Mtodos de Cuantificacin de Metabolitos 2024 - Universidad Nacional de Tucumán

Universidad Nacional de Tucumán Facultad de Medicina INTRODUCCIÓN A LA MEDICINA 2024 Unidad I Tema 1: Métodos de cuantificación de metabolitos. Contenidistas: Dra. Silvina Aguirre Dra. Ana Carolina Muro  FICHA 8 MÉTODOS DE CUAN...

Universidad Nacional de Tucumán Facultad de Medicina INTRODUCCIÓN A LA MEDICINA 2024 Unidad I Tema 1: Métodos de cuantificación de metabolitos. Contenidistas: Dra. Silvina Aguirre Dra. Ana Carolina Muro  FICHA 8 MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE METABOLITOS ¿Alguna vez fuiste a un laboratorio bioquímico para sacarte sangre? o ¿Juntaste un poco de tu propia orina para llevarla al laboratorio bioquímico, para que la analicen? o quizás, en una situación más grave... ¿algún médico te tuvo que extraer un poco de tu líquido.............. cefalorraquídeo porque sospechaba que tenías meningitis? Todos estos son estudios complementarios que pudo haber solicitado tu médico. Los estudios complementarios son un conjunto de estudios que aportan valiosa información al análisis médico, ya sea para confirmar o dar mayor certeza al diagnóstico de una enfermedad en cuestión. La realización de algunos estudios complementarios son de incumbencia de un/una médico/a, como por ejemplo un electrocardiograma, electroencefalograma, etc. En cambio, los estudios que vamos a plantear en este espacio, se realizan en el ámbito de un laboratorio bioquímico y son llevados a cabo por bioquímicos/as o, en su defecto, por técnicos/as bioquímicos/as o auxiliares de laboratorio pero con la supervisión de los anteriores. Entonces, si bien, cuando seas médico/a, no va a ser responsabilidad tuya su ejecución, resulta imprescindible que conozcas el fundamento de su realización, ya que es necesario un trabajo interdisciplinario y vos serás, en definitiva quien reciba el resultado de este estudio y serás quien deba interpretarlo. Hasta este momento has recorrido un amplio camino recopilando los conceptos que te introdujeron al mundo de la química de nuestro organismo, o sea, de la bioquímica. Pero para poder comprender como funciona nuestro organismo y poder aplicar lo aprendido en el diagnóstico médico, primero tenemos que........... entender como estudiar o analizar cada biomolécula y así interpretar si una alteración en su concentración puede ser el origen o el agravante de una patología. 1 Recordá que las soluciones biológicas, para que el organismo esté en su estado de equilibrio, es decir, "saludable", deben tener una cierta concentración de cada uno de los solutos que tiene disueltos. Se define así un valor de referencia (VR) para cada soluto, antes denominado “valor normal”, que en general es un rango considerado como propio para la sustancia en estudio, en condiciones de salud. Este valor se establece después de conocer la distribución de las cifras en poblaciones de referencia. La sangre, la orina y el líquido cefalorraquídeo son soluciones biológicas de gran importancia médica. La cuantificación de las respectivas sustancias disueltas permite valorar el estado de salud o enfermedad del paciente. Al comienzo, los bioquímicos trataron con las sustancias más sencillas, que podían extraerse fácilmente de organismos animales o vegetales, o bien obtenerse por descomposición de sustancias más complejas. Pero en la actualidad, como en otras disciplinas científicas, el avance de la Química Biológica ha ido de la mano de los progresos tecnológicos. Hoy en día, la disponibilidad de instrumental y métodos cada vez más sensibles, eficaces y resolutivos permiten superar estas limitaciones, como también enfrentar el desafío que plantea el estudio de biomoléculas complejas como el ADN o las glicoproteínas que conforman los receptores celulares. EL ANÁLISIS CLÍNICO Y SU USO EN LA PRÁCTICA El análisis clínico es un tipo de prueba exploratoria que consiste en la toma de muestras biológicas de un paciente y su examen en laboratorio para confirmar o descartar un diagnóstico, detectar anomalías u obtener la información necesaria para aplicar un determinado tratamiento o cualquier otro procedimiento terapéutico. De hecho, otra denominación habitual para los análisis clínicos es “prueba de laboratorio”. Tipos de muestras: En cuanto a la tipología de muestras utilizadas en el análisis clínico, podemos mencionar la sangre, orina, heces, líquido cefalorraquídeo, esputo, jugo gástrico, semen, tejidos, etc. 2 Finalidad: Los objetivos o finalidades de las pruebas de laboratorio son las siguientes: La prevención de enfermedades a través de la detección precoz de alguna anomalía. Este es el caso de los análisis clínicos rutinarios, que habitualmente se realizan en los chequeos de salud periódicos y sirven para confirmar que todos los parámetros se encuentren dentro de la normalidad o, en caso de que esto no ocurra, para adoptar medidas correctivas que eviten el desarrollo de posibles patologías. Por ejemplo, el control periódico de parámetros como la concentración sanguínea de colesterol, glucosa y de muchos otros parámetros puede utilizarse para la adopción de medidas preventivas que eviten problemas futuros (por ejemplo, el desarrollo de diabetes, patologías cardiovas- culares, entre otros). La confirmación o descarte de diagnósticos médicos. Además de la observación directa del paciente y del resultado de otros tipos de estudios complementarios que sirven para el diagnóstico (ecografía, resonancia magnética nuclear, tomografía, etc.) los análisis clínicos son, muchas veces, una herramienta imprescindible para confirmar diagnósticos en el ámbito de la medicina. En función del tipo de prueba, los resultados se expresarán de forma cualitativa (positivos o negativos) o cuantitativa (informando una cifra absoluta o del nivel alcanzado en una curva estándar). En tercer lugar, los análisis clínicos también pueden desempeñar un papel decisivo en el ámbito de la investigación. Así, al margen de la práctica médica habitual, este tipo de pruebas se utilizan en el marco de investigaciones clínicas, para el desarrollo de nuevos medicamentos o tratamientos, así como en el ámbito académico. 3 Entonces, en la práctica de los análisis clínicos hay dos ámbitos que no deben confundirse: Por una parte, la realización de las pruebas de laboratorio en sentido estricto, realizado por los bioquímicos y sus colaboradores. Por otra, la prescripción de los análisis (la solicitud de su realiza- ción) y, sobre todo, su interpretación, la cual conducirá posteriormente a la adopción de los tratamientos pertinentes. Este ámbito corresponde al personal médico. Dependiendo del tipo de laboratorio pueden trabajar, además de los bioquímicos, médicos, investigadores y otros profesionales debidamente calificados. Son muchos los tipos de estudios que se hacen en un laboratorio bioquímico. De hecho, un laboratorio de magnitudes medianas o grandes, está dividido en sectores según el tipo o área de estudio realizado. Por ejemplo, el área hematología realiza las pruebas bioquímicas para evaluar los valores de los distintos componentes celulares de la sangre. La parasitología se dedica a estudiar la presencia de organismos llamados parásitos en las muestras del paciente. La microbiología y la virología que se dedican a la búsqueda e identificación de bacterias y virus. En el área genética se realizan estudio de material genético (ADN), en citología se estudia las células de los diferentes tejidos, etc. Pero, el área que nos interesa en este espacio es el de la bioquímica clínica que se incluye dentro de lo que se llama análisis químico. LA QUÍMICA ANALÍTICA Y EL ANÁLISIS QUÍMICO En este ficha nos dedicaremos a desarrollar los conceptos básicos para comprender los fundamentos de las pruebas de laboratorio que permitan un análisis bioquímico. Pero antes es conveniente definir otros conceptos más amplios que incluyen a los análisis bioquímicos. Uno de estos conceptos es el de Química Analítica y el otro es el de Análisis Químico. La Química Analítica es la ciencia que se ocupa de separar, identificar y determinar la composición química relativa de cualquier muestra de materia. Por otro lado, se considera al Análisis Químico como la parte práctica de la Química Analítica, que aplica los métodos desarrollados por la misma para la resolución de problemas. 4 La obtención de la muestra donde se encuentra la sustancia que se quiere estudiar, la extracción o separación de esa sustancia, su purificación o aislamiento y el análisis propiamente dicho de la sustancia en estudio (desde un catión, un monosacárido, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos, etc.) conforman los pasos a seguir en el análisis químico. Tipos de análisis químicos El análisis químico de una muestra de materia puede abordarse desde dos puntos de vista: análisis cualitativo y análisis cuantitativo. El análisis cualitativo establece la identidad química de un "analito" permitiendo su identificación y presencia dentro de la muestra. ¡No indica la cantidad o la concentración del mismo! El análisis cuantitativo, en cambio, determina en forma "numérica" la cantidad relativa o la concentración del "analito" en cuestión encontrado en la muestra. Conceptos básicos en análisis químico Ahora bien, antes de continuar resulta conveniente definir los términos más frecuentemente empleados en el ámbito del análisis químico: Se denomina muestra a una parte representativa de la materia objeto del análisis, siendo una alícuota de la muestra una porción o fracción de la misma. Ejemplos de muestras son la sangre, orina, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, etc. La porción de los líquidos biológicos a ser estudiada podrá ser extraída por el bioquímico, por el médico o recolectada por el mismo paciente, según el tipo de muestra. Se llama analito a la especie química objeto del análisis. La matriz de la muestra será el conjunto de todas aquellas especies químicas que acompañan al analito en la muestra. La técnica analítica es el medio utilizado para llevar a cabo el análisis químico, mientras que el método analítico es un concepto más amplio pues no sólo incluye a la o las técnicas analíticas empleadas en un análisis sino también todas las operaciones implicadas hasta la obtención del resultado final. 5 En este espacio nos centraremos en algunas técnicas analíticas que nos permitan comprender de dónde obtenemos la información necesaria para la toma de decisiones frente al paciente. Rara vez un método de análisis es "específico" (es decir que permite identificar o cuantificar sólo un tipo de sustancia). Por esta razón es immm muy común la aparición de especies químicas interferentes durante un análisis, que influyen en la respuesta del analito, pudiendo disminuir dicha respuesta (interferencia negativa) o incrementarla (interferencia positiva). El enmascaramiento es una vía comúnmente empleada para eliminar interferencias, mediante la cual la especie interferente es transformada en otra especie química que no altera la respuesta del analito frente a la técnica empleda. La mayor parte de los métodos analíticos son relativos, es decir, el contenido de analito en la muestra se obtiene a través de una comparación con un patrón de referencia. Se denomina solución patrón o estándar a una solución de concentración exactamente conocida. La gráfica que representa la respuesta analítica en función de la concentración del analito de la solución estándar correspondiente se llama curva de calibración, también llamada curva de calibrado o curva estándar. Mirá este video. Te ayudará a afianzar lo aprendido. Aclaración sobre el video: En el intervalo de tiempo 1:30 - 1:50 se muestra una diapositiva que tiene como título "Cualitativo”. Debe decir "Cuantitativo". Este error no invalida el resto de la explicación. ANÁLISIS BIOQUÍMICOS (BIOQUÍMICA CLÍNICA) Habiendo visto ya las generalidades de los análisis químicos, empezaremos a analizar los fundamentos de algunas de las técnicas utilizadas más frecuentemente para el dosaje de los analitos estudiados en los análisis bioquímicos de rutina. ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE Las técnicas espectrales son un tipo de análisis químico usadas para determinar la concentración de un compuesto en una solución, basadas en la interacción de la luz con la materia. Entre estas técnicas se encuentra la espectrofotometría. Es un tipo de análisis cuantitativo. 6 La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que se basa en la capacidad de las moléculas del soluto (el analito) de absorber las radiaciones electromagnéticas de la zona ultravioleta o visible del espectro. Tanto las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber, como la eficiencia con la que se absorben, dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.). A su vez, la cantidad de luz absorbida depende directamente de la concentración del soluto absorbente. ¿Qué es la longitud de onda? Considerando que la luz viaja en forma de onda, se define a la longitud de onda de la luz (λ, lambda) como la distancia entre dos crestas consecutivas y se recomienda expresarla en nanómetro (nm). La siguiente figura muestra de manera esquemática la onda de propagación de la luz y se indica cuál es la longitud de onda. Dirección de propagación de la onda. Representación esquemática de la propagación de una onda. La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro electromagnético, en el rango UV (de 180 a 380 nm), y en el de la luz visible (de 380 a 780 nm). La luz visible está conformada por radiaciones de longitudes de ondas que están asociadas a diferentes colores. Rayos X Espectro electromagnético 7 El aparato en donde se realiza este análisis es llamado espectrofotómetro el cual puede ser de uso manual o automatizado y, como utiliza reactivos que están en solución, se incluye dentro del tipo de análisis químico llamado química líquida. Es muy importante elegir adecuadamente la longitud de onda de trabajo. Para ello se utiliza el espectro de absorción que es un gráfico característico para cada sustancia, en el que se representa la cantidad de luz absorbida (Absorbancia) a diferentes valores de longitud de onda. La longitud de onda a la que el compuesto presenta la mayor absorbancia se denomina longitud de onda óptima (λ óptimo) y ésta es la que se utilizará para la cuantificación del analito a estudiar. El espectrofotómetro posee una fuente de energía electromagnética (lámpara) y un dispositivo (monocromador) que permite seleccionar y transmitir radiación de una determinada λ que será la que atravesará a la solución que contiene el soluto a analizar. Esta solución se coloca en un recipiente denominado cubeta y, luego de que la solución es atravesada por la luz de λ seleccionada, se procede a leer la radiación absorbida (absorbancia). Generalmente, en análisis clínicos se utiliza la espectrofotometría en la "región visible". Hay que tener en cuenta que para que la sustancia absorba radiación de la zona visible del espectro electromagnético es condición que sea coloreada. Algunas sustancias tienen color propio como la bilirrubina, pero la mayoría de los analitos de los líquidos biológicos son sustancias incoloras. Cuando se trata de sustancias incoloras, antes de realizar su medición por esta técnica, deben convertirse en productos finales coloreados mediante determinadas reacciones químicas. Por ejemplo, la glucosa (incolora) se convierte mediante una reacción química en quinonimina, un producto de color rojo cuyo λ óptimo es 505 nm. También, puede utilizarse alguna reacción química en la que intervenga algún compuesto orgánico heterocíclico (por ejemplo: NAD, NADH) que tiene máxima absorción en la región UV y, en una reacción estequiométricamente proporcional, se pueden determinar diferentes analitos. Por ejemplo, también puede determinarse la concentración de glucosa de esta manera. 8 Otras sustancias, como los compuestos orgánicos que poseen dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos, tienen su máxima absorbancia en la región UV. Así, por ejemplo, las proteínas y el ADN pueden cuantificarse mediante espectrofoto- metría UV. Generalmente estas técnicas se utilizan en el ámbito de la investigación. Ley de Lambert–Beer: La espectrofotometría se fundamenta en la "Ley de Lambert–Beer", que dice: “Cuando un haz de luz monocromática (que tiene una sola longitud de onda) atraviesa una solución homogénea, la absorbancia es proporcional a la concentración de las moléculas absorbentes y al espesor de la solución atravesada”. Como los espectrofotómetros utilizan cubetas que tienen forma y espesor constante, el espesor de la solución atravesada deja de ser una variable a considerar. Entonces, se puede relacionar soluciones de concentraciones desconocidas con una solución de concentración conocida a la que se la llama solución testigo o solución estándar. Matemáticamente este concepto se traduce en la siguiente expresión matemática: A1 C1 C1: concentración de una solución desconocida * A2 = C2 C2: concentración de una solución estándar A1: absorbancia de una solución de concentración desconocida A2: absorbancia de una solución estándar Despejando de la ecuación la concentración desconocida, queda: C1 = A1. C2 A2 Esta ecuación es la que vas a tener que utilizar para calcular la concentración de algún analito. *Solución desconocida: Se refiere a la solución del analito cuya concentración es decsonocida y se desea determinar. 9 Supongamos que trabajamos en un laboratorio bioquímico de un Hospital de San Miguel de Tucumán, y recibimos dos muestras de suero de dos pacientes internados (Paciente A y Paciente B). Suero Suero Paciente A Paciente B A ambos pacientes se les debe determinar la concentración de glucosa en sangre (glucemia), mediante la técnica espectrofotométrica. La solución estándard es una solución de glucosa de concentración 1 g/L. Luego de realizar el procedimiento correspondiente, obtenemos los siguiente datos: Absorbancia de la muestra del paciente A: 0,520 Absorbancia de la muestra del paciente B: 0,680 Absorbancia de la solución estándar: 0,490 Utilizando la ecuación mostrada anteriormente, hagamos los cálculos: Determinación de la glucemia del paciente A: 1 g/L Glucemia paciente A = 0,520. = 1,06 g/L 0,490 Ahora, calculá la glucemia del paciente B. Rta: 1,39 g/L QUÍMICA SECA La técnica de análisis denominada química seca emplea "reactivos secos". Se utiliza un dispositivo llamado "slide" o "tira reactiva" que consiste en una laminilla de material sintético que contiene impregnados en su interior (por pretratamiento y secado de las respectivas soluciones) los reactivos necesarios para el análisis. Estos reactivos reaccionan al contacto con la muestra que contiene el analito. ggggg la s 10 Generalmente se requieren cantidades muy pequeñas de muestra para la reacción (5 a 10 μL). Hay distintos tipos de slides según el tipo de análisis a realizar: 1. Colorimétricos: realiza la medición cuando ha terminado la reac- ción de tipo colorimétrica (el producto final es coloreado). 2. Enzimáticos: se hacen varias lecturas durante la reacción, a medida que la reacción enzimática avanza en el tiempo. 3. Potenciométricos: utilizan un electrodo para medir diferencia de potencial entre la muestra y un control. Sirven para cuantificar electrolitos. Los slides son colocados en un equipo denominado "analizador" para que lleve a cabo la lectura correspondiente. Para los slides colorimétricos y enzimáticos el analizador realiza una lectura espectrofotométrica. Para los potenciométricos el equipo utiliza un electrodo. Con esta técnica se puede hacer, por ejemplo, el diagnóstico de infarto agudo de miocardio, se realiza el estudio químico de la orina, entre otros. En la actualidad muchos laboratorios bioquímicos medianos y de alta complejidad cuentan con analizadores automatizados que utilizan la tecnología de química seca para determinar la concentración de distintas sustancias como colesterol, triglicéridos, glucosa, ácido úrico, etc. tanto en muestras de suero como de orina. Estos aparatos presentan numerosas ventajas como, por ejemplo: contienen kits con un gran rendimiento de pruebas, los resultados se obtienen de una manera rápida, exacta y confiable, incrementan la eficiencia y la productividad del laboratorio. Analizador de química seca Tiras reactivas 11  ELECTROFORESIS La electroforesis es una técnica utilizada para la separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.​ La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (por ejemplo, electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su tamaño. Por lo tanto, para que las moléculas de una mezcla de sustancias puedan separarse por electroforesis, éstas deben poseer carga eléctrica. La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente, y esta técnica es utilizada para su separación. Los poros del soporte o la matriz actúan como un tamiz, lo cual permite que las moléculas más pequeñas se muevan más rápido que las moléculas más grandes. Esta técnica se basa en el diferente movimiento de las moléculas cargadas eléctricamente, movimiento que depende, como dijimos, de su tamaño y su carga. Al hacer pasar una corriente sobre el medio, las moléculas con una carga negativa, se mueven hacia el ánodo (polo +), mientras que las moléculas con carga positiva, se ven atraídas hacia el cátodo (polo -) y migran hacia él. Á C n á o t d o o d Aniones Cationes o Electroforesis. Representación esquemática de la separación de las moléculas cargadas eléctricamente. 12 En los laboratorios de análisis clínicos la electroforesis se utiliza para separar las proteínas y las lipoproteínas plasmáticas (proteínas que se encuentran disueltas en el plasma* sanguíneo). En el campo de la genética esta técnica se usa muy frecuentemente para separar fragmentos de ADN o ARN que también se encuentran cargados eléctricamente. Recordá que cuando vimos el tema de proteínas, explicamos que la carga eléctrica de las mismas depende del pH del medio. Por lo tanto, el hecho de que en una electroforesis se dirijan al ánodo o al cátodo dependerá del pH del medio en el que se encuentran disueltas. Más adelante, en el próximo espacio curricular verás específicamente el fundamento y las condiciones de la separación electroforética de las proteínas plasmáticas mediante un método de análisis de proteínas llamado "proteinograma electroforético". IMPORTANTE En esta ficha te explicamos brevemente los fundamentos de algunas técnicas utilizadas en análisis clínicos. Es importante destacar que en la actualidad, la mayoría de los laboratorios bioquímicos están equipados con autoanalizadores (analizadores automáticos) los cuales cuantifican mediante técnicas cuyos fundamentos son muy variados, algunos basándose en lo aprendido aquí y otros con fundamentos muy sofisticados. Tanto las técnicas manuales como las automatizadas requieren un exhaustivo control profesional del/de la bioquímico/a. El propósito de este contenido es que sepas que tras ese informe de laboratorio de un/una paciente hubo un gran trabajo de análisis de determinados analitos, los cuales deberán ser interpretados por el/la profesional médico con el fin de evaluar el estado de salud del/de la paciente. *Plasma: es el componente líquido de la sangre en el que están suspendidos los elementos formes (glóbulos rojos, leucocitos y plaquetas), y disueltos una gran cantidad de solutos como, por ejemplo, la glucosa. 13  BIBLIOGRAFÍA Temas de Bioquímica. Teoría. Cátedra de Bioquímica. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Tucumán. 2022. Se consultaron las siguientes páginas web: ¿Que es el análisis clínico? Centro europeo de másteres y posgrado. https://cemp.es/noticias/que-es-analisis-clinico-conoce-la-......definicion/ Tecnología de laminilla seca. Servicios Integrales Vencher https://serviciosintegralesvencher.wordpress.com/2017/12/18/tecn ologia-de-laminilla-seca/ Electroforesis: ¿Qué es y para qué sirve? Genotipia. https://genotipia.com/electroforesis/ Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano. Electroforesis. https://www.genome.gov/es/genetics- glossary/Electroforesis#:~:text=La%20electroforesis%20es%20una %20t%C3%A9cnica,gel%20o%20de%20otra%20matriz. VIDEOGRAFÍA Química analítica. Centro Virtual de Apendizaje. Tecnológico de Monterrey. Marzo 2020. https://youtu.be/RcKWwtMjRfs?si=TOT3TvieDDfOYRS9 14 Universidad Nacional de Tucumán Facultad de Medicina INTRODUCCIÓN A LA MEDICINA