Genetica I PDF - Giampiero Valè

GENETICA I Giampiero Valè Vettori per il clonaggio. Manipolazione del materiale genetico Endonucleasi di restrizione DNA ricombinante, trasformazione CLONAGGIO DEI GENI Elementi richiesti per la clonazione di un gene o una sequenza di DNA: 1) Un frammento di DNA; 2) Vettore di clonaggio (pl...

GENETICA I Giampiero Valè Vettori per il clonaggio. Manipolazione del materiale genetico Endonucleasi di restrizione DNA ricombinante, trasformazione CLONAGGIO DEI GENI Elementi richiesti per la clonazione di un gene o una sequenza di DNA: 1) Un frammento di DNA; 2) Vettore di clonaggio (plasmidi); 3) Enzimi di restrizione; 4) Enzimi di ligazione; 5) Cellule competenti alla trasformazione 6) Selezione dei trasformanti PLASMIDI PER IL CLONAGGIO DNA a doppio filamento circolari; all’interno della cellula si trovano in uno stato di super- avvolgimento (forma CCC: cerchio covalentemente chiuso) Replicazione autonoma rispetto al cromosoma: hanno ori ENZIMI DI RESTRIZIONE: sono endonucleasi che in seguito a riconoscimento di sequenze TAGLIANO I LEGAMI FOSFODIESTERICI La sequenza riconosciuta (in genere 4-8 bp) è palindromica, a simmetria binaria, cioè è identica se letta in direzione 5’ – 3’ su entrambe le eliche Nel caso di DNA con = % di AT e GC una sequenza di 4 bp compare con frequenza di 1/44, quindi in media ogni 256 bp; una seq di 6 bp appare con frequenza 1/46, qdi 1/1096 bp e così via Gli enzimi di restrizione tagliano il doppio filamento e producono estremità coesive o piatte Es se uno è il plasmide e l’altro il DNA da clonare, posso ligarli insieme Per definizione 1 UNITA' di enzima di restrizione rappresenta la quantità di enzima richiesta per digerire completamente 1 µg di DNA substrato in un'ora  DNA LIGASI Forma legami covalenti tra 2 nucleotidi adiacenti sulla stessa elica: quindi 2 molecole di DNA ligasi intervengono a ligare entrambi i filamenti formando legami fosfodiesterici zucchero-fosfato Nel clonaggio: usata in genere la ligasi del fago T4 in quanto lega anche frammenti con estremità piatte CELLULE OSPITI Cellule di E. coli o del gram-positivo Bacillus subtilis (trasformazione) Cellule di lievito, cellule vegetali e animali PASSAGGI PER LA CLONAZIONE DI FRAMMENTI DI DNA 1) Linearizzazione del vettore: tramite trattamento con enzima di restrizione, che produca preferenzialmente estremità coesive; verifica della restrizione del vettore su gel di agarosio Passaggi per la visualizzazione delle molecole di DNA su gel di agarosio 2) Trattamento del DNA da clonare con lo stesso enzima di restrizione usato per la linearizzazione del plasmidio; verifica su gel di agarosio 3) Ligazione: si uniscono le reazioni ottenute ai punti 1 e 2 in presenza di un enzima (ligasi) che consente la formazione di legami covalenti tra le molecole del vettore e quelle del DNA In realtà ci sarà una ligasi per ogni filamento, qdi 4 ligasi in totale 4) Trasformazione: inserimento delle molecole ligate in cellule ospiti; nei lavori di clonaggio sono generalmente usate cellule competenti di E. coli Alcuni batteri, es Bacillus subtilis, sono naturalmente trasformabili in quanto hanno geni (detti com, per competenza) che permettono alle cellule di diventare competenti e catturare il DNA; ma la stragrande maggioranza dei batteri, incluso E coli, non sono competenti e la competenza deve essere indotta artificialmente. Procedure per la trasformazione di E. coli Schema per la trasformazione di E. coli e eliminare sovranatante cellule Ancora competenti e ghiaccio plasmidio in ghiaccio (circa 1 h) per consentire la formazione dei ponti cellula batterica-Ca2+- DNA plasmidico 5) Selezione dei trasformanti: semina dei batteri su terreno selettivo deciso sulla base della resistenza portata dal plasmidio utilizzato (in genere ampicillina); il gene lacZ è usato per lo screening x-gal: bromo-cloro-indolil-galattopiranoside dei batteri che contengono plasmidi ricombinanti Qdi, alcuni batteri ampR avranno ricevuto il plasmide con inserito il DNA e altri avranno ricevuto il plasmide senza il DNA inserito; come distinguere questi 2 gruppi? 6) Creazione di una banca dei trasformanti: costruzione di una banca genomica (o libreria): collezione dei cloni trasformati con vettori contenenti frammenti di diverse dimensioni del genoma studiato  ALTRI VETTORI GENICI I COSMIDI ibridi, possono essere impaccati nelle teste del fago lambda e dopo trasduzione in un batterio sensibile a lambda i cosmidi ibridi possono replicarsi nel batterio come un plasmidio e sono selezionati mediante antibiotico resistenza codificata dal cosmide. Questi vettori consentono il clonagggio di frammenti di DNA fino a 52 Kb I CROMOSOMI BATTERICI ARTIFICIALI (BAC), sono vettori costruiti originariamente dal plasmide F e possono contenere frammenti molto grandi di DNA, lunghi fino a 300 Kb. Sono plasmidi a singola copia con propria origine di replicazione (ori). Possono essere introdotti in E coli mediante elettroporazione. Gli YAC: cromosomi artificiali di lievito; hanno le caratteristiche comuni a tutti i cromosomi eucariotici cioè telomeri, centromeri, ed una o più origini di replicazione. Contengono uno o più siti di restrizione per l'inserimento di DNA esogeno da clonare. Hanno la capacità di contenere inserti di DNA, che potenzialmente possono arrivare anche a 1400 kb VETTORI DI ESPRESSIONE  Come faccio a essere sicuro che il gene si sia inserito nel verso giusto? ATG Sequenze di regolazione della trascrizione e traduzione Trasformazione delle cellule vegetali: un accenno Il sistema più utilizzato per trasferire geni nelle piante si basa sul plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens (Tumor-inducing, 200-800 Kb) PLASMIDE Ti Processi principali implicati nella trasformazione delle piante in natura mediante l’infezione di Agrobacterium tumefaciens 20 Kb 170 Kb Resistenza alla igromicina  Per la trasformazione con Agrobacterium si utilizzano piccoli espianti di tessuti: foglie, fusto, radici, gemme, cotiledoni, embrioni immaturi, da cui verrà rigenerata l’intera pianta hygromycin hygromycin Passaggi per la trasformazione delle piante con A. tumefaciens 1. Propagare il vettore binario in E. coli 2. Isolare il vettore binario da E. coli e ingenierizzarlo (introdurre un transgene) 3. Re-introdurre il vettore binario ingenierizzato in E. coli per amplificarlo 4. Isolare il vettore binario ingenierizzato e introdurlo in un ceppo di Agrobacterium contenente un plasmide Ti disarmato 5. Infettare i tessuti della pianta con Agrobacterium ingenierizzato (il T-DNA contenente il transgene verrà inserito nel genoma della cellula della pianta) Igromicina o erbicida