Genetica I PDF - Giampiero Valè

GENETICA I Giampiero Valè Genetica dei microrganismi: batteri aploidi. Mutanti nei batteri e loro selezione Plasmidi Fattore F e sue caratteristiche Fattore F’ e costruzione di diploidi parziali Trasferimento della informazione genetica nei batteri: coniugazione, trasformazione Genetica dei...

GENETICA I Giampiero Valè Genetica dei microrganismi: batteri aploidi. Mutanti nei batteri e loro selezione Plasmidi Fattore F e sue caratteristiche Fattore F’ e costruzione di diploidi parziali Trasferimento della informazione genetica nei batteri: coniugazione, trasformazione Genetica dei virus e fagi: strutture, cicli litico e lisogenico, trasduzione  Escherichia coli, presente nell’apparato digerente A bastoncello Diametro 0,5 µm Lunghezza variabile con lo stadio di crescita Divisione per scissione binaria E. coli – è un batterio Gram-negativo; è un bacillo; E coli si accresce aumentando lunghezza, mentre diametro rimane sostanzialmente invariato Duplicato il DNA e duplicata la lunghezza, forma setto e si divide Le colonie hanno origine da 1 singola cellula; tutte le cellule di una colonia sono identiche perché derivate da 1 singolo batterio SISTEMI DI CRESCITA PER I BATTERI Conta non vitale considera la densità ottica del campione (il valore in assorbanza delle cellule batteriche si legge nel visibile a 600 nm). Ad ogni valore di O.D. (Optical density) corrisponderà un numero di cellule. Ogni microorganismo ha dei valori propri di riferimento che definiscono il titolo dei batteri quando la loro densità ottica è 1 (es se a OD 1 ci sono 100.000/ml, se ho OD 0,6 faccio: 1:100.000=0,6:x).  Titolazione dei batteri: es Escherichia coli La conta vitale permette di distinguere tra cellule vive e morte all’interno della coltura: consiste nel diluire una coltura batterica e piastrare su terreno solido le diverse diluizioni fino ad ottenere un numero contabile di colonie, dopo opportuna incubazione alla temperatura ottimale di crescita del microrganismo. Il titolo della sospensione si esprime in CFU / ml Diluizioni seriali Titolo iniziale della coltura batterica di partenza (CFU/ml): (numero di colonie x 10) x fattore diluizione (es 108) Titolo iniziale della coltura batterica di partenza (CFU/ml): (numero di colonie x 10) x fattore diluizione (es 108)  Il cromosoma batterico La maggior parte dei batteri contiene un singolo cromosoma circolare costituito da DNA a doppia elica Non mancano tuttavia esempi di cromosomi lineari (es Borrelia burgdorferi che causa la malattia di Lyme) o di genomi suddivisi in due o più molecole di DNA. Le dimensioni del cromosoma batterico possono variare da 1 x 105 bp a 1 x 107 bp. Molti cromosomi batterici hanno un’organizzazione efficiente. Per esempio PIÙ DEL 90% DEL DNA DELL’E. COLI CODIFICA PROTEINE, MENTRE SOLO L’1-2% DEL DNA UMANO SVOLGE QUESTA FUNZIONE. I procarioti sono monoploidi: singola copia del genoma  REPLICAZIONE DEL DNA DI E. coli Molecola a doppia elica circolare con una singola origine di replicazione Replicazione del DNA che procede bi-direzionalmente: 2 forche replicative divergenti Genoma di 4,6 x 106 pb, codificante per 4405 geni Velocità di sintesi di circa 800 nucleotidi/sec a 37°C Struttura del DNA in replicazione è detta a Theta  I PLASMIDI Molecole di DNA extracromosomiche lineari o circolari capaci di replicarsi in modo autonomo: repliconi Dimensioni da poche migliaia di bp a dimensioni simili a quelle del cromosoma Utilizza i componenti del sistema replicativo del batterio Possono codificare funzioni molto eterogenee REPLICAZIONE DEI PLASMIDI I plasmidi si replicano indipendentemente dal proprio cromosoma batterico  MUTANTI NEI BATTERI Per evidenziare le mutazioni si deve passare da una condizione che permette la crescita del batterio (condizione permissiva) ad un’altra che non consente la formazione della colonia (condizione non permissiva) Mutanti resistenti a batteriofago: batteri messi a crescere in presenza del fago, se non crescono sono sensibili, se crescono sono resistenti. Caratteristica ereditabile presente sul cromosoma Mutanti auxotrofi: hanno perso la capacità di crescere su un terreno di coltura minimo; batteri capaci di crescere su terreno minimo: prototrofi; batteri mutanti incapaci di crescere su terreno minimo: auxotrofi, sono letali condizionali Sintesi della tirosina in E. coli: un ceppo che ha mutazione nel gene tyrA non sarà capace di crescere in assenza di tirosina, mutante Tyr- E. coli è un batterio prototrofo e quindi capace di crescere in un terreno minimo La identificazione di mutanti richiede la utilizzazione di specifici terreni selettivi Esempio di terreni selettivi Come si procede alla identificazione di colonie in un mutante auxotrofo: ‘replica plating’  MUTANTI NEI BATTERI II Mutanti temperatura sensibili: crescono solo a certe temperature e non a altre; detti termosensibili (ts) Mutanti nel catabolismo degli zuccheri: incapaci di usare la fonte di C del terreno minimo es Glu, Lattosio, galattosio ecc; un mutante incapace di crescere su un terreno con solo Lattosio come fonte di carbonio: Lac- Mutanti resistenti agli antibiotici: es terreno con streptomicina (blocca sintesi proteica) blocca crescita di tutti i sensibili e crescono solo quelli resistenti TRASFERIMENTO INFORMAZIONE GENETICA NEI BATTERI Trasferimento verticale: duplicazione e trasmissione del materiale genetico alle cellule figlie a ogni divisione cellulare Trasferimento orizzontale: coniugazione, trasformazione, trasduzione CONIUGAZIONE: scambio di materiale genetico unidirezionale da un batterio donatore a uno ricevente Fattore (plasmide) F: conferisce al batterio la capacità di coniugare Contiene geni che codificano le funzioni richieste per: -Trasferimento del materiale genetico -Sintetizzare pili sulla superficie cellulare oriT è diverso da oriC CONIUGAZIONE II Batterio che contiene fattore F: definito come F+; sulla sua superficie sono presenti i pili sessuali o pili F che consentono di prendere contatto con specifici recettori sulla membrana del batterio ricevente (F-) I pili originano dalla membrana plasmatica L’accorciamento del pilo porta a contatto le membrane delle 2 cellule dando origine a un ponte coniugativo (o ponte citoplasmatico) CONIUGAZIONE III Trasferimento del fattore F: replicazione a cerchio rotante o a sigma δ (dalla forma che assume il DNA in replicazione) Il trasferimento ha inizio quando uno dei filamenti di DNA sul fattore F si interrompe vicino al sito di origine del trasferimento (oriT). Un’estremità del DNA interrotto si separa dal resto del plasmide e passa nella cellula ricevente Viene trasferito da 5’-P a 3’-OH; LA ESTREMITÀ 3’-OH VIENE USATA COME PRIMER DALLA POLIMERASI BATTERICA PER DUPLICARE IL DNA NEL DONATORE IL TRASFERIMENTO AVVIENE CON ALTA FREQUENZA CONIUGAZIONE: ceppi Hfr La molecola di DNA di F può ricombinare (mediante CO) con il cromosoma batterico dando origine a ceppi chiamati Hfr (High frequency of recombination) FREQUENZA: 1 VOLTA OGNI 10 000 Un plasmide che può esistere all’interno di un batterio sia come molecola indipendente che integrato nel cromosoma viene definito episoma CONIUGAZIONE di ceppi Hfr con F- Se avviene coniugazione, il trasferimento inizia da oriT (interno a F) e dovrebbe riguardare tutto il cromosoma batterico (richiederebbe 100 minuti); la divisione cellulare di solito interrompe la coniugazione, quindi i geni più vicini al punto di inserzione di F sono trasferiti con > frequenza di quelli più lontani Qui inizia subito la replicazione del cromosoma dal 3’ OH libero All’interno del ricevente il DNA si duplica la cellula F– non diventa quasi mai F+ o Hfr Coniugazione interrotta tra Donatrici Hfr: str- leu+ thr+ azi+ ton+ lac+ gal+ Riceventi F-: str+ leu- thr- azi- ton- lac- gal- cellule Hfr e I due ceppi vengono mescolati su un cellule F- e terreno nutriente e messi in mappatura dei condizione di coniugare. geni A intervalli regolari un campione di cellule viene rimosso e agitato vigorosamente per bloccare ogni ulteriore coniugazione le cellule di ogni campione vengono piastrate su un terreno selettivo con streptomicina e senza leu e thr Quindi, MESCOLO I CEPPI BATTERICI SU TERRENO NON SELETTIVO PER FAR AVVENIRE LA CONIUGAZIONE, POI A INTERVALLI DEFINITI (ES OGNI 5 MIN) PRELEVO CAMPIONE E LO PIASTRO SU TERRENO SELETTIVO PER STR E AZI, + selezione per altro marcatore es pro, oppure trp. Oppure pur, oppure lac E INFINE VADO A VEDERE I RISULTATI…….riportati nella tabella sottostante L’ORIENTAMENTO DEL FATTORE F NEI CEPPI Hfr DETERMINA LA DIREZIONE E L’ORDINE DEL TRASFERIMENTO GENICO Orientamento di F determina Orientamento di F determina trasferimento genico in senso trasferimento genico in senso antiorario orario L’ORDINE DEL TRASFERIMENTO GENICO IN DIVERSI CEPPI Hfr INDICA CHE IL CROMOSOMA DI E. coli E’ CIRCOLARE Con ogni esperimento si è mappata una parte del genoma e poi i dati sono stati cumulati per dare una mappa completa 4 min tra leu e proA 6 min tra purE e proA CONIUGAZIONE: fattori F’ Escissione del fattore F che porta una piccola parte del DNA batterico: plasmidi chiamati F’; es. F’lac+: fattore F che porta la regione lac, F’leu+: fattore F che porta la regione leu…. Il ceppo che porta F’ trasferirà con alta frequenza sia F che la regione chr batterica posta sul plasmide regione di estesa omologia con il chr batterico che ne facilita e indirizza la integrazione: QDI SI OTTENGONO CON > FREQ CEPPI HFR Coniugazione tra cellula F’lac con cellula F-: il plasmidio e geni provenienti dal cromosoma batterico sono trasferiti ; processo chiamato sexduzione e produce cellule parzialmente eterozigoti chiamate merozigoti RICAPITOLANDO UTILIZZAZIONE DEI DIPLOIDI PARZIALI NELLA GENETICA BATTERICA PER STABILIRE PER STABILIRE SE DUE DOMINANZA O MUTAZIONI CADONO RECESSIVITA’ DI UN NELLO STESSO GENE O ALLELE IN GENI DIVERSI (TEST DI COMPLEMENTAZIONE) F’ PER STABILIRE DOMINANZA O RECESSIVITA’ DI UN ALLELE  F’ PER TEST DI COMPLEMENTAZIONE Per capire se mutazioni che danno lo stesso fenotipo sono sullo stesso gene o su geni diversi. Ho un ceppo F’ ed un ceppo F- entrambi auxotrofi per met. Testo diversi eventi di coniugazione e se da uno di questi ottengo un coniugante F’ prototrofo significa che le mutazioni erano su geni diversi.  TRASFORMAZIONE NEI BATTERI Assunzione di una molecola di DNA dall’ambiente esterno, trasferimento all’interno della cellula batterica e sua integrazione stabile nel cromosoma Le cellule devono trovarsi in uno stato di competenza che fa sì che si formino dei recettori sulla superficie cellulare; es. in B. subtilis durante il trasporto nel citoplasma un’elica del DNA viene degradata e l’altro filamento si associa nel citoplasma a proteine RecA che ne permettono la ricombinazione con il DNA omologo IL DNA CHE VIENE INCORPORATO DA UNA CELLULA COMPETENTE NON È NECESSARIAMENTE DI TIPO BATTERICO: in pratica, in condizioni ambientali appropriate, le cellule competenti possono incorporare qualunque tipo di DNA, sia batterico che di altro genere. Prima evidenza della trasformazione: esperimento di Frederick Griffith (1928) con lo pneumococco (Streptococcus pneumoniae) S, "liscio" (smooth), produce colonie lisce e lucenti R, "rugoso" (rugged), produce colonie dall'aspetto (capsula batterica polisaccaridica che avvolge ogni "rugoso" (assenza della capsula batterica). Non è in cellula). E’ in grado di provocare la polmonite grado di provocare polmonite Iniettando nel topo cellule del ceppo non virulento (R) mescolate con cellule uccise al calore del ceppo virulento (S) il topo muore e dal topo morto si recuperano cellule S vive TRASFORMAZIONE NEI BATTERI  MAPPATURA PER TRASFORMAZIONE NEI BATTERI Le cellule che ricevono materiale genetico attraverso la trasformazione sono chiamate trasformanti Se un gene a e un gene b così come un gene b e un gene c vengono spesso cotrasformati, mentre i geni a e c lo sono raramente, allora il gene b deve trovarsi fra a e c e l’ordine dei geni deve essere a b c: mappaggio dei geni batterici impiegando la frequenza di cotrasformazione I VIRUS  I VIRUS Agenti infettivi di piccole dimensioni (10 – 300 nm) che possono replicarsi unicamente all’interno delle cellule di altri organismi Se le cellule infettate sono eucariotiche si parla di virus, se procariotiche si parla di batteriofagi o fagi Sono formati da materiale genetico, il genoma virale, rivestito da un involucro proteico, il capside. I capsidi di alcuni virus che infettano le cellule eucariotiche possono essere circondati da una membrana lipidica associata a proteine (derivata dalla membrana plasmatica della cellula infettata) Il genoma virale può essere formato da DNA o da RNA VIRUS: STRUTTURA DEL CAPSIDE Il capside di ciascun virus o batteriofago è formato dalla ripetizione di una o poche proteine (tuttavia diverse da virus a virus) VIRUS BASTONCELLARI VIRUS A FORME VIRUS ICOSAEDRICI O O CILINDRICI COMPLESSE POLIEDRICI ICOSASAEDRICA FILAMENTOSA TESTA E CODA Il capside ha la forma di un Il capside è costituito da Struttura che si trova solo icosaedro regolare (20 facce proteine (capsomeri) che si nei batteriofagi. Sono a triangolo equilatero). Ogni avvolgono a formare un formati da una testa faccia è costituita da elica. Il genoma forma una contenente l’acido nucleico proteine sferiche adiacenti, spirale all’interno del e da una coda filamentosa. unite in gruppi di 5/6 unità capside ed è contenuto in Altre strutture addizionali (capsomeri). Il genoma si una specie di doccia situata eventualmente presenti trova all’interno del capside sulla parte superiore della servono a facilitare proteina l’ingresso nella cellula ospite Morfologia e principali caratteristiche dei fagi  Il genoma virale Il genoma virale può essere formato da DNA (DESOSSIRIBOVIRUS) o da RNA (RIBOVIRUS), a doppia o a singola elica, con cromosoma circolare o lineare. La maggior parte dei virus ha un unica molecola di DNA o RNA, ma ci sono anche virus con genoma segmentato Il genoma virale è molto compattato: alcuni virus hanno geni sovrapposti La dimensione dei genomi virali varia da circa 1.6 kb a oltre le 150 kb e anche il numero dei geni da appena 3 (fago MS2) a oltre 150 (fagi T) Un esperimento con TMV (tobacco mosaic virus) ha dimostrato che RNA virale è portatore dell’informazione genetica Il fago λ Il fago λ è un fago che infetta E. coli Il genoma è formato da DNA a doppio filamento lineare di 40.502 bp che codifica per 48 proteine La particolare struttura del cromosoma del fago λ Qui c’è il genoma di 40502 bp  Replicazione del fago λ Replicazione del cromosoma con il meccanismo del circolo rotante: si forma il concatamero che contiene copie multiple ripetute in tandem del genoma di lambda. L’enzima ter taglia nelle sequenze cos e separa i singoli genomi Qui c’è il genoma di 40502 bp Assemblaggio del genoma nel fago λ Il fago T4 Il cromosoma di T4 è una molecola di DNA a doppia elica lineare lunga 168.903 bp contenente circa 300 geni I fagi T-pari (T2, T4, T6) Il ciclo litico di un batteriofago Qdo nel batterio si è accumulato circa un centinaio di fagi la cellula va incontro a lisi a opera di enzimi litici codificati dal fago e la progenie fagica liberata nell’ambiente. Tutto il ciclo avviene in tempi molto brevi (25-45 min) Il ciclo litico di un batteriofago Placche del fago T2 su E. coli E possibile seguire visivamente un ciclo litico piastrando i batteri su un terreno solido ad una concentrazione tale da formare una patina continua. I fagi vengono aggiunti ad una concentrazione più bassa. Ogni fago infetta un batterio e la progenie fagica rilasciata da ogni batterio, infetta i batteri limitrofi e il ciclo litico si ripete. Il risultato è la formazione di una placca: zona traslucida priva della patina batterica CICLO LITICO E LISOGENO NEL FAGO λ induzione del profago PROTEINA INTEGRASI (codificata da λ) media ricombinazione sito- specifica Integrazione sito specifica del DNA di λ nel genoma di E. coli 1) DNA di λ lineare iniettato al momento della infezione 2) Circolarizzazione del DNA di 3) Sia λ che E. coli condividono una sequenza λ mediante appaiamento delle identica di 15 bp nota come sito att: regioni cos (12 nt) a singolo filamento 4) L’evento di ricombinazione e’ catalizzato dalla proteina fagica Int (integrasi) e dalla proteina batterica IHF (integration host factor) TRASDUZIONE Scoperta della trasduzione nei batteri: Lederberg e Zinder, 1951 Ceppo di Salmonella typhimurium auxotrofo per fenilalanina (phe-), triptofano (trp-) e tirosina (tyr-): puo’ crescere solo se il terreno minimo è addizionato con questi tre aminoacidi. Ceppo di Salmonella typhimurium auxotrofo per metionina (met-), e istidina (his-): puo’ crescere solo se il terreno minimo è addizionato con questi due aminoacidi Dal mescolamento dei due ceppi ottennero rare cellule prototrofe capaci di crescere su terreno minimo senza l’aggiunta di aminoacidi. Ceppo Prototrofo: phe+ trp+ tyr+ met+ his+ crescendo i due ceppi di Salmonella in un mezzo contenente DNasi, e separati nei due bracci di un tubo a forma di U, si formavano comunque ricombinanti prototrofi: esclusi quindi processi come coniugazione e trasformazione Esperimenti successivi dimostrarono che uno dei due ceppi era infettato dal batteriofago P22 e che questo virus trasportava i geni da una cellula donatrice alla cellula ricevente. Tale processo venne chiamato dagli stessi ricercatori TRASDUZIONE TRASDUZIONE GENERALIZZATA Fagi che operano questo tipo di trasduzione sono es P1 di E. coli e P22 di Salmonella enterica serovar typhimurium Quindi, geni batterici possono transitare da Dato che LA TESTA DEL FAGO PUÒ un ceppo batterico a un altro, producendo CONTENERE 1/CENTESIMO DEL GENOMA batteri ricombinanti che chiamiamo BATTERICO, si stima che 1 gene batterico trasduttanti. venga trasdotto con efficienza 10-5-10-6 TRASDUZIONE GENERALIZZATA Attraverso la trasduzione si può stabilire l’ordine e la distanza tra i geni, costruire cioè la mappa genetica del cromosoma batterico Se due geni sono vicini sul cromosoma batterico possono essere cotrasdotti ossia impaccati nella stessa testa fagica e trasdotti entrambi nella cellula infettata: i valori di associazione tra due geni possono pertanto essere espressi come frequenze di cotrasduzione Es. Il fago P1 viene prima fatto replicare sul batterio donatore e il lisato fagico viene poi trasferito sul batterio ricevente Batterio donatore leu + thr + azi r Batterio ricevente leu - thr - azi s Il batterio ricevente viene in seguito analizzato per i tre marcatori TRASDUZIONE GENERALIZZATA leu e azi sono vicini Sulla base delle frequenze di cotrasduzione posso definire l’ordine dei geni sulla mappa: TRASDUZIONE SPECIALIZZATA Si realizza quando i fagi trasferiscono solo specifiche parti del cromosoma batterico. Tale trasduzione è operata da fagi temperati (come λ ο φ80) che si integrano (CICLO LISOGENO) in uno specifico sito del cromosoma batterico Il sito di inserzione per il fago λ (sequenza att) sul cromosoma di E. coli si trova tra i geni gal e bio (motivo per cui λ trasduce questi due geni in modo specifico) TRASDUZIONE SPECIALIZZATA Il cromosoma di λ integrato nel cromosoma batterico può essere escisso a seguito di induzione (entrata ciclo litico). Solitamente l’escissione è precisa e produce un cromosoma del fago λ completo (1) In rari casi l’escissione avviene in siti diversi da quelli con omologia (att) e porta alla formazione di cromosomi del fago λ anormali (2) (1) Escissione normale (2) Rara escissione anomala Il fago trasducente che si è così generato è indicato con λd gal (d= difettivo) Il lisato che si ottiene è detto LFT: lisato a bassa frequenza di trasduzione (perché conterrà solo pochi fagi λd gal+ e moltissimi fagi λ normali) TRASDUZIONE SPECIALIZZATA 1) infezione di un batterio (gal -, incapace di metabolizzare il lattosio) SOLO con fagi λd gal + (difettivi): produce TRASDUTTANTI STABILI Il DNA batterico portato dal fago λd gal + si integra per ricombinazione omologa (tramite un doppio crossing over) con il gene gal del cromosoma batterico (il cromosoma batterico ora porta un gene gal funzionante) Il fago λd gal non può replicarsi nè integrarsi perchè mancante di geni fagici TRASDUZIONE SPECIALIZZATA 2) Doppia infezione di un batterio gal – (incapace di metabolizzare il lattosio) con fagi λ normali e fagi λd gal +: produce TRASDUTTANTI LISOGENI Il fago selvatico (λ+) aiuta il fago λd gal+ ad integrarsi nel cromosoma batterico Quando entrambi i fagi si integrano durante il ciclo lisogeno, si genera un trasduttante doppio lisogeno. I batteri trasduttanti sono diploidi parziali (eterozigoti) gal+ / gal- Se i fagi trasducenti sono indotti si formeranno per metà particelle fagiche di tipo selvatico λ+ e per metà particelle λd gal+. Tale lisato essendo ricco di particelle di tipo λd gal+ è detto HFT (lisato ad alta frequenza di trasduzione)