Ingegneria Genetica e Terapia Genica PDF

[INGEGNERIA GENETICA E TERAPIA GENICA] ================================================== Ingegneria genetica =================== - Tecnologie essenziali nello studio del DNA (clonaggio genico, tecnologia ad array, NGS) ========================================================================...

[INGEGNERIA GENETICA E TERAPIA GENICA] ================================================== Ingegneria genetica =================== - Tecnologie essenziali nello studio del DNA (clonaggio genico, tecnologia ad array, NGS) ======================================================================================= - Test genetici ============= - Prodotti DNA ricombinante per uso terapeutico (farmaci a piccole molecole, anticorpi monoclonali, target therapy) ================================================================================================================= Terapia cellulare e genica ========================== - Cellule staminali ================= - Terapia genica ============== - Editing genomico (es. CRISPR) ============================= [Evoluzione delle biotecnologie] ============================================ - TRADIZIONALI: Basate sulla selezione di organismi già disponibili in natura, Es. Produzione di bevande alcoliche, pane, yogurt, formaggi o selezione di specie animali e vegetali ================================================================================================================================================================================= - MODERNE: Basate sulla modifica di singoli geni come Ingegneria genetica, Editing genomico, Sequenziamento, Biologia sintetica. In questi casi sono necessarie le riflessioni su biosicurezza, etica e morale ============================================================================================================================================================================================================ Dna come mezzo con cui si trasferisce informazioni genetiche, modello a doppia elica di Watson e crick, in anni 70 primi DNA ricombinanti, poi si possono ottenere anche anticorpi monoclonali, dopo sequenziamento del genoma umano si è passati alla clonazione (Dolly), ora la CRISPR sta rivoluzionando. ============================================================================================================================================================================================================================================================================================================ [Biotecnologie per la terapia medica] ================================================= - Farmaci a piccole molecole: screening e sviluppo di nuovi bersagli farmacologici ================================================================================ - Produzione di anticorpi geneticamente modificati ================================================ - Produzione di proteine ricombinanti ad uso terapeutico (es. insulina o per proteine del latte) ============================================================================================== - Produzione di vaccini geneticamente modificati ============================================== - Produzione di reagenti per la terapia genica ============================================ - Modificazioni genetiche di cellule per terapia cellulare (cellule staminale importanti anche modelli 3D per differenziazione) ============================================================================================================================= - Analisi del genotipo di pazienti nella medicina di precisione ============================================================= Era genomica ============ - - - - - - TARGET THERAPY - - - 1. 2. 3. - 1. 2. - APPLICAZIONI: ============= - - - - PRODOTTI DEL DNA RICOMBINANTE USATI IN MEDICINA =============================================== - - CLONAGGIO IN UN SISTEMA CELLULARE ================================= Nel **clonaggio genico**: ------------------------- - - - - - - - - - - 1. 2. 3. 4. 5. 6. - - - - - SCELTA DEL VETTORE DI CLONAGGIO =============================== - - - 1. 2. 3. DIGESTIONE ENZIMATICA CON ER ============================ CLONAGGIO CON ESTREMITÀ COESIVE =============================== - - - - - CLONAGGIO CON ESTREMITÀ PIATTE: =============================== #### #### ng inserto: ng vettore = Kb inserto: Kb vettore. INTRODUZIONE DEL VETTORE RICOMBINANTE NELLA CELLULA OSPITE ========================================================== - - - - - - - - - - - - - PIASTRAMENTO: ============= SELEZIONE DEI CLONI RICOMBINANTI ================================ 1. 2. 3. 1. 2. - FALSI POSITIVI (colonie bianche ma senza inserto): sono le colonie bianche che contengono vettori vuoti. È sufficiente la delezione anche di una sola base per modificare lo schema di lettura della proteina, facendo perdere l'attività enzimatica. - FALSI NEGATIVI (colonie blu che in realtà hanno l'inserto). Se l'inserto da clonare è piccolo e risulta inserito in registro con lo schema di lettura della ß-galattosidasi, si può formare una proteina di fusione parzialmente o totalmente attiva. In questo caso, un clone ricombinante con un inserto correttamente inserito, manterrà comunque attività ß-galattosidasica e produrrà colonie blu. - - - - - - - DOMANDE: ======== 1. 2. 3. 4. 5. - Ori (origine di replicazione indipendente) - Marcatore di selezione (es. resistenza a un antibiotico) - Regioni eliminabili per inserire il gene nella sequenza - Siti di taglio riconosciuti da ER - Sistema di trasferimento genico nell'ospite - Essere facilmente separati e purificati dal DNA cromosomico - I vettori plasmidici non sono in grado di accettare frammenti troppo grandi di inserto (max 5-10Kb). - Quando aumentano le dimensioni dell'inserto, i metodi classici di trasformazione batterica non hanno un'efficienza elevata, per cui è difficile inserire il plasmide ricombinante all'interno di una cellula batterica ospite. 1. 2. - - - - - #### #### **PACKAGING IN VITRO FAGO λ** - - - - - - - - LIMITI ====== 1. 2. 3. 4. ### ### **I COSMIDI** QUAL È IL LIMITE DEI COSMIDI? ============================= ### ### **CROMOSOMI ARTIFICIALI (AC)** - **BAC**➞ possiamo clonare 200 kb - **PAC**➞ possiamo clonare 70/95 kb (il doppio rispetto a un cosmide) - **YAC**➞ possiamo clonare 500kb e oltre, anche 2 mb. - ***[Vettore Bac (bacterial artificial chromosome)]*** - **oriS**: è l'origine di replicazione, replicare indipendentemente dalla cellula ospite. Quindi ha una propria origine di replicazione come i palsmidi; - **Gene di resistenza**: in questo caso è il cloramfenicolo (antibiotico che consente la selezione dei cloni ricombinanti); - **Geni PAR A e PAR B** (in verde e in viola): servono a mantenere un solo vettore per cellula e mantenere stabile l'inserto clonato all'interno del vettore BAC; - **Gene repA**: serve per la replicazione del vettore e regolare il numero di copie ovvero mantenere basso il numero di copie all'interno della cellula ospite; - **sito di clonaggio Polylinker**: in cui noi abbiamo una serie di enzimi di restrizione (cerchiati in rosso) che possiamo usare per il clonaggio del nostro inserto. #### #### **Vettore PAC (P1 ARTIFICIAL CHROMOSOME)** ### ### **CLONAGGIO CON IL VETTORE YAC** LIMITI ====== ### **Trasformazione vs infezione** ### Queste sono colonie batteriche che crescono su agar contente antibiotico, sono presenti placche di lisi. È un tappeto batterico in cui è stata provocata la lisi del batterio dalla particella fagica. ### **CELLULE OSPITI DI CLONAGGIO:** - Le cellule che servono per il clonaggio devono fornire un ambiente adatto al vettore, esso deve inserirsi e replicare facilmente all'interno della cellula; - La cellula deve riprodursi facilmente, velocemente e a basso costo; - Devono avere mutazioni compatibili con i geni marcatori. Se utilizzo il marcatore di resistenza all'ampicillina, il ceppo ospite deve essere sensibile ad essa altrimenti non avremo metodi di selezione. - Devono essere geneticamente stabili quindi dare origine a bassa frequenza di mutazione; - Non devono produrre enzimi di restrizione, ma li dobbiamo fornire noi dall'esterno (ceppi che non siamo in grado di produrre enzimi di restrizione); - Non devono essere patogeni per l'uomo. Partendo dai batteri possiamo utilizzare i lieviti e cellule eucariotiche ospiti di clonaggio. ### ### **APPLICAZIONI DEL CLONAGGIO** ### ### **VETTORI DI ESPRESSIONE** - - - - #### **IBRIDAZIONE E TECNOLOGIA AD ARRAY** ### [L'altra caratteristica particolare che posso sfruttare è] [che cambiando le condizioni di ibridazione posso] [cambiare anche lo scopo che devo ottenere]. IBRIDAZIONE STANDARD ==================== IBRIDAZIONE INVERSA =================== PERCHÉ NASCONO GLI ARRAY? ========================= CONFRONTO TRA NORTHERN BLOT E ARRAY A cDNA ========================================== - - - - VANTAGGI DELLA TECNOLOGIA AD ARRAY ================================== - è un metodo rapido che può essere anche automatizzato; - permette di fare screening su un grande numero di geni; - posso vedere l'espressione genica di geni diversi dallo stesso esperimento; - permette di definire nuove funzioni geniche; - La marcatura non è radioattiva per cui non è tossica per l'operatore. TIPOLOGIE DI ARRAY ================== MICROARRAY ========== - - - **BERSAGLIO**: cDNA o DNA genomico marcati in fluorescenza ---------------------------------------------------------- FUNZIONAMENTO DEGLI ARRAY ========================= 1. 2. 3. 4. 5. - - - - - - - APPLICAZIONE DELL'ARRAY NELL'ESPRESSIONE GENICA =============================================== ARRAY DI ESPRESSIONE COMPARATA ============================== - - ARRAY DI ESPRESSIONE ==================== VARIABILITA' DEI DATI MICROARRAY ================================ - I livelli di mRNA non sempre correlano con i livelli di proteina - Varianti geniche di splicing a volte comportano che non tutti i geni siano accuratamente misurati; quindi, possono esserci sottostime - Nel campo tumorale, modifiche post-traduzionali di una proteina possono contribuire alla patologia - Ciascuna cellula mostra un set diverso di proteine, e le proteine tradotte di una cellula variano in funzione del tempo PASSARE A UN LIVELLO SUCCESSIVO DI ANALISI ANALIZZANDO PROTEINE =============================================================== - - - - - - - - - - CITOGENETICA MOLECOLARE ======================= CGH COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION ===================================== - - - - - - - - - - - - BENIGNE: Causano variabilità genotipica, modificano la risposta individuale ai farmaci - PATOGENETICHE: Predispongono o causano malattie genetiche  ======================================================================================================================= CLASSIFICAZIONE CARCINOMA MAMMARIO ================================== ARRAY PROTEICI ============== - - - ARRAY DI ANTICORPI ================== ARRAY DI ANTIGENI ================= TEST A SANDWICH =============== ARRAY CHIP-ON-CHIP ================== È una tecnica che combina l\'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con la tecnologia dei microarray (Chip). ChIP è una metodica per isolare proteine legate al DNA attraverso l\'uso di ============================================================================================================================================================================================= anticorpi specifici. ChiP-on-chip serve a scoprire interazioni proteine/DNA per lo studio di: fattori di trascrizione, proteine correlate alla replicazione del DNA, istoni, modifiche istoniche. ================================================================================================================================================================================================= Questioni interessanti: ======================= - Determinare se una determinata proteina (es. fattore trascrizione) si lega ad una specifica sequenza di DNA =========================================================================================================== - Investigare il legame delle proteine a stati diversi del DNA (in soluzione o assemblato in cromatina) ===================================================================================================== - Testare specifici geni bersaglio per trovare elementi di regolazione ==================================================================== Prima si fa immunoprecipitare la cromatina. Quindi si ha la formaldeide che stabilizza il legame tra la proteina e il dna. Poi si frammenta il DNA (sonicazione) e si usano anticorpi specifici contro la proteina e quindi precipita per il legame antigene anticorpo. ======================================================================================================================================================================================================================================================================= ChIP-seq fornisce una migliore risoluzione e maggiori dettagli e sta sostituendo ChIP-on-chip. ============================================================================================== Importante tutto ciò per arrivare alla target therapy. ====================================================== [NGS: NEXT GENERATION SEQUENCING] ============================================= - - - - - 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. PREPARAZIONE DELLA LIBRARY: =========================== - - - - - - - - - - - Sequenziamento mirato di singoli geni oppure pannelli di geni (Target o Panel NGS testing) - Sequenziamento esoma clinico (Clinical exome sequencing)
solo esoni di geni noti associati a malattia - Sequenziamento intero esoma (Whole exome sequencing; WES) - Sequenziamento genoma (Whole genome sequencing, WGS) - PCR, si isola solo ciò che è amplificato, ma vi possono essere molti errori - Cattura di ibridi, dopo frammentazione di genoma si hanno delle sonde biotilinate che si legano solo ai geni di interesse, poi si mette tutto a contatto con delle biglie magnetiche ricoperte di streptadivina che riconosce la biotina e cattura le parti d'interesse, poi si fa il lavaggio e rimane solo ciò che si voleva analizzare - - - - - - - - - LIMITI: ======= - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - **Vantaggi della diagnosi genetica preimpianto tramite NGS:** ------------------------------------------------------------- - Screening simultaneo sia di aneuploidie che di malattie monogeniche ------------------------------------------------------------------- - - - - VANTAGGI NGS: elevate prestazioni, alta velocità, riduzione dei costi, quantità minima di campione ================================================================================================== LIMITI NGS: =========== - - - - -  ======================================================================================================================= TIPOLOGIA DEI TEST GENETICI =========================== - - - - - - - - - TEST GENETICI DI CARATTERE NON-MEDICO ===================================== - - - - CARATTERIZZAZIONE VARIABILITA' INDIVIDUALE ========================================== TEST DI IDENTIFICAZIONE PERSONALE ================================= TEST PER LA CARATTERIZZAZIONE DELLA VARIABILITA' INDIVIDUALE: QUANDO, A CHI? ============================================================================ TEST GENETICI DIRETTI RIVOLTI AI CONSUMATORI ============================================ Test commerciali e crimini 'cold case' ====================================== - - - - - **La malattia già esiste quindi per la conferma diagnostica**, es. è nato un bambino affetto da una patologia cromosomica, sospetto che possa essere la sindrome di down o un ritardo mentale legato al X (diagnosi su un individuo già nato); oppure può essere una diagnosi pre-natale quindi durante la gravidanza per stabilire se il feto ha ereditato la mutazione. Sia gli screening neonatali che prenatali fanno parte di una diagnosi molecolare quando c'è già la diagnosi clinica; - Nel caso delle **malattie recessive** invece, a parte la talassemia in cui l'individuo portatore dalle analisi del sangue risulta avere i globuli rossi più piccoli (anemia mediterranea), non ci sono analisi che mi dicano di essere portatore e completamente sano, potrei essere portatrice di fibrosi cistica oppure essere completamente sano omozigote wild-type, ma non lo vedo se non faccio un'analisi genetica, è importante sapere se presento una famiglia a rischio, se sono portatore o se sono completamente sano e quindi non posso trasmettere l'allele mutato; nelle malattie recessive identificare il portatore sano è fondamentale; - **Diagnosi presintomatica o preclinica**, la malattia non si è ancora manifestata, però ci sono malattie a esordio tardivo es. malattie da triplette, distrofie, corea di Huntington. Nelle forme classiche si manifestano quando l'individuo ha già avuto dei figli, la malattia comunque si manifesterà perché con la mutazione abbiamo la malattia; - **Diagnosi predittiva** (o di suscettibilità genetica) per le malattie complesse, quando posso definire un rischio aumentato o diminuito rispetto alla popolazione generale, stabilire se ho un rischio aumentato per TEST DIAGNOSTICI ================ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - TEST PRESINTOMATICI: A CHI E QUANDO FARLO? ========================================== - - - - - - - - MALATTIE COMPLESSE ================== - - - **Raccomandazioni per l'utilizzo clinico del genotipo dell'apoE:** ------------------------------------------------------------------ - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - **Il test predittivo in ambito oncologico è da raccomandare:** -------------------------------------------------------------- a. b. c. - - - - - - - - - - - - - [I FARMACI A PICCOLE MOLECOLE] ========================================== - - - - - - - 1. 2. **La TERAPIA "TRADIZIONALE" INVASIVA** -------------------------------------- - - - - - - - - - - - STRATEGIE TERAPEUTICHE PER FC: ============================== 1. 2. 3. - - - - - - - - - [PRODOTTI DEL DNA RICOMBINANTE] =========================================== PRODOTTI DI ORIGINE UMANA ========================= PRODOTTI DI ORIGINE ANIMALE =========================== - - PRODOTTI DEL DNA RICOMBINANTE ============================= - - ANIMALI TRANSGENICI =================== PRODOTTI DEL DNA RICOMBINANTE ============================= VACCINO PER EPATITE B (HEPAVAXGENE) =================================== TERAPIA BERSAGLIO -- TARGET THERAPY =================================== IMATINIB E LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA ==================================== **Incidenza:** -------------- - - - 1. 2. 3. - - - - - - **Come facciamo a controllare se il farmaco ha funzionato?** ------------------------------------------------------------ - - - - - - **Sopravvivenza CML dopo terapie** ---------------------------------- - - - - - - - - - **Meccanismi di resistenza a Imatinib** --------------------------------------- - - - - **Nilotinib (fenilamino-pirimidina)** ------------------------------------- **Dasatinib (tiazololilammino-pirimidina)** ------------------------------------------- - - - - - - **Imatinib e tumori stromali gastro-intestinali** ------------------------------------------------- - - - - [ANTICORPI MONOCLONALI] =================================== **Prodotti del DNA ricombinante** --------------------------------- **Anticorpi monoclonali terapeutici** ------------------------------------- **Carcinoma della mammella** ----------------------------  ------------------------ **Trastuzumab** --------------- - - - - - - - - - - - - - - - - **Immunoterapia Attiva:** ------------------------- **Perché esiste una differenza così marcata tra l'efficacia di Gleevec e di Herceptin nella cura dei tumori?** -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- - - - - **Come facciamo a capire se una cellula rimane staminale oppure va incontro a differenziamento?** ------------------------------------------------------------------------------------------------- - - - TIPOLOGIE DI CELLULE STAMINALI: =============================== 1. 2. 3. 4. - - PRO: ==== - - - CONTRO ====== #### **Quali sono i problemi? Perchè oggi non possiamo utilizzare queste cellule in terapia?** - - - - - **Cellula staminale neuronale (NSC):** -------------------------------------- - - - - 1. 2. 3. 4. **Isolamento delle MSC da midollo osseo** ----------------------------------------- 1. 2. 3. 4. 5. - - - - - **CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI INDOTTE (iPSC)** ------------------------------------------------- - - - PROBLEMI NELL'UTILIZZO CLINICO ============================== 1. 2. 3. 4. 5. - - - - [APPLICAZIONI CLINICHE DELLE CELLULE STAMINALI] =========================================================== 1. 2. 3. - - - - - - - - - - - **SINGENICO** (da gemello monozigote: il gemello monovulare ha lo stesso patrimonio genetico del paziente e quindi non andrà in contro a forme di rigetto) - **AUTOLOGO** (dal paziente stesso) - **ALLOGENICO** (da familiare o donatore HLA -compatibile) Dove si possono trovare le cellule staminali ematopoietiche? ============================================================ 1. 2. 3. Si preferisce usare il prelievo da sangue periferico (procedura chiamata aferesi): ================================================================================== - - Doppia barriera immunologica nel trapianto di midollo osseo =========================================================== - - - - FUNZIONI DELLE MSC*:* ===================== - - - - - Terapia cellulare in difetti neurologici ======================================== - MALATTIA DI PARKINSON ===================== INFARTO DEL MIOCARDIO ===================== - - - - - - - - Malattie ereditarie e organoidi =============================== Cellule staminali tumorali: the dark side ========================================= - - - - - LA TERAPIA GENICA ================= - - - - - - - **Come può avvenire il rilascio del gene terapeutico?** ------------------------------------------------------- - - - **Un altro problema del trasferimento genico è quello della persistenza: quanto permane nel tempo il gene inserito?** --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- - - - - - - - - - - - - - - - - LIMITI: ======= - - - - - nel **vettore virale** abbiamo solo le sequenze ITR, PSI e il trans gene - le **cellule packaging** forniscono i geni che abbiamo eliminato - - - - - - - - - - - 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. - - - - - - - - - - - - 1. 2. - - - ZINC-FINGER NUCLEASI: ===================== - - TALEN: ====== 1. 2. **Semplicità del disegno:** --------------------------- 1. 2. 3. 4. 5. - - - - #### **CRISPR, problemi e rischi** - - - - ### **VARIANTI CAS** #### #### **Proteine CAS ingegnerizzate e originali** #### #### **Prime editing (descritto nel 2019)** #### #### **Animali editati** #### #### **Malattie genetiche e CRISPR** #### #### **CRISPR e malattie cromosomiche** #### #### **CRISPR e malattie virali** - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - **RNA messaggeri** (mRNA) specificano la sequenza aminoacidica di una proteina; portano l'informazione genetica dal nucleo al citoplasma - **RNA ribosomiali** (rRNA) sono sintetizzati nel nucleolo, hanno un ruolo catalitico nei ribosomi nella sintesi proteica - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - **Terapie antisenso di inattivazione (tumor suppressor):** introduzione di RNA antisenso per inibire l'espressione genica (ad es. di un oncogene). - **TerapiaSuicida**: per cercare di portare al suicidio la cellula neoplastica con l'introduzione di "geni suicidi" che producono tossine o profarmaci. - **Terapia sostitutiva di riparo**: introduzione di copie funzionanti di un gene oncosoppressore mutato. - **Terapia chemioprotettiva:** con il trasferimento di geni che offrono chemioresistenza. La chemioterapia è un trattamento fondamentale per la cura del cancro. Il suo esito clinico è fortemente limitato dalla resistenza dei tumori maligni a tale terapia e al verificarsi di gravi danni collaterali agli organi vitali. È richiesto lo sviluppo di farmaci innovativi (geni) che conferiscano la chemioresistenza nei tumori refrattari e proteggano gli organi vitali dagli effetti citotossici delle terapie antitumorali. - **Terapia anticorpale:** introduzione di geni che producono anticorpi intracellulari. - **Terapia anti-angiogenica:** interruzione del nutrimento ai tumori. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - **CD19 è un bersaglio ideale per cellule CAR-T:** ------------------------------------------------- 1. 2. 3. - - - - - - - - - - **I recettori chimerici CARs sono stati ingegnerizzati e perfezionati per cui:** -------------------------------------------------------------------------------- 1. 2. 3. - - **Alcune terapie CAR-T approvate:** ----------------------------------- - - - - - - - - - - - **Perché esistono i check-point?** ---------------------------------- 1. 2. 3. 4. 5. - - - - - - A. B. #### #### **Differenze tra check-point inibitori e check-point co-stimolatori:** - - #### #### **Immunoterapia è differente dalla chemioterapia per una serie di motivi:** 1. 2. 3. 4. ### ### **IMMUNOTERAPIA E CRISPR** - - - - - - - - - - - - - - - - - 1. 2. 3. 4. - - - - - - 1. 2. - - - - - - - - - - #### **Problemi:** - - - - #### #### **Differenze tra Duchenne e Becker:** #### **Mini e microdistrofina per terapia genica DMD:** #### **Exon skipping per la terapia genica della DMD:** - - - #### #### **Stop codon read-through per DMD:** - - - - - - - - - - - - #### **Terapia genica: fibrosi cistica** - - - - - - #### **Strategie farmacologiche per FC:** - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - #### #### #### **Prove sperimentali del doping genetico:** - - - - - - - - - - Anticorpi contro il vettore virale - Rilevazione di differenze strutturali tra la proteina endogena e quella ricombinante - Profilo proteomico - Marcatori biologici TERAPIA GENICA: ===============