Gènes des Immunoglobulines cours M1 PDF 2024/2025

Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 Gènes des Immunoglobulines Introduction Une immunoglobuline (Ig) est formée de 2 chaînes légères L identiques et de 2 chaînes lourdes H identiques; au niveau tridimensionnel, une chaîne d'Ig comprend 1 domaine variable V en...

Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 Gènes des Immunoglobulines Introduction Une immunoglobuline (Ig) est formée de 2 chaînes légères L identiques et de 2 chaînes lourdes H identiques; au niveau tridimensionnel, une chaîne d'Ig comprend 1 domaine variable V en N-terminal et 1 (pour la chaîne L) ou plusieurs (pour la chaîne H) domaine(s) constant(s) C en C-terminal. Les immunoglobulines sont synthétisées par les cellules de la lignée B. Elles sont membranaires (à la surface des lymphocytes B) ou sécrétées (par les plasmocytes). Figure 1 structure d'immunoglobuline 1  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 I. Questions historiques Dès que l'on a pu connaître les principales caractéristiques des immunoglobulines, se sont posées de nombreuses questions: A  La diversité des antigènes est extrême; pour y répondre, il faut une même diversité des immunoglobulines (soit 1011 à 1012 Ig différentes!), qui correspond à la diversité des acides aminés des parties N-terminales des chaînes L et H (c’est-à-dire des domaines variables).  Cela correspond-il à une extrême diversité des gènes responsables du codage des immunoglobulines? (modèle de la théorie germinale: 1 gène = 1 chaîne d'Ig; beaucoup de gènes seraient alors impliqués; ils proviendraient de la duplication de gènes ancestraux; mais le génome humain entier ne suffirait pas à coder toutes les immunoglobulines!).  Cela correspond-il à l'accumulation de mutations? (modèle de la théorie des mutations somatiques: peu de gènes seraient impliqués, mais de nombreuses mutations somatiques interviendraient ensuite pour assurer la diversité des immunoglobulines produites; mais ce modèle heurtait les principes de la génétique couramment admis).  Cela correspond-il à un mécanisme spécifique aux gènes des immunoglobulines? B Une cellule B, au cours de sa différenciation, produit d'abord des immunoglobulines membranaires à la surface du lymphocyte B, puis des immunoglobulines sécrétées par le plasmocyte. La séquence en acides aminés des chaînes lourdes des Ig membranaires et 2  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 sécrétées diffèrent seulement à leur extrémité C terminale: les mêmes gènes sont-ils impliqués dans les 2 cas? C  Une cellule B exprime d'abord des IgM à sa surface puis, au cours de sa différenciation, pourra exprimer une autre classe d'Ig (IgG, IgE ou IgA) (ce mécanisme est appelé commutation de classe ou 'switch' d'isotype): comment se fait cette commutation? Comment expliquer que, quelle que soit la classe d'immunoglobuline produite, le même domaine variable spécifique d'antigène donné (même idiotype) soit exprimé? D  Une cellule B synthétise 1 seul type de chaîne lourde et de chaîne légère alors que son génome comporte 2 chromosomes (2 allèles) pour chaque locus Ig; il y a donc exclusion allélique et phénotype hémizygote; comment se produit cette exclusion allélique?  Enfin, si les régions variables subissent des mutations, pourquoi n'y en a-t-il pas dans les régions constantes?  L'utilisation de différentes méthodes de biologie moléculaire et le clonage des gènes chez la souris et chez l' homme ont permis de répondre à ces questions; nous nous limiterons aux immunoglobulines humaines. II. Réponses Les chaînes légères Kappa et Lambda et les chaînes lourdes des Ig sont codées indépendamment par trois gènes situés sur des chromosomes différents. Chacun de ces gènes comprend un grand nombre de segments codant pour les régions variables et un nombre plus limité pour les régions constantes. Les régions variables des chaînes légères Kappa et Lambda sont formées à partir de deux segments de gènes VL et JL. Les régions variables des chaînes lourdes à partir de trois segments VH, D et JH. Dans chaque gène, il existe une bibliothèque de plusieurs centaines de segments VH et VL et d'une dizaine de segments D et J (H ou L). Ces parties variables s'associent à un segment de gène codant pour une partie constante. Dans le cas des chaînes lourdes, une combinaison VH-D-JH peut s'associer à un gène constant μ aboutissant à la synthèse d'une chaîne lourde μ ou après un nouveau réarrangement avec un autre gène constant, pour donner naissance à une chaîne lourde d'un autre isotype. La diversité des anticorps est expliquée par plusieurs mécanismes : a) les réarrangements des segments codant pour les parties variables (en rapport avec l'existence de très nombreux segments, et l'imprécision des jonctions entre ces segments) ; b) la combinaison des chaînes lourdes et légères entre elles ; c) l'existence de mutations somatiques dans l'ADN codant pour les régions variables des chaînes lourdes et légères. 3  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 II.1. Chaînes légères (kappa ou lambda) II.1.1. Chaîne kappa: Réarrangements V-J  Gènes IGK (kappa) sur le chromosome 2 en 2p11.  Multiples gènes IGKV pour la région variable V (76 gènes, dont 31 à 35 sont fonctionnels); 5 gènes IGKJ pour la région jonctionnelle J; un seul gène IGKC pour la région constante C; les gènes V, J et C sont séparés dans l’ADN génomique (configuration 'germline' des gènes des Ig).  Il s'agit de familles multigéniques (voir aussi le paragraphe sur les familles de gènes, dans Gènes de la globine).. des duplications du gène anctre se sont succédées, et des mutations sur chacun des gènes ont assuré une certaine diversité. Parmi ces gènes dupliqués, beaucoup sont fonctionnels...").  Il y a d'abord réarrangement de l'ADN: permet de joindre 1 V et 1 J; les séquences intermédiaires sont délétées,  Puis copie de l'ARN pré-messager (transcription) qui comporte des introns,  Puis épissage ('splicing'): élimination des introns de l'ARN prémessager et obtention de l'ARN messager mature,  Puis synthèse protéique (traduction ou 'translation').  Note: Il est capital de ne pas confondre réarrangements de l'ADN et épissage de l'ARN. NOTE: Seuls les gènes des immunoglobulines et des récepteurs T subissent des réarrangements de l'ADN.  Les réarrangements V-J se font au niveau des séquences de recombinaison (RS: 'recombination signal') qui comportent une séquence heptamère (7 nucléotides) et une séquence nonamère (9 nucléotides), séparées par un espacer. Chaque gène IGKV est suivi en aval (en 3') d'un RS comprenant un heptamère CACAGTG, puis un espaceur de 12 bp, puis un nonamère ACAAAAACC. Chaque gène IGKJ est précédé en amont (en 5') d'un RS comprenant, de 5' en 3', un nonamère GGTTTTTGT, un espaceur de 23 bp et un heptamère CACTGTG. II.1.2. Chaîne lambda: Réarrangements V-J  Gènes IGL (lambda) sur le chromosome 22 en 22q11; même mécanisme de réarrangement V-J que celui décrit pour les gènes IGK: les réarrangements ont lieu entre l'un des 29 à 33 gènes IGLV fonctionnels et un gène J; à noter qu’il existe 4 à 5 gènes IGLC fonctionnels, précédés chacun d' un gène IGLJ. II.1.3. Exclusion allélique et isotypique 4  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025  L'exclusion allélique s'explique d'une part par la chronologie des réarrangements, et d'autre part par l'expression en surface d'une immunoglobuline fonctionnelle, laquelle inhibe les réarrangements et donc l'expression d’une seconde chaîne. Un seul chromosome 14 et un seul chromosome 2 (ou 22) sont donc productifs (réponse à la question D). II.2. Chaînes lourdes  Gènes IGH ('heavy') sur le chromosome 14 en 14q32. II.2.1. Réarrangements V-D-J Réarrangements de l'ADN entre l'un des 38 à 46 gènes variables IGHV fonctionnels, l'un des 23 gènes de diversité IGHD fonctionnels, et l'un des 6 gènes de jonction IGHJ fonctionnels: il existe ici aussi des RS qui sont localisés en aval (en 3') des gènes V, de part et d' autre des gènes D et en amont (en 5') des gènes J. Lors d’un réarrangement V-D-J, il y a d'abord jonction d' 1 D et d' 1 J, puis jonction d' 1 V au complexe D-J.  Note: il existe, de plus, 2 ou 3 cadres de lecture ouverte des gènes D; donc chacun peut coder 2 ou 3 séquences peptidiques différentes. Les jonctions V-D-J sont aussi caractérisées par des délétions de nucléotides (par une exonucléase) et par l'ajout de nucléotides au hasard (gr'ce à la dTT, désoxynucléotidyl transférase terminale); les régions N qui en résultent ne sont donc pas codées dans le génome de l'individu et augmentent considérablement la diversité des jonctions V-D-J des domaines variables des chaînes lourdes des immunoglobulines. II.2.2. Commutation de classe  Dans le lymphocyte pré-B, il y a d'abord synthèse d'une chaîne mu, car le gène constant IGHM (C) est situé à proximité du réarrangement V-D-J. Cette chaîne mu est associée à la pseudo-chaîne légère et l'ensemble constitue le récepteur pré-B. La première Ig complète synthétisée par le lymphocyte B est une IgM où la chaîne mu est associée à une chaîne légère kappa ou lambda.  Au cours de sa différenciation, le lymphocyte B peut exprimer une autre classe ou sous-classe d'Ig. Ceci nécessite le remplacement d'un gène IGHC par un autre, par recombinaison de l'ADN (commutation de classe ou 'switch'), avec excision de toute la partie intermédiaire sous forme d'une boucle de délétion. Cette excision se fait au niveau des séquences switch (rôle apparenté à celui des RS).  Puis, le déroulement habituel: synthèse de l'ARN prémessager, épissage des introns aboutissant à l’ARN mature, puis synthèse protéique.  Ceci explique 1) qu'un lymphocyte B puisse d'abord synthétiser une IgM puis, au cours de sa différenciation, une IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), une IgA (IgA1 ou 5  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 IgA2) ou une IgE, et 2) qu'il garde le même réarrangement V-D-J et donc le même site de reconnaissance de l'antigène (idiotype) (réponse à la question C). II.3. Ig membranaires et Ig sécrétées Un épissage alternatif de l'ARN prémessager de la chaîne lourde permet d'obtenir soit une chaîne lourde membranaire (Ig membranaire des lymphocytes B), soit une chaîne lourde sécrétée (Ig sécrétée des plasmocytes) qui gardent le même réarrangement V-D-J (idiotype) et la même région constante (isotype) (réponse à la question B).  Note: un mécanisme identique (épissage alternatif d'un pré-messager) permet d'exprimer des IgM et des IgD dans une même cellule B (cas des cellules B matures qui quittent la moelle osseuse et gagnent les ganglions lymphatiques par la circulation). III. Conclusions III.1. Diversité germinale ('germline'): familles multigéniques  La diversité 'germline' dépend du nombre de gènes à chaque locus. Il s'agit de familles de gènes, offrant une possibilité de choix entre séquences fonctionnelles proches. De possibles recombinaisons intergéniques permettent, à long terme, l'évolution du locus avec duplication ou délétion de gènes.  Ces gènes sont l'objet de conversions et de recombinaisons intragéniques, assurant le brassage et la diversité (polymorphisme) entre individus.  L'existence de plusieurs cadres de lecture ouverte ('open reading frame'), dans le cas des gènes IGHD, augmente encore la possibilité de choix entre séquences fonctionnelles proches. III.2. Diversité due aux réarrangements de l'ADN  La diversité combinatoire -au sens mathématique du terme- permet la synthèse potentielle d'un million d'immunoglobulines. En effet, les gènes IGH permettent la synthèse d’environ 6000 chaînes lourdes, les gènes IGK ou IGL d'environ 160 chaînes légères, ce qui correspond à près de un million de combinaisons possibles (6 x 10 3 x 160).  A cela s’ajoutent, lors des réarrangements IGH des chaînes lourdes, l'acquisition de régions N, et l'utilisation de l'un ou l'autre cadre de lecture des gènes D au niveau des jonctions V-D-J, et lors des réarrangements IGK ou IGL des chaînes légères, une flexibilité des jonctions V-J. Ces mécanismes contribuent à augmenter la diversité d'un facteur 103 III.3. Diversité par hypermutations somatiques 6  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 Enfin, des mutations somatiques très nombreuses (hypermutations somatiques) caractérisent de manière très ciblée les gènes réarrangés V-J et V-D-J des Ig, mais leur mécanisme d'apparition n'est pas encore connu. L'AID (activation-induced cytidine deaminase) serait impliquée à la fois dans l'apparition des mutations et le mécanisme de switch. Les mutations apparaissent au cours de la différenciation du lymphocyte B dans les ganglions lymphatiques et contribuent à augmenter la diversité des Ig par un facteur supplémentaire 103, ce qui permet d'atteindre une diversité potentielle de 1012 Ig différentes (réponse à la question A). Ces différents mécanismes de diversité permettent d’obtenir 1012 immunoglobulines différentes, capables de répondre aux quelques millions d'antigènes connus (réponse à la question A). Le nombre d'Ig différentes est en fait limité par le nombre de cellules B dans une espèce donnée. 7  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 8  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 9  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 Les étapes de recombinaison VDJ 1. Le clivage de la boucle d’ADN nécessite deux enzymes RAG1 et RAG2 (Recomination Activating Gene) 2. Le complexe RAG coupe l’ADN á l’extrémité 5’ de la séquence signal ce qui aboutit a la délétion de la boucle d’ADN. 3. Le complexe RAG1-RAG2 coupe l’ADN et laisse un groupement OH-3’ et le bout de chaque segment reste libre. 4. Ce groupement OH hydrolyse le pont phosphodiester ce qui scelle á nouveau le double brin pour créé une structure appelé épingle a cheveux 5. d’autre protéine Ku70, Ku 80 et l’ADN dependant kinase se lie au complexe RAG et clivent au hasard l’épingle a cheveux et libèrent une extrémité ADN double brin. 6. Cette extrémité est ensuite modifiée par l’TdT (désoxy- nucléotidyle ransferase terninal) une enzyme qui va rajouter des séquences nucléotidiques au hasard. 7. Une exonucléase élimine ensuite les nucléotides inappropriés 8. L’ADN ligase relie les deux extrémités des segments de gènes pour former la jonction codante et les extrémités SSR pour former le signal de jonction. 10  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 Réarrangement des gènes au cours de la maturation des lymphocytes T : Les gènes du TCR : Les segments géniques du TCR sont situés sur les chromosomes suivants : - La chaine β sur le chromosome 7q34. - La chaine α sur le chromosome 14 - La chaine δ sur le chromosome 14 (entre les régions variables et les jonctions de la chaine α) - La chaine γ sur le chromosome 7q14 - Il existe deux types de récepteurs sur les lymphocytes T le TCR αβ et TCRγδ. - Les deux types de récepteurs diffèrent par : * les types d’antigènes qu’ils reconnaissent * le profil d’expression des corécepteurs CD4 et CD8 * la distribution histologique dans la périphérie. - Les deux lignées divergent á partir d’un précurseur commun après certains réarrangements de gènes. - Les premières cellules T á apparaître dans le développement embryonnaire porte des TCR γδ. - Les cellules á TCR γδ apparaissent par vague discontinu et colonisent des endroits différents á chaque poussée. La première vague des cellules TCRγδ peuple l’épiderme, la seconde vague se localise dans l’épithélium du tractus génital…etc - Toutes les cellules á chaque poussée utilisent les mêmes régions variables Vγ et Vδ (chaque vague utilise une gamme différente de gènes V, D et J). Il n’y a pas de nucléotides N contribuant á la diversité additionnelle entre les segments V, D et J. Ce qui est lié á l’absence de l’enzyme TdT dans les cellules fœtales. - Après ces vagues les cellules T αβ prédominent et représentent plus de 95% de lymphocytes 11  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 - Les T γδ produit a ce stade sont différentes des vagues précoces. Elles possèdent un répertoire plus varié pour lequel de nombreux segments de gènes V différents sont utilisés et les séquences du récepteur possèdent de nombreuses additions de N nucléotides. - L’engagement de la cellule á la lignée γδ dépend d’un réarrangement productif d’un gène γ et d’un gène δ conduisant á l’expression d’un TCR γδ fonctionnel. - Les cellules T matures γδ peuvent avoir réarrangé correctement leurs gènes de chaines β (les cellules á TCR αβ matures contient souvent des gènes γ réarrangés mais la plupart avec un décalage de phase). - Ces cellules réarrangent la chaine β qui se lie á une chaine α substitut formant le préTCR, il semble que les signaux transmis par le préTCR engagent la cellule vers la lignée αβ. - Les cellules γδ qui portent un réarrangement productif de gènes β s’engagent vers la lignée γδ car elles ont reçu un signal d’un récepteur γδ assemblé avant d’avoir assemblé un pré TCR αβ fonctionnel. - Les gènes de la chaine β se réarrangent d’abord avec les segments J β et D β puis DJ s’associe avec Vβ. - La chaine β est exprimé á la surface avec une chaine invariant pTα et les molécules CD3. - L’expression du préTCR assure la dégradation de RAG2 ce qui stoppe le réarrangement des chaines β et assure ainsi l’exclusion allélique du locus β. - Prolifération et expression du CD4 et CD8. - Durant la phase de prolifération déclenchée par l’expression du récepteur pré TCR, les gènes RAG1 et RAG2 sont ainsi réprimé, donc aucun réarrangement au locus de chaine α ne se produit jusqu'à ce que la phase de prolifération se termine. - Les gènes RAG1 et RAG2 sont a nouveau transcrit et l’hétérodimère fonctionnel RAG1, RAG2 s’accumulent, cela garantit que toute cellules dans lesquelles un gène de chaine β a été correctement réarrangé donne naissance á beaucoup de thymocytes double positifs CD4 + CD8+ une fois que ces cellules arrêtent de se diviser chacune d’elle peut indépendamment réarranger ses gènes de chaine α différentes dans les cellules de la descendance. - Le réarrangement se fait dans l’ordre : V-J- puis VJ-C. 12  Cours d’immunologie M1 par Melle ZEGHINA I. 2024/2025 -Les réarrangements des gènes de chaine α élimine tous les segments de gène δ sur le chromosome bien qu’ils soient retenus sous forme d’ADN circulaire. - Comme pour les chaines légères des immunoglobulines plusieurs tentatives de réarrangement sont possibles. La cellule montre des réarrangements en phase sur les deux chromosomes et peut ainsi produire les deux types de chaine α. Ce ci est possible car contrairement à la cellule B l‘expression du récepteurs de la cellule T ne suffit pas pour stopper le réarrangement de la chaine légère. - Seule le récepteur qui a une bonne affinité aux molécules CMH sera retenu. -La régulation du réarrangement par la sélection positive assure donc que chaque cellule T aura une seule spécificité fonctionnelle. 13