Genetica I PDF - Giampiero Valè

GENETICA I Giampiero Valè Teoria cromosomica dell’ereditarietà, concatenazione e ricombinazione Crossing-over meiotico Mappatura dei geni negli organismi diploidi Distanza di mappa e costruzione di mappe genetiche  TEORIA CROMOSOMICA DELL’EREDITARIETA’...

GENETICA I Giampiero Valè Teoria cromosomica dell’ereditarietà, concatenazione e ricombinazione Crossing-over meiotico Mappatura dei geni negli organismi diploidi Distanza di mappa e costruzione di mappe genetiche  TEORIA CROMOSOMICA DELL’EREDITARIETA’ In qs incrocio nn sono attese femmine Occhi rossi: dominante 1) 3) XwXw occhi bianchi, ma un po’ ne saltano fuori XWY XWXW XwY XWXw 2) XwY Femmine:XWXw Maschi XWY Femmine:XWXw Maschi:XWY Ottiene femmine con occhi bianchi Aumenta il numero di progenie e osserva con bassa frequenza (1/2000) femmine occhi bianchi e maschi occhi rossi Spiegato da non- No femmine con occhi bianchi disgiunzione alla (carattere legato al sesso) meiosi del chr X Errori di non-disgiunzione alla prima e alla seconda divisione meiotica Da questo incrocio è atteso che tutte femmine abbiano occhi rossi e maschi occhi bianchi; la osservazione di femmine occhi bianchi (e maschi occhi rossi) unita a osservazioni citologiche hanno permesso di provare che le alterazioni erano dovute a variazioni cromosomiche: i geni sono sui cromosomi Femmine XXY hanno 2 chr X che portano allele w mutato ed hanno occhi bianchi  CROSSING OVER E RICOMBINAZIONE Il crossing over ha luogo in profase I della meiosi quando i cromosomi omologhi si appaiano (sinapsi) La sinapsi è accompagnata dalla formazione di una struttura proteica tra i cromosomi appaiati: complesso sinaptinemale  La ricombinazione del DNA: modello di crossing over E’ un eterozigote per 2 caratteri 1) Molecole di DNA a doppio filamento (cromatidi) allineate 2) In una delle due molecole si verifica una rottura a doppio filamento 3) Una esonucleasi (5’ 3’) rimuove nucleotidi dal punto di rottura, generando DNA a singolo filamento su ciascun lato 4) Un’estremità 3’ libera invade l’altra molecola di DNA rimasta intatta. Il filamento allontanato forma una struttura ad anello (D-loop) 5) A partire dalle estremità 3’ ha luogo la sintesi del DNA, utilizzando come stampo i filamenti complementari intatti. La regione di appaiamento tra i singoli filamenti provenienti dalle due molecole di DNA è detta regione eteroduplex 6) L’unione dei filamenti produce due giunzioni di Holliday che possono migrare, estendendo la regione di DNA eterodupex anche per migliaia di basi 7) La rottura nei punti di giunzione può generare i due cromatidi ricombinati  Remind: Assortimento indipendente in un diibrido RRGG X rrgg Autofecondazione del diibrido Principio dell’assortimento indipendente: durante la meiosi ogni coppia di omologhi segrega A B A b indipendentemente dalle altre coppie di omologhi a b a B Remind 2: Assortimento indipendente in un diibrido NB: nell’assortimento 1/4 1/4 1/4 1/4 indipendente, le frequenze dei gameti parentali e ricombinanti sono uguali. RELAZIONI TRA CONCATENAZIONE (ASSOCIAZIONE FISICA TRA DUE GENI) E RICOMBINAZIONE Terminologia e concetti della segregazione non- indipendente Geni localizzati sullo stesso cromosoma: geni concatenati o associati e appartengono allo stresso gruppo di associazione o linkage group Individuo doppio eterozigote per due geni sullo stesso cromosoma: AaBb Individuo doppio eterozigote per due geni sullo stesso cromosoma: AaBb SEMPRE GAMETI PARENTALI!!! la frequenza di ricombinazione per due geni sullo stesso cromosoma sarà allora compresa tra: 0% e 50% 0% se i due geni non ricombinano tra loro (associazione o linkage) 50% se i due geni ricombinano sempre tra loro Segregazione non indipendente dei geni (1): esempio di una F2 Segregazione non indipendente dei geni (2): esempio di un reincrocio Geni autosomici, pr+ occhio rosso, pr occhio porpora vg+ ali normali; vg ali vestigiali (ridotte) Combinazione in cis: alleli Combinazione in trans: un dominanti su un solo parentale porta un allele parentale dominante e uno recessivo Come si generano le combinazioni ricombinanti?: F1 mediante crossing over Questa è segregazione indipendente, osservo 50% gameti parentali e 50% ricombinanti F1 di AABB x aabb F1 di AAbb x aaBB Qdi la definizione di ricombinanti o parentali dipende dalla configurazione degli alleli dei 2 geni nei parentali originali usati per incrocio In caso di linkage completo non si F1 da MMDD x mmdd F1 da MMDD x mmdd osservano ricombinanti L’allele responsabile delle foglie screziate (m) è recessivo rispetto all’allele che produce foglie normali (M). Molto vicino, sullo stesso cromosoma, un altro gene determina l’altezza della pianta: l’allele che causa il nanismo (d) è recessivo rispetto a quello che determina piante alte (D) Come mai in caso di geni associati le frequenze dei ricombinanti sono inferiori a quelle dei parentali?: non in tutte le meiosi avviene CO tra i geni considerati; sommando le situazioni A. e B. è evidente che la frequenza dei gameti parentali sia > ricombinanti F1 di AABB x aabb F1 di AABB x aabb  F1 da MMDD x mmdd Come mai le frequenze dei ricombinanti sono inferiori a quelle dei parentali?: un esempio con le piante Dal momento che ogni crossing-over produce metà gameti ricombinanti e metà non ricombinanti, la maggior parte dei gameti sarà non ricombinante FREQUENZA DI RICOMBINAZIONE, DISTANZA DI MAPPA E COSTRUZIONE DI MAPPE GENETICHE Frequenza di ricombinazione: rapporto tra la somma dei ricombinanti e numero totale osservazioni FR: (151+154)/2839 x 100= 10,7 FR: (157+146)/2325 x 100= 13,0  Utilizzo della Frequenza di ricombinazione per la costruzione di mappe genetiche Intuizioni e definizioni di Thomas Hunt Morgan (1866-1945): Più 2 geni sono distanti su un cromosoma, > è la P che tra di loro avvenga un CO La P di un evento di CO tra 2 geni può essere usata come misura della loro distanza Le frequenze di CO possono essere usate per definire la sequenza lineare dei geni su un cromosoma Porzione del cromosoma in cui si osserva in media 1 ricombinante ogni 100 gameti: unità di mappa o centiMorgan (cM)  Un esempio per definire ordine dei geni e loro distanze per la costruzione di mappe genetiche y w v m 1 cM 29,7 cM 3,0 cM Due considerazioni: 1) non siamo in grado di distinguere fra geni posti su diversi cromosomi e geni localizzati molto lontano sullo stesso cromosoma; 2) se due geni mostrano il 50% di ricombinazione, il massimo che possiamo dire è che appartengono a diversi gruppi di linkage, ma non se sono localizzati su cromosomi diversi o molto lontani sullo stesso cromosoma. Test del chi quadro per validare la concatenazione ipotesi zero (H0) è che i 2 geni sono indipendenti Chi quadro (3 GL) è significativo, rifiuto ipotesi zero (H0) Una procedura corretta richiede però che prima di verificare se i 2 geni sono concatenati, si verifichi che gli alleli dei 2 geni presi singolarmente segreghino come atteso in un test-cross: 1:1  Utilità di una mappa genetica 1) Consente di predire le frequenze dei gameti 2) Sebbene non ci sia correlazione tra distanze genetiche e fisiche, consente di conoscere l’ordine dei geni sui cromosomi Dimostrazione della base fisica della ricombinazione Mais con gene C (allele C colorato, allele c incolore) e gene Waxy (Wx e wx, seme ceroso) sul chr 9 La linea usata era doppio eterozigote in trans con 2 marcatori citologici alle estremità dei cromosomi: un rigonfiamento (knob) vicino al gene C e una traslocazione del chr 8 all’altra estremità CCwxwx X ccWxWx Derivato da  La ricombinazione avviene dopo la duplicazione dei cromosomi tra cromatidi non fratelli di cromosomi omologhi (quindi è vera la ipotesi B) In alcune specie di funghi i prodotti della meiosi restano uniti a gruppi di 4 detti tetradi e racchiusi in un asco: è possibile isolare le tetradi e studiare la struttura dei cromosomi presenti nelle 4 spore, che derivano dai corrispondenti 4 cromatidi meiotici Analisi delle tetradi ha provato che i CO avvengono allo stadio di 4 cromatidi, INFATTI SI ISOLANO TETRADI CHE CONTENGONO 2 SPORE DI TIPO PARENTALE E 2 DI TIPO RICOMBINANTE; SE LO SCAMBIO AVVENISSE PRIMA DELLA DUPLICAZIONE DEL DNA (STADIO DI 2 CROMOSOMI) SI POTREBBERO TROVARE SOLO 2 TIPI DI SPORE PER ASCO. REINCROCIO A TRE PUNTI  Reincrocio a tre punti per ordinare e calcolare distanze tra 3 geni concatenati: possibili CO Coppia di cromosomi omologhi di un individuo eterozigote per tre loci (Aa Bb Cc).  Reincrocio a tre punti per ordinare e calcolare distanze tra 3 geni concatenati NB1: LA SOMMA DELLE DISTANZE TRA VG E PR E TRA PR E B (12,3+6,5=18,8CM) È > A QUELLA CALCOLATA TRA VG E B (17,7CM): questo perché il calcolo della freq di ric non tiene in considerazione i CO multipli che possono avvenire nell’intervallo tra 2 geni; questo porta a una sottostima delle distanze genetiche NB2: La probabilità dei gameti che hanno subito doppi crossing- over fra vg e b, è uguale alla probabilità della ricombinazione fra vg e pr moltiplicata per la probabilità di ricombinazione fra pr ed b, vale a dire 0,123×0,065=0,00799. Moltiplicare questa probabilità per la numerosità totale della progenie ci fornisce il NUMERO ATTESO DI INDIVIDUI NEI CUI CROMOSOMI C’È STATO DOPPIO CROSSING-OVER: 0,00799 × 4197 = 33,5 MA QUELLI OSSERVATI SONO SOLO 22………………. Altro vantaggio del reincrocio a 3 punti: dal confronto tra le classi parentali (più frequenti) e quelle dei doppi ricombinanti (le meno frequenti) è possibile dedurre l’ordine dei geni: l’allele diverso tra classe parentale e quella dei doppio ricombinanti è l’allele del locus centrale, che risulta scambiato  Interferenza e coefficiente di coincidenza Interferenza: il fatto che sia avvenuto un CO in una data regione influenza la P che avvenga un CO in una regione adiacente; valutata dal rapporto tra frequenza doppi ricombinanti osservati e quelli attesi Frequenza attesa: 0,123 x 0,065= 0,008 Frequenza osservata: (13+9)/4197=0,005 Coefficiente di coincidenza: rapporto tra frequenza doppi ricombinanti osservati e quelli attesi Varia tra 0 e 1; nell’esempio: 0,005/0,008=0,625, significa che osserviamo solo il indica che l’interferenza 62,5% dei doppi ricombinanti attesi riduce del 37,5% la Interferenza: 1- Coefficiente di coincidenza: 1-0,625=0,375 percentuale di doppi ricombinanti osservati  Prodotti dei CO multipli NB questo non è tracciabile Il risultato complessivo è che, presi nel loro insieme, i tre tipi di doppio crossing-over producono una media del 50% di progenie ricombinante Funzioni di mappa matematiche: stabiliscono una relazione tra le frequenze di ricombinazione e le distanze genetiche reali fra i loci. Quindi le funzioni di mappa tengono conto che un evento di CO è raro, che si possono avere doppi CO ed eventualmente del grado di interferenza (se nota) per una data regione. Per livelli di ricombinazione (FR) elevati, la distanza in cM ottenuta tramite una funzione di mappa (curva blu) è superiore a quella che si stimerebbe mediante la semplice relazione FR=cM (retta rossa) Mappatura fisica mediante ibridazione di cellule somatiche Ottenimento di linee cellulari screening Mappatura utilizzando linee cellulari ibride con delezioni sui cromosomi  Mappatura per delezione Incrocio un individuo omozigote per una mutazione recessiva in un gene oggetto di studio con un individuo eterozigote per una delezione ADDENDUM LEZIONE III SU REINCROCIO A 3 PUNTI  PREMESSA I Dalla segregazione di due geni indipendenti si ottengono, nel tipo di incrocio mostrato in figura, quattro classi fenotipiche di cui due parentali e due nuove con rapporti tra le classi fenotipiche di 9:3:3:1  PREMESSA II COSA CAMBIA A) Se i due geni sono QUANDO I DUE GENI molto distanti tra loro CONSIDERATI SONO sul cromosoma, si SULLO STESSO assortiscono in modo indipendente, CROMOSOMA? formando 50% gameti parentali e 50% gameti ricombinanti B) Se i due geni sono associati (o in linkage) sul cromosoma, non segregano in modo indipendente e formeranno gameti ricombinanti con una frequenza compresa tra 0% (linkage completo) ed il 50% (soglia per assortimento indipendente); Individuo doppio eterozigote per due geni sullo stesso cromosoma: Frequenza di ricombinazione: rapporto tra fenotipi AaBb ricombinanti e totale dei fenotipi ottenuti  : Premessa III Il doppio CO è chiaramente un evento che ha frequenza minore rispetto ai singoli CO RICORDA: PjR pJr P J R 20,8 cM 10 cM  INTERFERENZA E COEFFICIENTE DI COINCIDENZA Coefficiente di coincidenza: rapporto tra frequenza doppi ricombinanti osservati e quelli attesi: 0,012/0,0208= 0,57 Interferenza: 1- Coefficiente di coincidenza: 1-0,57=0,43