que se une a grupos funcionales.cci FUNDAMENTO En la práctica se van a estudiar como modelo de inhibición competitiva la acción del malonato sobre la succinato deshidrogenasa presente en el homogenizado del hígado y la. inhibición irrersible del bicloruror de mercurio. REACTIVOS Y EQUIPOS  Buffer fosfato de sodio 0,1 M pH 7,2  Succinato de sodio 0,1 M  Succinato de sodio 0,5 M  Malonato de sodio 0,1 M  Bicloruro de mercurio 0,1m  Azul de metileno 0,001 %  Homogenizado de hígado al 10 % en KCl 0,154M: 10 gr de hígado en 100 ml. En el homogenizado eléctrico 3000 rpm x 2 minutos  Homogenizador eléctrico  Centrìfuga refrgerasa  18 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA PROCEDIMIENTO Armar el siguiente sistema Reactivo Tubo Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 1 5 Buffer fosfato 0,1 M pH 2 ml 1,8 1,3 1,3 1,0 7,2 Succinato de sodio 0,1M ------ 0,2 0,2 0,2 ----- Succinato de sodio 0,5M ----- 0,5 Malonato de sodio 0,1M ------ --- 0,5 Bicloruro de mercurio 0,5 0,1M Azul de metileno 1 1 1 1 1 Homogenizado de 1 1 1 1 1 hígado al 10 % Dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente Observar cambio de color Interpretar los cambios CUESTIONARIO 1. ¿Cómo se evidencia la actividad de las succinato deshidrogenasa? 2. ¿Cuál es el efecto del malonato de sodio? 3. ¿El efecto del malonato es reversible? 4. ¿Cómo actúa el mercurio? 5. ¿Cuál es el rol del azul de metileno?  GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 19 FRACCIONAMIENTO CELULAR.UBICACIÓN DE LA CADENA RESPIRATORIA INTRODUCCION El fraccionamiento celular es muy importante para obtener las diferentes organelas de las células: núcleos, mitocondrias, microsomas y el citosol. El homogenizado se centrifuga inicialmente a 800 rpm y se obtienen los núcleos en el sedimento. El sobrenadante se centrifuga a 15000 rpm y se obtienen las mitocondrias en el sedimento y en el sobrebadante microsomas y citosol.. La cadena respiratoria se ubica en la membrana interna de la mitocondria y por la fosforilación oxidativa la energioa liberada se utiliza para la síntesis de ATP. FUNDAMENTO El objetivo de la práctica es realizar el fraccinamiento celular y haciendo uso del complejo 2 , el susccinato como sustrato y el azul de metileno como indicador., así como la p-fenilendiamina demostrar la presencia la cadena respiratoria en la miocondria.. El azul de metileno es indicador de reducción y se decolora. La p-fenilendiamina cede electrones al citocromo C y se oxida cambiando de color a marrón oscuro MATERIAL Y EQUIPOS  Buffer fosfato 0,1 M Ph 7,4  Azul de metileno  Succinato 0,1M  p-fenilendiamina 1 %  Homogenizado de hígado de cuy al 10%  Fracción nuclear  Fracción mitocondrial  Fracción microsomal y citosol  KCl 0,154 M  Homogenizador eléctrico  Centrìfuga refrigerada PROCEDIMIENTO 1. Realizar el fraccionamiento celular: a. Extraer el hígado de cuy y colocarlo en un Petri. Eliminar la 20 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA cápsula y otros tejidos b. Pesar 10 g de hígado , cortar en pequeños fragmentos y colocar en un vaso plástico conteniendo 50 ml de KCl 0,1454 M. Se lleva al homogenizador eléctrico por 2 minutos a 3500 rpm. Vaciar el contenido en un vaso de vidrio..Completar a 100 ml. Este es el homogenizado total c. Centrifugar el homogenizado a 800 revoluciones ´por minuto por 10 minutos en un tubo de polietilen, hacer uso de la centrífuga refrigerada d. El sedimento es la fracción nuclear e. Centrifugar el sobrenadante a 15000 rpm. por 15 minutos. f. El sedimento son las mitocondrias. El sobrenadante final son los microsomas y citosol. g. Vaciar el sobrenadante a un vaso. Recuperar el sedimento haciendo uso de una micropipeta y vaciarla a un tubo de vidrio 2. Preparar el sistema 1: Material Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 Buffer fosfato 0,1M pH 1 0,5 0,5 0,5 0,5 7,4 Azul de metileno 1 1 1 1 1 Succinato de sodio 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,1M Fracción nuclear ----- 0,5 ----- -- -- Fracción mitocondrial -- ----- 0,5 --- --- Fracción microsomal --- ---- ----- 0,5 ---- soluble Homogenizado total ----- ---- ------ ------ 0,5 Mezclar y dejar en reposo por 15 minutos a temperatura ambiente Observar los cambios de color Interpretar los resultados 3. Preparar el sistema 2 Material Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 Buffer fosfato 0,1M pH 1,5 1,0 1,0 1,0 1,0 7,4 p-fenilendiamina 1 % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Fracción nuclear ---- 0,5 --- --- --- GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 21 Fracción mitocondrial ---- ---- 0,5 ----- --- Fracción microsomal ---- --- ----- 0,5 ---- soluble Homogenizado total ---- ---- ------ ------- 0,5 Mezclar y dejar en reposo por 15minutos a temperatura ambiente Observar el cambio de color Interpretar CUESTIONARIO 1. Interprete los resultados 2. ¿Cuál es el rol del azul de metileno? 3. ¿Cuál es el rol de la p-fenilendiamina? 4. Haga un esquema del procedimiento de centrifugaciòn diferencial 22 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA MÉDICA SEMANA N° 3 LABORATORIO N° 3 EFECTOS DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN PROCESOS BIOENERGÉTICOS (COBAYOS) EXPERIMENTO 1. CADENA RESPIRATORIA EN MÚSCULO DE COBAYO A. Obtención del cofactor NAD+ 1. Ponga a hervir 20 ml de agua destilada en un vaso de precipitación 2. Sacrificar un cobayo 3. Extraer enseguida los músculos de las patas y colocar en un vaso 5 a 10 minutos 4. Enfriar y colocar todo el volumen en un vaso plástico de 50 ml en el homogenizador eléctrico por 2 minutos a 3500 5. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos 6. Separar el sobrenadante que contiene los cofactores y colocar en un recipiente con hielo B. Obtención de enzima Lactato Deshidrogenasa y componentes de la cadena respiratoria 1. Extraer el hígado del cobayo sacrificado, pesar 2.g y colocarlo en un vaso plástico de 50 ml conteniendo 20 ml de suero fisiológico. 2. Llevar el vaso al homogenizador eléctirco por 2 minutos a 3500 rpm 3. Centrifugar a 3500 rpm por 5 minutos 4. Separar el sobrenadante que contiene la enzima en un tubo y dejarlo incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. El sedimento resuspenderlo con 2 ml de suero fisiológico y obtener los núcleos. 5. Conservar la preparación en un recipiente con hielo. Marcar el tubo con E 6. Para utilizar la enzima E diluirla con buffer fosfato pH 7.2 a razón de 1 ml de E por 4 ml de buffer 7. Con 2 ml, sin diluir de E, usando la centrífuga refrigerada centrifugar a 9000 rpm por 15 minutos, eliminar el sobrenadante, el sedimento GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 23 son las mitocondrias. 8. Armar el siguiente sistema:  22 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA Ml Incubar a 37°C por 15 minutos 9. Observar los cambios en las coloraciones. GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 23 EXPERIMENTO 2. ACCIÓN DE INHIBIDORES ENZIMÁTICOS EN LA RESPIRACIÓN CELULAR 1. Separe el corazón de un cobayo y córtelo en pequeños trozos y colóquelos en un mortero 2. Agregue aproximadamente 2 gramos de arena y 5 ml de buffer fosfato pH 7.0 y homogenícelo hasta obtener una pasta fina y agregue otros 5 ml de buffer fosfato pH 7.0 3. Incube esta mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos, removiéndola con un agitador cada 2 a 3 minutos 4. Separe el sobrenadante por centrifugación a 3000 rpm por 2 minutos y consérvelo en un tubo sumergido en hielo. Rotular como PC (preparado de corazón) 5. Armar el siguiente sistema: 6. Mezclar los tubos. Añadir 1 ml de aceite mineral, suavemente por las paredes 7. Incubar a 37 °C por 30 minutos. 8. Observar los cambios de color. 24 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA CUESTIONARIO 1. Haga un esquema de la cadena respiratoria con todos los complejos 2. ¿Cómo explica los resultados en el núcleo y en las mitocondrias? 3. ¿Cómo actúa la coenzima? 4. En el esquema de la cadena respiratoria señale el lugar de acción de los inhibidores 5. Si se usa el succinato, ¿qué complejo de la cadena respiratoria está participando? 6. ¿Cómo actúa el malonato? 7. Explique la acción del bicloruro de mercurio 8. ¿A qué nivel actúa el cianuro? 9. ¿Cuál es el rol del azul de metileno? Experimentos de práctica: adaptados de copias de Bioquímica de los Drs. Lezama P y Obeso W. 2015. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. RodwelL V, Bender D, Botham K, Kennelly P, WEIL, P. Harper. Bioquímica Ilustrada 2016  GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 25 EXPERIMENTO 3. : EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA CADENA RESPIRATORIA INTRODUCCIÒN Los inhibidores de la cadena respiratoria actúan a diversos niveles y por ello se clasifican : 1. Inhibidores del complejo 1 : rotenona, piericidina 2. Inhibidores del compejo 2: malonato 3. Inhibidores del complejo 3: antimicina, barbiturato de sodio 4. Inhibidores del complejo 4: cianuro, azida, monóxido de carbono, cianuro Utilizando como sustrato el malato los electrones ingresan por el complejo 1. La actividad del mismo se determina por reducción del azul de metileno (o de 2,6 -diclorfenol indofenol si se usara) evidenciado por su decoloración. Si se inhibe este sitio por la rotenona no ocurrirá la decoloración. Por otro la p-fenilendiamina cede electrones al citocromo C y se oxida adquiriendo color marròn oscuro, si se inhibiera el complejo IV este efecto se va a bloquear y mantendría su color. El objetivo del experimento es demostrar el lugar de acción de los inhibidores usando indicadores. MATERIAL Y REACTIVOS  Buffer fosfato de sodio 0,1m pH 7,4  Azul de metileno  p-fenilendiamina 1 5  Malato de sodio 0,1 M  Rotenona 0,1 M  Barbiturato de sodio 0,1 M  Azida de sodio  KCL 0,154 M  Homogenizado de hígado de cuy al 10 %: preparado como se ha señalado anteriormente con homogenizador eléctrico y usando KCL 0,154 M PROCEDIMIENTO 1. Armar el sistema 1: 26 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA Material y reactivos Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 6 Buffer fosfato 0,1 M pH 7,4 1,2 1,5 1,0 0,5 0,5 0,5 Azul de metileno 1 1 1 1 1 1 Malato 0,1 M --- 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Rotenona 0,1 M ---- ---- ------- 0,5 ---- -- Barbiturato de sodio 0,1 M -- ----- --- -- 0,5 Azida de sodio 0,5 Homogenizado de hìgado 0,5 ---- 0,5 0,5 0,5 0,5 Mezclar y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente Observar los cambios de color Interpretar los resultados 2. Armar el sistema 2: Material y reactivos Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 1 2 3 4 5 Buffer fosfato 0,1 M pH 7,4 2,0 1,5 1,0 1,0 1,0 Azida de sodio 0,1 M -- ---- 0,5 --- ---- Barbiturato de sodio 0,1 M --- ------ ----- 0,5 ----- Rotenona 0,1 M ---- ----- ---- ----- 0,5 p-fenilendiamina 1% 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Homogenizado de hígado al 10 ----- 0,5 0,5 0,5 0,5 % Mezclar y deja en reposo 20 minutos a temperatura ambiente Observar los cambios de color Interpretar CUESTIONARIO 1. En un esquema de la cadena respiratoria ubicar la acción de los inhibidores 2. ¿Cuàl es la función del azul de metileno en este experimento? 3. ¿Còmo explica los cambios de color en el azul de metileno? 4. ¿Còmo explica los cambios de color en la p-fenilendiamina? GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 27 SEMANA N° 4 LABORATORIO N° 4 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES INTRODUCCIÓN Las proteínas son macromoléculas, cuyas unidades estructurales son los aminoácidos unidos por enlaces peptídico. Participan en las estructuras y diversidad de funciones como transporte, hormonal, etc. Las proteínas séricas totales comprenden la albúmina y las globulinas, que pueden ser alfa1, alfa 2, beta 1, beta 2 y gammaglobulinas al separarlas por electroforesis. Son sintetizadas en el hígado con excepción de las inmunoglobulinas. La albúmina es la principal proteína sérica. Las proteínas séricas totales pueden disminuir (hipoproteinemia) generalmente secundarias a hipoalbuminemia o aumentar (hiperproteinemia) generalmente por aumento de las globulinas. Las globulinas aumentan en procesos inflamatorios, infecciosos., en las hepatitis crónicas y cirrosis. En la cirrosis se tiene la inversión de la relación albúmina/globulina. La inmunoglobulina IgG. aumenta en la hepatitis autoinmune, la IgM en la cirrosis biliar y la IgA en la enfermedad hepática alcohólica. Las gammaglobulinas pueden aumentar en forma policlonal como en la cirrosis o monoclonal como en el mieloma múltiples. FUNDAMENTO Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra. REACTIVOS Reactivo A: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en hidróxido de sodio 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP). S. Standard (Suero Patrón): solución de albúmina y globulinas de origen bovino, con título conocido de proteínas y albúmina. 28 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA MUESTRA: Suero GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 29 PROCEDIMIENTO Armar el siguiente sistema: Mezclar Incubar a 37 °C por 15 min. Leer a 540 nm llevando a cero con el blanco el D y S CÁLCULO: D x factor FACTOR: PT del S (g/dl ) Abs S VALORES DE REFERENCIA: 6.1 a 7.9 g/dl CUESTIONARIO 1. ¿En qué se diferencia el suero del plasma? ¿Cómo se obtienen? 2. ¿Cuáles son las proteínas plasmáticas? 3. ¿Qué proteínas son alfa2 globulinas? 4. ¿Qué proteínas son beta globulinas? 5. ¿Qué tipo de gammaglobulinas conoce? 6. Señale cinco enfermedades pueden causar hipoproteinemia. 7. Señale cinco enfermedades que ´pueden causar hipeproteinemia. 30 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA 1. INTRODUCCIÓN La albúmina es la principal proteína del plasma, mantiene la presión coloidosmótica del plasma, transporta bilirrubina, calcio, ácidos grasos y otras sustancias. La hipoalbuminemia puede deberse a defectos de síntesis (hepatitis crónica, cirrosis), a menor aporte (desnutrición, kwashiorkor), proteinuria o pérdida intestinal. 2. FUNDAMENTO La albúmina reacciona con la forma aniónica del 3,3',5,5’ tetra bromosulfon cresol ftaleína con aumento de la absorbancia a 625 nm 3. REACTIVOS Reactivo B: solución de 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfon ftaleína (en polioxietilén lauril éter S. Standard (Suero Patrón): solución de albúmina y globulinas de origen bovino, con título conocido de proteínas y albúmina 4. MUESTRA: SUERO 5. PROCEDIMIENTO Armar el siguiente sistema: Mezclar e Incubar a temperatura ambiente (15 a 28 °C) por 15 minutos. Leer a 625 nm llevando a cero con el blanco reactivo. Leer dentro de los 20 minutos CÁLCULO: D X F F= Alb del S (g/dl) Abs S 6. VALORES DE REFERENCIA 3.5-4.8 g/dl CUESTIONARIO 1. ¿En qué patologías se produce hipoalbuminemia? 2. ¿En qué casos se produce hiperalbuminemia? 3. ¿Cuál es la relación entre los niveles de albúmina y grados de desnutrición? GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 31 DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS TRANSAMINASA GLUTÁMICO PIRÚVICA O ALANINA AMINOTRANSFERASA (GPT) 1. INTRODUCCIÓN Alanina aminotransferasa (ALT) o Transaminasa Glutámico Pirúvica o GPT, exclusivamente citoplasmática y su determinación es usada principalmente para evaluar daño hepático. También presente en el tejido muscular. La otra transaminasa empleada es la Transaminasa Glutámico Oxalacética ó GOT o aspartato aminotransferasa Aumento: - Hepatitis aguda, GPT>GOT, generalmente >500 U/l. - Hepatitis crónica: GPT 2, sugestivo. - Ictericia obstructiva: discreto aumento. Otras causas: daño muscular,igualmente la hemólisis 2. FUNDAMENTO GPT L-alanina + α-cetoglutarato L-glutamato + piruvato LDH Piruvato + NADH + H+ L-lactato +NAD+ La actividad se mide finalmente como LDH 3. REACTIVOS Reactivo A: solución de buffer Tris pH 7,5 conteniendo alanina Reactivo B: solución conteniendo 2-oxoglutarato, nicotinamida dinucleótido reducido (NADH) y lactato deshidrogenasa (LDH) Reactivo único: mezclar 4 partes de Reactivo A con 1 parte de Reactivo B. Contiene: Tris 100 mmol/l; pH 7,5. L-alanina: 500 mmol/l , NADH 0,18 mmol/l , LDH >=1,5 U/l y α-cetoglutarato 15 mmol/l 4. MUESTRA: suero 32 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 5. PROCEDIMIENTO: En un tubo colocar 1.0 ml de reactivo único. Preincubar 3 minutos a 37°C. Agregar suero 100 ul Mezclar inmediatamente y aspirar en el espectrofotómetro, leyendo en la ventana de LDH. El equipo da la actividad en U/l. Se puede controlar midiendo la diferencia entre la absorbancia inicial y la final, dividiendo entre el tiempo transcurrido. La diferencia se multiplica por el factor 8095 Dividir el resultado entre 5 6. VALORES DE REFERENCIA Varones: hasta 41 U/l Mujeres: hasta 31 U/l TRANSAMINASA GLUTÁMICO OXALACÉTICA O ASPARTATO AMINOTRANSFERASA (GOT) 1. INTRODUCCIÓN. Aspartato amino transferasa (AST) o Transaminasa Glutámico Oxalacética o GOT, es una enzima citoplasmática y mitocondrial presente en los hepatocitos, pero también en las células de otros tejidos como corazón, músculo esquelético y riñón. Se emplea en el diagnóstico de hepatitis aguda igual que la TGP. En hepatitis alcohólica y cirrosis la relación GOT/GPT se invierte 2. FUNDAMENTO GOT L-aspartato + α-cetoglutarato L- glutamato + oxalacetato MDH Oxalacetato + NADH + H+ L- Malato + NAD MDH: Malato Deshidrogenasa GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 33 3. REACTIVOS Reactivo A: solución de buffer TRIS pH 7,8 conteniendo L-aspartato Reactivo B: solución conteniendo α-cetoglutarato, nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), malato deshidrogenasa (MDH) y lactato deshidrogenasa (LDH) Reactivo único: mezclar 4 partes de Reactivo A y 1 parte de Reactivo B. Contenido 4. MUESTRA: suero 5. PROCEDIMIENTO En un tubo colocar 1.0 ml de reactivo único. Preincubar 3 minutos a 37°C. Agregar suero 100 ul Mezclar inmediatamente y aspirar en el espectrofotómetro, leyendo en la ventana de LDH. El equipo da la actividad en U/l. Se puede controlar midiendo la diferencia entre la absorbancia inicial y la final, dividiendo entre el tiempo transcurrido. La diferencia se multiplica por el factor 8095 Dividir el resultado entre 5 6. VALORES DE REFERENCIA Varones. hasta 38 U/l Mujeres: hasta 32 U/l CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el rol de la transaminación en el metabolismo nitrogenado? 2. ¿Cuál es el rol del piridoxal fosfato en la transaminación? 3. ¿Cuál es la utilidad de las transaminasas en el diagnóstico? 34 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Harper, Bioquímica Ilustrada, 30 ed, 2016 2. Vademécum Wiener Lab, Rosario, Argentina 3. Harrison, Medicina Interna, 19 edición, 2016 4. Huamán-Saavedra J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretación, 2 edición Edit. Universitaria. Trujillo, 2018 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 35 SEMANA N° 5 LABORATORIO N° 5 CUANTIFICACIÓN DE UREA Y CREATININA SÉRICA CUANTIFICACIÓN DE UREA 1. INTRODUCCIÓN La urea es el producto final del catabolismo de las proteínas. Es producido en el hígado y es excretado por los riñones. Es filtrada pero su reabsorción en los túbulos renales es dependiente de la velocidad de flujo urinario. Se emplea con la creatinina para evaluar la función renal. Sin embargo, puede elevarse por una dieta rica en proteínas, por aumento del catabolismo proteico y en casos de una hemorragia digestiva (aumento de la liberación de amoníaco en el intestino). 2. FUNDAMENTO La ureasa descompone específicamente la urea produciendo dióxido de carbono y amoníaco. Este reacciona en medio alcalino con salicilato e hipoclorito para dar indofenol color verde que se determina colorimétricamente a 570 nm. 3. REACTIVOS Reactivo A: Nitroprusiato de sodio y ácido salicílico. Reactivo B: Hipoclorito de sodio en hidróxido de sodio. Reactivo C: Ureasa Reactivo A+C: Cada 100 ml de Reactivo A +4ml de reactivo C (estable 20 días a 4°C Pueden prepararse otras cantidades mientras se respete la proporción indicada. 4. MUESTRA: suero, plasma, orina 5. PROCEDIMIENTO Armar el siguiente sistema: 36 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA Mezclar. Incubar 5 minutos a 37° C Luego agregar: Reactivo B 1 ml 1 ml 1ml Leer en el espectrofotómetro a 570 nm. CÁLCULOS Suero o plasma F = 60 mg/dl S Urea mg/dl = D x factor 6. VALORES DE REFERENCIA: 10 a 50 mg/dl CUESTIONARIO 1. Haga un esquema sobre la síntesis de la urea 2. ¿Cómo afecta la dieta rica en proteína la concentración de urea en sangre? 3. ¿Qué ocurre en una hemorragia digestiva con los niveles de urea ¿ 4. ¿En qué enfermedades aumenta la urea en sangre? 5. ¿Cuáles son las principales alteraciones del ciclo de la urea? 6. ¿Qué relación tiene el aumento de la urea con el de la creatinina? GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 37 CUANTIFICACIÓN DE CREATININA EN SANGRE 1. INTRODUCCIÓN La creatinina es el producto de la degradación de la creatina y su producción diaria es función de la masa muscular. La creatinina se forma en una vía en la que participan los aminoácidos glicina, arginina y metionina, y los tejidos renal y hepático. Su eliminación es renal y casi exclusivamente por filtración (existe una pequeña secreción por túbulo proximal). La depuración de la creatinina se usa como medida de filtración glomerular. 2. FUNDAMENTO La creatinina reacciona con el picrato alcalino (Reacción de Jaffé) produciendo un cromógeno rojo. Las otras sustancias que no son creatinina reaccionan en los primeros 30 segundos, de modo que partir de ese tiempo la diferencia de absorbancia por método cinético (dos lecturas) es proporcional a la concentración de creatinina 3. REACTIVOS Reactivo de trabajo: mezcla de 4 partes de reactivo A (ácido pícrico 12.7 mmol/l) y 1 de reactivo B (hidróxido de sodio 970 mmol/l). 4. MUESTRA: suero, orina 5. PROCEDIMIENTO Armar el siguiente sistema: Trabajar cada tubo de la siguiente manera. Una vez añadido el standard o la muestra, mezclar rápidamente y leer en el espectrofotómetro a 505 nm por método cinético. 38 GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 6. VALORES DE REFERENCIA VARONES: 0.7 a 1.3 mg/dl MUJERES: de 0.6 a 1.1. mg/dl CUESTIONARIO 1. ¿Qué órganos y que intermediarios metabólicos participan en la síntesis de la creatinina? 2. ¿Qué relación guarda la creatinina con la masa muscular? 3. ¿Cuáles son las enfermedades en que aumenta la creatinina? 4. ¿Tiene la misma importancia la determinación de creatinina y urea? 5. ¿Qué es la insuficiencia renal prerrenal, renal y postrenal? 6. ¿Qué es la depuración de creatinina, cómo se realiza y cuáles son sus indicaciones? 7. ¿Cómo influye la dieta en el nivel de creatinina sérica? 8. ¿Cuál es la importancia de la creatina? 9. ¿Qué importancia tiene la creatinina en la evaluación nutricional? GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y NUTRICIÓN HUMANA 39 SEMANA N° 6 LABORATORIO N° 6 CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA, BILIRRUBINA Y ÁCIDO ÚRICO CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINA 1. INTRODUCCIÓN La hemoglobina es la molécula que transporta el oxígeno de los pulmones a los tejidos y se encuentra en los hematíes, formados en la médula ósea. Está formada por cuatro subunidades, en el adulto dos alfa y dos beta. Cada subunidad está formada por una cadena de globina que tiene un núcleo heme con Fe ++. La disminución de hemoglobina constituye la anemia. La OMS ha establecido como criterio de anemia