Farmaci Biotech: Studi e Approcci

Visto che è un FAB può essere prodotto negli E.Coli. Il FAB non è glicosilato —> più piccolo VEDI SLIDE perché mancano alcune cose —> fu approvato e dopo qualche mese ritirato dal commercio per reazioni fatali: attivava virus dormienti....

Visto che è un FAB può essere prodotto negli E.Coli. Il FAB non è glicosilato —> più piccolo VEDI SLIDE perché mancano alcune cose —> fu approvato e dopo qualche mese ritirato dal commercio per reazioni fatali: attivava virus dormienti. —> frammento di anticorpo (FAb + hinge) PEGilato. —> questo prodotto non è paragonabile all’in iximab ma ha comunque una buona attività. The second name (Pegol) is the name of the pegylation. fl  —> anticorpo umanizzato. —> usato per pazienti che non rispondevano a antagonisti di TNF o che potevano utilizzare altri farmaci. —> lega tutte le forme del recettore per IL6 (solubili o legate alla membrana). Indicazioni terapeutiche: AR severa (seconda linea), indicazioni pediatriche in combinazioni con metotressato; arterite a cellule giganti (malattia in cui le arterie della testa sono rigon ate); malattie da rilascio di citochine (o label per il Covid); ecc. È stata poi approvata una nuova indicazione ovvero quella per trattare il COVID-19. Non cura però la malattia, ma riduce i sintomi. —> Soliris; farmaco orfano; i suoi domini costanti non derivano da IgG1 ma alcuni domini di IgG2 e alcuni di IgG4. E’ stato ingegnerizzato razionalmente perchè il target è una proteina del complemento umano (C5, attivata nella cascata e proetolizzata in due forme, e ettrici dell’e etto tossico). ff ff ff fi  —> dopo il primo approccio terapeutico è stato utilizzato per altri trattamenti. —> designato come farmaco orfano perchè tratta malattie rare. NB: il farmaco non cura la causa della malattia, non cura il difetto genetico ma agisce a livello del complemento, riducendo la distruzione cellulare. The active substance in Soliris, eculizumab, isa mAb that has been designed to attach to the C5 complement protein, which is a part of the body’s defense system called the “complement system”. In patients with PNH, aHUS, myasthenia gravis and NMOSD, the complement proteins are over-active and damage the patients’ own cells. By locking the C5 complement protein, eculizumab prevents complement proteins from damaging cells, thereby helping to relieve the symptoms of these diseases.  Tutte le varie IgG attivano o no il complemento in maniera diversa. Facendo mix and match ottieni cose diverse. Le IgG umane possono essere suddivise in 4 classi con di erenze strutturali funzionali precise (tutte hanno i domini e i ponti di solfuro classici, ma ci sono di erenze più rilevanti che riguardano il doni Fc) nelle 4 sottoclassi di Fc ci sono di erenze di sequenza (quindi anche nella struttura) che portano a di erenze di a nità per i recettori Fc e nella possibilità di attivare il complemento: - IgG1: forte attività di legame a Fc receptor e forte attivazione del complemento - IgG2: per alcune di erenze a livello di CH1 ha una minore capacità di funzioni e ettrici citotossiche, ma è ancora in grado di legare il complemento. - IgG3: analoga alla IgG1 come funzioni; - IgG4: ha di erenze a livello di CH2 e CH3, per cui ha bassa attività di azione al complemento; Il Soliris ha tutta una serie di biosimilari che ora stanno entrando nelle pipeline delle industrie. Eculizumab does not activate complement! In fact, it has minimal e ector functions as a result of rational engineering. Fully Human Mabs Anticorpi completamente umani che possono essere prodotti con due tecnologie diverse: 1. Topi transgenici: topi ingegnerizzati che al posto delle sequenze variabili murine hanno quelle umane. Sono quindi piattaforme di animali da laboratorio utilizzati per l’immunizzazione. Da questo momento in poi i passaggi sono gli stessi degli ibridomi. 2. Phage Display : tecnologia combinatoriale di tipo chimico; l’obiettivo è quello di trovare un modo che permetta la selezione di sequenze variabili in vitro (nel topo lo fa il sistema immunitario). Le tecnologie per selezionare diversità molecolari sono quelle che sfruttano librerie combinatoriali di anticorpi con alta diversità; da queste dobbiamo selezionare il fenotipo (molecola) che abbia il folding corretto per legare l’antigene (che si troverà covalentemente legato in dei beads). I passaggi di selezione vengono ripetuti con stringe sempre più elevata in modo di arrivare al costrutto molecolare capace di legare l’antigene (DNA che verrà poi clonato, trasfettato e fermentato per ottenere il mAb). ff ff ff ffi ff ff ff ff ff  Quello in rosso nella gura sopra è un fago (virus che infetta batteri): all’interno contiene il DNA del virus e all’esterno le proteine per il riconoscimento della cellula da infettare. Noi possiamo ingegnerizzare questi sistemi, chiamati vettori phagemidici: essi contengono siti che posso essere utilizzati per operazioni di biologia molecolare (phage display) —> sono state inserite sequenze di DNA che codi cano per altre proteine sotto il controllo di un segnale di secrezione e di un promotore di trascrizione; in questo modo la proteina di nostro interesse verrà mostrata all’esterno del fago. Otteniamo quindi le proteine del fago con legati i domini proteici che corrispondono alle sequenze che abbiamo ingegnerizzato. Proteina 8 e 3 sono del fago; inserendo frammenti di DNA nel vettore, o in fusione con la proteina 3 o in fusione con la proteina 8, dopo l’infezione e l’espressione delle proteine del fago, ci troviamo ad avere fagi che esprimono anche peptidi che corrispondono agli inserti di DNA inseriti da noi. Questo è un potente sistema per esprimere e immobilizzare nella super cie del fago tutta una serie di peptidi che possono essere cambiati per ottenere la proteina foldata. Il phage display è un ottimo sistema per accoppiare un genotipo (DNA dell’inserto) con il fenotipo corrispondente (proteina espressa dal gene). Per selezionare i domini che riconoscono antigeni prendiamo i domini variabili di linfociti B (ottenuti da donatori naive, immunizzati, ecc), ottenendo una libreria molto ampia di geni; i geni possono essere VH e VL o VHCH1 o VLCL (quindi o Fv o Fab); vengono assemblati e clonati in un vettore phagemidico, questi infettano i batteri in modo che il fago si riproduca ed esprima le proteine —> otteniamo i fagi che nella loro super cie esprimono domini Fab o Fv che abbiamo inserito noi. Quindi, la diversità molecolare viene già mostrata nella super cie del fago, ed è pronta per essere catturata da un sistema di cattura di proteine. fi fi fi fi fi Per il phage display abbiamo due passaggi: - Ottenere la libreria di anticorpi umani; - Selezionare nella libreria l’Ab che si lega all’antigene che vogliamo; —> generazione della diversità: isolare i linfociti B che esprimono molti anticorpi, fare PCR di VH e VL. Quando si fanno display solamente dell’Fv possiamo avere un nuovo formato: single chain Fv : frammenti VH e VL uniti da un linker (e non separato come dovrebbe essere). Possiamo indurre la Taq polimerasi compiere degli errori. —> utilizzando la tecnica del display fagico andiamo a selezionare li Ab che riconoscono l’antigene di nostro interesse (immobilizzato in un supporto). Il phage display è un modo per linkare il genotipo al fenotipo. Si continua il ciclo nché il sistema di riconoscimento dà costante di a nità soddisfacente, come quell che si ottiene immunizzando l’animale. A questo punto si torna alla fase di cloning: dal fago vincente si estrae il DNA, si clona il sistema in un framework di IgG umana e si ottiene un anticorpo completo. Come sfruttiamo il potere di questi virus per il ns scopo? Il Fago è usato come carrier per esporre il nostro genotipo usando il loro fenotipo. Espongono proteine nostre sulle super cie. Questi virus, una volta nelle cellule esprimeranno proteine del loro dna. Se mettiamo il ns dna nei fari esprimono proteine nostre. In questo caso fondiamo un DNA della ns proteina con il DNA di una proteina di membrana. In questo modo viene esposta una proteina attaccata alla membrana. I sistemi di espressione dell’Ab sono gli stessi dei biologici. Panning or Bio panning : sistemi di selezione: immobilizzazione del bersaglio; si incuba con i fagi che esprimono gli anticorpi, si lava tutto quello che non lega il bersaglio, si eleuisce il fago di interesse e si ampli ca. Questo approccio è stato adattato per la scoperta dell’Adalimumab. Primo farmaco fully human approvato in terapia ottenuto utilizzando il phage display (correggeva il difetto ffi fi fi fi  principale dell’in iximab, ovvero il fatto di avere sequenze murine e quindi una certa immugenicità). Scoperto dai topi transgenici. In iximab aveva molta concorrenza con l’Etanercept, costrutto umano che però non era un mAb. I geni utilizzati erano VH e VL in formato single strand per la selezione, e una volta ottenuto il fenotipo corretto si è ristabilito il normale legame, senza linker. NB: il linker serve solo per mantenere insieme i due domini durante la selezione, in quanto sia lavaggio che elusione possono essere abbastanza drastici in qualche caso. Una volta ottenuto l’anticorpo nito, il linker viene eliminato. The library has ben fused with coat phage protein and the fusion proteins obtained have been displayed on phages. By biopanning phages able to bing human TNF-α are selected and characterized. Binding can be ameliorated by site speci c mutagenesis on VH and VL sequences. —> prima indicazione terapeutica fl fi fl fi Oltre alla presenza di molti biologici per queste patologie autoummini, tra gli anticorpi fully human ne troviamo due anti-TNF: Adalinumab e Golinumab. Questi sono stati selezionati in modo diverso: mentre il primo è stato selezionato co phage display, il secondo con un ibridoma murino transgenico. Isolated by murine Hybridoma cell line. —> anche questo messo a punto con phage display. —> human B lymphocyte stimulator: citochina solubile che stimola la produzione dei linfociti B. E’ quindi importante nel lupus perchè, essendo una malattia autoimmune dove i linfociti B producono auto-anticorpi, reprimendo l’attività del sistema immunitario alla base si migliora la malattia.  —> originalmente designato come farmaco orfano per il trattamento di CAPS (20 marzo 2007). —> cryopyrin-associated periodic syndromes: patologie dove si ha l’iperattività delle criopirine, che hanno tante funzioni ma per lo più attivano l’in ammazione mediata da IL-1 (target dell’ilaris). Epar : andando ad inibire una citochina implicata in tutte le in ammazioni, è stato studiato e impiegato in studi clinici per altre malattie. M a l a t t i e r a re d i t i p o autoin ammatorio- autoimmune che rispondono bene all’inibizione di IL-1 L’ a p p r o v a z i o n e p e r questa patologia, non rara, ha fatto perdere la designazione di farmaco orfano. fi fi fi Farmaco fully human prodotto con tropi trasngenici. —> proteina p40, proteina comune a IL solubili diverse (12 e 23) e implicate nell’attivazione linfocitaria tipica della psoriasi a placche (applicazione iniziale dello stelara). NB: queste due IL sono dimeri e uno dei monomeri è sempre il p40 (dominio costante utilizzato per la messa a punto di un anticorpo selettivo per questo). Quindi con lo stesso anticorpo inibiamo l’attività i due IL chiave per l’attivazione dei linfociti T. A. IL-12 and IL-23 and their respective receptors. B. Ustekinumab binds to the p40 subunit of IL-12 and IL-23 presenting their interaction with the natural killer or T-cell surface IL-12 receptors β1 (IL-12Rβ1) and inhibiting IL-12 and IL-13 signaling, activation and cytokine production.  Immune checkpoint Inhibitors Idea di base: l’attivazione del sistema immunitario può essere utilizzato per il trattamento di tumori. —> antigene di super cie dei linfociti T e associato ad una risposta citotossica. Nel 2014 è stata fatta una stima della possibile crescita di altri composti che trattano tumori bloccando i checkpoint (ICI: Immune Checkpoint Inhibitors), sistemi di controllo del sistema immunitario, e liberando l’attività citotossica di quest’ultimo. Questi farmaci hanno dimostrato la loro e cacia in tumori di cili: —> combinazione di farmaci per il trattamento di melanomi che non rispondono. Basis of discovery: tumor expresses tumor-associated antigens that could theoretically provide the basis for an e ective immune response. Come funziona l’ipilimumab? In gura viene rappresentata l’interazione tra una cellula che presenta un certo antigene (ad esempio cellula tumorale) e un linfocita T. Il contatto tra queste due avviene tramite un legame ligando-recettore, ma servono altri segnali (segnali di co- stimolazione), come quelli in verde e in rosso, per attivare il linfocita. Oltre questi segnali positivi, ci sono dei segnali negativi di co-stimolazione, che reprimono l’attivazione del linfocita, mediato dal CTLA4. Quest’ultimo antagonista il CD28 del linfocita per legare lo stesso ligando della cellula tumorale (CD80/CD56). Se noi vogliamo la super-attivazione del linfocita a nché vada a distruggere la cellula, dobbiamo inibire il CTLA4. Quindi anticorpi speci ci per il CTLA4 sono potenziali antitumorali. fi fi ff fi ffi ffi ffi  —> meccanismo indiretto! BITE: Bi-speci c T cells engaging The BITE is like a like that engage di erent cells to be close together. VEDO SLIDES SU BITE che sono sotto —> anche in questo caso l’attività del farmaco è indiretta in quanto agisce sull’attività del linfocita e non direttamente nella cellula tumorale. —> indicazioni abbastanza simili a Opdivo fi ff  —> IgG2 che interferisce con il signal tra ligando e recettore per bloccare l’attivazione degli osteoclasti.  —> approvato in USA; anticorpo speci co per inibire una certa proteina dell’antrace; ottenuto con phage display. Next Generation Mabs —> possiamo minimizzarle o aumentarle a seconda della variazione sulla sequenza —> già quando Fc è umano possiamo allungare l’emivita. —> ottimizzazione di Fab o Fv per ottenere anticorpi bispeci ci o multispeci ci. The antibody Fc domani is also the major binding region to develop immunoconjugates by association with a radioactive label, cytotoxic drug or protein. fi fi fi I due Fv che in gura sono uguali, possono anche essere cambiati per legare due bersagli diversi con la stessa molecola —> anticorpi bispeci ci. Il primo ad essere approvato fu messo a punto con l’idea di unire tra di loro celle che normalmente non si legherebbero —> crosslink di cellule tumorali con cellule immunitarie. BiTes : costrutti che chiamano il linfocita T vicino ad un’altra cellula. Review: Buy buy bispeci c antibodies (2011) —> hanno una parte che riconosce l’antigene del linfocita e una che riconosce quello della cellula tumorale (fa quindi da adattatore tra due sistemi che altrimenti non si riconoscerebbero). L’anticorpo riconosce sia il recettore di super cie del linfocita T, sia quello presente nella cellula maligna, legandosi ad entrambi —> le cellule entrano in contatto e il linfocita viene attivato per eliminare la cellula maligna. BiTE represents an innovative area of research in the evolution of antibody-based immune therapeutics whose clinical e ectiveness is currently being investigated by Amgen. Primo BiTE approvato. Abbiamo un Fv single chain speci co per il CD3 dei linfociti, mentre l’altro per il CD19 della cellula maligna —> viene attivato il linfocita in particolari tipi di tumori (ALL). fi fi fi ff fi fi  —> orfano perché tratta una malattia rara. —> questi due single chain Fv sono di origine murina che non vengono ingegnerizzati ad umani. Glyco-engineered antibodies Costrutti in cui viene ingegnerizzata la parte zuccherina. E’ stato visto che cambiando il tipo di zuccheri si possono ottenere farmaci con un’attività diversa (aumento della capacità di attivazione del sistema immunitario per distruggere il bersaglio). —> anticorpo umanizzato che interagisce con il CD20; utilizzato per tumori rari. E’ un anticorpo ingegnerizzato nella parte zuccherina per avere maggiore funzione e ettrice. IMMUNOADHESINS - Soluble Receptors Immunoadhesin : a fusion protein that combines the functional domain of a binding protein, such as a receptor or ligand, with an immunoglobulin Fc domain. Such Fc fusion proteins can endow binding proteins with antibody-like properties including long serum half-life and e ector functions. Esempio : etanercept/enbrel Enbrel is a medicine that contains the active substance etanercept. What is Enbrel used for? It is an anti in ammatory medicine. It is used for the treatment of the following diseases: - Moderate to severe rheumatoid arthritis (an immune system disease causing in ammation of the joints) in adults (aged 18 years or over). Enbrel is used with methotrexate (a medicine that acts on the immune system) in adults with moderate or severe disease who have not responded adequately to other treatments, or on its own if methotrexate is not suitable for the patient. - Certain forms of juvenile idiopathic arthritis (a rare childhood disease causing in ammation of many joints), - adolescents aged 12 to 17 years who have psoriatic arthritis - adolescents aged 12 to 17 years who have enthesitis-related arthritis - Psoriatic arthritis in adults who have not responded adequately to other treatments; - Severe ankylosing spondylitis (a disease causing in ammation of the joints of the spine) in adults; ff fl ff fl fl fl - Plaque psoriasis in adults with moderate to severe disease and in patients from the age of six years with long-term severe disease. Enbrel is used in patients who have not responded to or cannot receive other treatments for this disease. - Severe non-radiographic axial spondyloarthritis (a chronic in ammatory disease of the spine) when there are objective signs of in ammation but no abnormalities seen on x-ray. Enbrel è un farmaco di successo che ha rivoluzionato il trattamento dei pazienti con queste patologie. Small-molecule DMARDs in clinical use : per casi moderati e severi si usano i biologici da soli o in associazione con alcuni di questi farmaci. —> usato anche in associazione con biologici Etanercept is a human tumour necrosis factor receptor p75 Fc fusion protein produced by recombinant DNA technology in a Chinese hamster ovary (CHO) mammalian expression system. Abbiamo unito i due domini con l’ingegneria genetica per formare una nuova molecola. Etanercept is a dimer (il prodotto proteico, monomero, dimerizza perchè i domini costanti di Fc hanno la capacità di formare ponti disolfuro —> tutti i prodotti che portano questa struttura hanno la capacità di dimerizzare) of a chimeric protein genetically engineered by fusing the extracellular ligand binding domain of human tumour necrosis factor receptor-2 (TNFR2/p75) to the Fc domain of human IgG1. This Fc component contains the hinge (parte che forma i ponti SS), CH2 and CH3 regions, but not the CH1 region of IgG1. Etanercept contains 934 amino acids and has an apparent molecular weight of approximately 150 kDa. - Hinge in rosso - CH2-CH3 in verde a sinistra NB: questo composto assomiglia strutturalmente ad un anticorpo ma non lo è!! L’uso dell’Fc serve non solo per l’eefctor function, ma anche per aumentare il peso molecolare. fl fl  TNF - Preclinical data indicated that TNF is at the top of a pro-in ammatory ‘cascade’. E’ un’importante citochina prodotta da cellule del sistema immunitario e partecipa all’in ammazione. Il TNF sembra essere a monte della IL-1 e agisce sulla cascata proin ammatoria (sostenuta da altre citochine e altre molecole). Esso, però, controlla anche la produzione di citochine antin ammatorie come sTNFR (soluble TNF receptor). TNF proteins initiate their biological e ect on cells by binding to speci c TNF receptor (TNFR) proteins expressed on the plasma membrane of a TNF-responsive cell. E’ stato pensato di utilizzare la parte extracellulare del TNFR come farmaco! Il TNF lega la parte extracellulare dei recettori (R1 o p55 e R2 o p75) Soluble TNFR Soluble, truncated versions of membrane TNFRs, consisting of only the extracellular, ligand- binding domain, are present in body uids and are thought to be involved in regulating TNF activity (legano il TNF e impediscono che esso si leghi ai recettori di membrana, responsabili del signaling). Soluble TNFRs have been detected in synovial tissue. Their levels are increased in serum and synovial uid in rheumatoid arthritis and in many other autoimmune and in ammatory conditions. - Monomeric sTNFR: not very e ective in animal models. Primo costrutto ideato. - Dimeric sTNFR: very e ective in animal models; higher a nity for TNF than monomeric receptor (50-1000 times), better antagonist of TNF (free or membrane bound), better PK pro le (sia per peso molecolare, che per la presenza di Fc che garantiva il riciclo). NB: nel nostro organismo il TNF non è presente come monomero ma trimerizza e lega come trimero il recettore portando all’inibizione. Dal punto di vista farmacologico abbiamo un vantaggio : sono state utilizzate sequenze proteiche umane, non murine. Questo fu importante prechè faceva concorrenza all’in iximab, anticorpo con porzione Fv murina (immunogenico). DNA encoding the soluble portion of human TNFR p75 was linked to DNA encoding the Fc portion of a human IgG1 molecule. The combined DNA was then expressed in a mammalian cell line. The resulting immunoglobulin-like dimer, composed exclusively of human amino acid fi fl fi fl ff fi fi ff fl ff ffi fl fi fl sequences, acts as a competitive inhibitor of TNF and prevents binding of TNF to the cell-surface TNFR, thereby reducing the biologic activity of TNF. NB: Etanercept inhibits binding of both TNFα and TNFβ to cell surface TNFRs, rendering TNF biologically inactive. L’in iximab, invece, è stato ottenuto immunizzando gli animali solo con il TNFα! Etanercept è stato uno dei primi farmaci ad avere molti biosimilari, tutti con un’attività sovrapponibile a quella dell’originator (hanno permesso di abbassare i costi della terapia). Questo costrutto molecolare è stato importante, oltre per aver rivoluzionato la terapia, perchè funzionava! Questa idea è stata quindi copiata per creare costrutti con recettori diversi per diversi ligandi: receptor-Fc fusion terapeutics (o traps o mimetibody). Queste molecole sono implicate per malattie rare o autoimmuni che riguardano il sistema immunologico. Abatacept (Orencia™) Orencia is used in combination with methotrexate (a medicine that acts on the immune system) to treat the following diseases: - moderate to severe active rheumatoid arthritis - moderate to severe active polyarticular juvenile idiopathic arthritis - psoriatic arthritis (adults) Indicato per i pazienti che non rispondono all’inibizione del TNF. Prende anche il nome di CTLA4Ig ed è composto da porzioni CH2 e CH3 di una IgG1 sue con il CTLA4, responsabile del legame con il recettore. Quest’ultimo è un recettore di membrana composta da una parte extracellulare, una transmembrana e una interna. É un segnale negativo di co-stimolazione del sistema immunitario. Questa molecola l’abbiamo vista con l’ipilinumab, anticorpo antagonista di CTLA4 per attivare il sistema immunitario. Qui, invece, si è voluto fare l’opposto: utilizziamo un costrutto mima un segnale negativo e blocca l’attività dei linfociti T —> attenuiamo il sistema immunitario = immunosoppressore. CTLA4 has a higher a nity for both CD80 and CD86 than CD28, and its natural function might be to terminate T-cell activation. The potential for CTLA4 to interrupt the delivery of the second signal required for full T-cell activation was harnessed by fusing the extracellular domain of human CTLA4 to the modi ed Fc (hinge, CH2 and CH3 domains) portion of human immunoglobulin G1 (IgG1), to give a soluble fusion protein, CTLA4Ig, which is now known as abatacept. Drug properties : Abatacept binds to CD80 and CD86 on APCs, preventing these molecules from binding to CD28 on T cells and thereby inhibiting optimal T-cell activation by blocking the costimulatory signal. In vitro, abatacept decreases T-cell proliferation and inhibits production of ffi fl fi  TNF , interferon- and interleukin-2. Abbiamo quindi un e etto anche su TNF per inibizione mediata (non diretta). Come mostrato in gura, senza anticorpo abbiamo il linfocita T attivato perchè abbiamo un segnale di costimolazione positiva; Con l’anticorpo abbiamo un eccesso di segnale negativo che impedisce l’attivazione del linfocita. Cambiamo l’equilibrio siologico tra CD28 e CTLA4 spostandolo verso un segnale negativo. Strutture più complesse A ibercept (VGEF TRAP) A ibercept (VEGF Trap) is an anti-angiogenic agent designed to bind all forms of VEGF-A, and Placental Growth Factor (PLGF), both of which are implicated in tumor angiogenesis. The original VEGFtrap molecule was created by fusing the rst three domains of the VEGF receptor 1 to the human IgG1 Fc region. This protein was very potent in in vitro tumor growth inhibition assays, but exhibited a poor pharmacokinetic pro le and non-speci c interactions that made it unsuitable as a clinical candidate. Holash et al. deleted the entire high pI domain 1 thought to be responsible for non-speci c binding and replaced the high pI domain 3 with a lower pI and a better binder, domain 3 from VEGF receptor 2, resulting in a nal construct, which actually improved the binding a nity in addition to improving the isoelectric point. Receptor agonist therapeutics These are also called peptibody. Finora abbiamo parlato di antagonisti o di composti che mimano altre molecole. Possiamo anche innestare sull’Fc qualcosa che abbia un e etto stimolante, un agonista naturale (es: peptide). The success of antibodies and receptor-Fc fusion proteins are mainly limited to antagonism. In contrast, many existing native peptides of less than 50 amino acids are potent agonists, representing a rich source of therapeutic targets. Amgen has developed the peptibody technology in which peptides are fused to the Fc domain to extend their serum half-life. Romiplostim (Nplate) The most advanced peptibodies, Romiplostim (NPlate), a peptide mimic of thrombopoietin fused to Fc, was recently approved by the FDA for the treatment of chronic immune thrombocytopenia purpura. Romiplostim has been designed to attach to and stimulate the same targets (receptors) as thrombopoietin. By mimicking the action of thrombopoietin, romiplostim stimulates the production of platelets, thereby increasing blood platelet counts and reducing the risk of bleeding. fl fl fi fi fi ff ff fi fi fi ffi fi  14/01 Cytokines Cytokine is a generic term for the soluble protein molecules released by participating and interacting cells in the innate and adaptive immune systems. Cytokines communicate in a dynamic cellular network during an immune/in ammatory response to an antigen. Most of the molecularly de ned cytokines are called interleukins, by convention, implying that these molecules are produced by leukocytes and act on leukocytes. (In reality, this is too limited a de nition, because many cytokines are produced by or act on cells other than leukocytes, and many cytokines that ful ll these criteria are given other names for historical reasons). Cytokines, usually released and targeted to produce a localized e ect, regulate the growth, di erentiation, and activation of the cells responsible for the maintenance of the immune response. A volte sono chiamate interleuchine, l’idea è che sono cellule prodotte dai linfociti e che hanno molteplici funzioni (inter-). Citochine è un termine molto generico, all’interno possiamo trovare anche interleuchine, interferenti ecc. Kineret (principio attivo : Anakinra) È un farmaco interessante, perchè nonostante sia vecchio, è stato scoperto recentemente, cioè è stato riscoperto per il CAPS e altre patologie (quelle sotto). È stato abbandonato per l’artrite perchè sono stati scoperti farmaci migliori, migliori soprattutto dal punto di vista della farmacocinetico. Anakinra è un piccolo biologico e quindi viene eliminato velocemente, più di altri anticorpi come Adalimumab o anche di Eternacept (fusion protein) o In iximab. Indicazioni terapeutiche: - rheumatoid arthritis (poco usato perchè compete con farmaci anti TNF); - cryopyrin-associated periodic syndromes (CAPS); - familial Mediterranean fever, another inherited periodic fever syndrome; - Still’s disease, a rare disease causing in ammation of joints as well as rash and fever; Tutte queste malattie sono accomunate dall’iperattivazione del sistema immunitario. - COVID-19 in adults with pneumonia requiring supplemental oxygen (low or high ow oxygen) and who are at risk of developing severe respiratory failure. Questa indicazione nasce dal fatto che, come altri farmaci antin ammatori, è capace di bloccare le cytokine storms, conseguenza dell’iper attivazione del sistema immunitario (non controllata). The active substance in Kineret, anakinra, is an immunosuppressive medicine (a medicine that reduces the activity of the immune system): it blocks the receptors for a chemical messenger in the body called interleukin 1 —> antagonista di IL1 per il legame al suo recettore. The active substance in Kineret, anakinra, is a copy of a natural human protein called “human interleukin 1 receptor antagonist”. Abbiamo quindi un sostituto biotech di una proteina umana. A. The cytokine IL-1β has two di erent receptor binding sites (red and blue). The IL-1 receptor type I (IL-1RI) binds one site and the IL-1 receptor accessory protein (IL-1R AcP - accessory protein) engages the second site. The resulting complex activates the cell. The naturally occurring IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) possesses only the type I receptor binding site. The naturally occurring IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra) possesses only the type I receptor binding site. B. The antagonist occupies this receptor and prevents IL-1β from binding to cells. ff fi fi fi ff fl fl fi fl ff fl  Interferoni (citochine) Funzioni - Alpha 2a (ROFERON) (macrophages) - > Leukemia (hairy cells, chronic myelogenous) - Alpha 2b (INTRON-A) - > Lymphoma - Alfacon-1 (INFERGEN, CIFN) - > Hepatitis B and C - Beta 1a (AVONEX, REBIF) ( broblasts) - > Multiple sclerosis - Beta 1b (BETASERON) - > Granulomatous Chronic Disease (CGD) - Gamma 1b (ACTIMMUNE) (T lymphocytes, NK) - > Osteopetrosis Potrebbe chiedere le indicazioni terapeutiche. Gli interferoni che si usano e che sono stati sfruttati sono di 3 tipi: α, β, γ; dal punto di vista biotecnologico, si copiano gli interferoni naturali e si producono pincipalmente in E.Coli. NB: oltre agli interferoni branded abbiamo anche molti biosimilari! α : prodotti naturalmente nei macrofagi; la terapia con gli interferoni è antecedente alle biotecnologie perchè prima venivano estratti. Utilizzati per il trattamento di alcuni tipi di tumori (leucemie e linfomi in particolare) o per malattie virali (limitate ad epatite B e C). Ci sono almeno 20 sequenze di interferoni α. Questi interferoni possono essere PEGilati! β : prodotti per lo più da broblasti; questi interferoni hanno meno isoforme, ad esempio β1 a e b di eriscono soprattutto nel modo in cui vengono prodotte (Betaseron è la prima prodotta in coli, Avonex e Rebif sono prodotte in cellule di mammifero e glicosilate per aumento del PM e della farmacocinetica). L’applicazione principale è per il trattamento della sclerosi multipla. γ : prodotti per lo più da linfociti T o cellule NK. Interferoni molto potenti e agiscono in un recettore diverso rispetto ad α e β. Utilizzate per il trattamento di malattie (molto) rare. Vedi slides perché mancano alcune cose Interferoni β ff fi fi  Growth Factors (chitochine) Citochine con un’attività speci ca: stimolano la crescita e la di erenziazione di particolari cellule (possono essere aggiunte a cellule in coltura). Il classico e etto che hanno è sulle cellule staminali del sistema immunitario, che possono di erenziarsi in diversi tipi di cellule —> precursori mieoloidi o linfoidi. Sono estremamente potenti per spingere la di erenziazione cellulare sia di staminali che di cellule del sangue (eritrociti). Dal punto di vista farmaceutico ci interessano di più i fattori di crescita che stimolano l’eritropoiesi: ESAs (Erythropoiesis stimulating agents). Essi stimolano la maturazione dei precursori eritrociti in cellule eritrocitiche; sono quindi molto importanti per l’ossigenazione (considerando che O2 è trasportato dagli eritrociti). Carenze di eritropoietina sono associate a forme di anemia anche molto gravi. Hematopoietic growth factors: Erythropoietin, EPO, epoetin alpha or beta or other letter of greek alphabet (caratteristica tipica delle epo, dipende dal tipo di produzione); Anaemia in patients with chronic renal failure (EPO viene prodotta a livello renale), chemotherapy-induced anaemia in cancer patients, and for increasing the yield of autologous blood from patients in a pre-donation programme; The dosages may vary considerably and are highest in the oncology indications (cambiano in base al tipo di trattamento, al paziente e a quello che il medico decide); Epoetin can principally be administered intravenously (IV; per pazienti con insu cienza renale, dialisi) or subcutaneously (SC; per pazienti oncologici). rhEPO Recombinant human EPO produced in CHO (Chinese Hamster Ovary). Pur essendo una citochina piccola, viene prodotta in cellule di mammifero. Le prime prodotte furono: EPO α —> Erypo / Eprex EPO β —> NeoRecormon Alfa e beta sono le stesse molecole, ma fatte da diversi host. Sono la stessa molecola, ma con di erenze nella glicosilazione. Gli amminoacidi sono però gli stessi. Other di erent greek letter: di erent glycosilation (often biosimilars). Si sta parlando di farmaci diversi! Esseno prodotte in cellule di mammifero vengono glicosilate, e se un produttore ha un clone diverso o una cellula diversa (diversi metodi di produzione), otteniamo diverse glicosilazioni. The rst rHuEPO, epoetin alfa, was manufactured by Amgen and sold as Epogen® in the US for dialysis patients (in 1989). In 1985, Amgen transferred rights for all non-dialysis indications in the US and all indications outside the US (excluding Japan) to Johnson & Johnson, and its a liate Ortho-Biotech, in a long-standing licensing agreement. Since then Ortho Biotech has been marketing the same epoetin alfa manufactured by Amgen in the US under the brand name, Procrit®. The rst non-alfa EPO-epoetin-beta was developed by Genetics Institute and manufactured initially by Boehringer Mannheim, and approved in Europe as brand name Recormon® in 1990, shortly after the introduction of Eprex in 1988. ff ff fi fi ff ff ff ff ff fi ffi ffi  The naming of Recormon followed the World Health Organization (WHO) guidelines; analogues of epoetin are classi ed by a Greek letter after epoetin to di erentiate between products of the same amino acid sequence which vary in the glycosylation pattern. Beta came after as a competitor, but not as a biosimilar of alfa. Authorized ESA (EMA) Alcuni di questi sono biosimilari dell’EPO alpha! Hanno quindi lo stesso nome della sostanza attiva ma un nome commerciale di erente. Altri invece non sono biosimilari ma altri prodotti, come ad esempio EPO theta. Oltre alla lettera greca possiamo avere altri nomi di sostanze attive, come la dabepoeitin alfa e mircera: in questo caso non abbiamo una di erenza di glicosilazione, ma proprio nella composizione amminoacidica. Human EPO Human erythropoietin is a 165 amino acid glycoprotein mainly produced in the kidneys and is responsible for the stimulation of red blood cell production. EPO for clinical use is produced by recombinant DNA technology using mammalian cells as expression system and termed epoetin. All epoetins in clinical use have a similar amino acid sequence as endogenous erythropoietin but di er in the glycosylation pattern. EPO is a growth factor. It is synthesized in kidney (85%) in response to hypoxia (viene prodotta sul momento, non abbiamo riserve di EPO). It stimulates erythrocyte production in bone marrow in quanto è un fattore di crescita. Glicosilazione dell’EPO EPO physiological activity and half life is correlated to glycosylation and to sialic acid content (5 hrs). Glycosylation sites: Asn 24, 38, 83 and Ser 126 (40 % carbohydrates): abbiamo quindi 1 O-glicano e 3 N-glicani. Sialic acid (SA); N-acetylneuraminic acid (NANA); Neu5Ac Importante per l’emivita plasmatica, se manca la clearance della molecola è molto veloce. Siccome EPO aveva avuto molto successo, si è pensato di produrre nuove EPO non siologiche ma con un’emivita plasmatica maggiore —> aumento dell’intervallo di somministrazione e migliore compliance. Per aumentare la farmacocinetica della molecola, è stata prodotta una proteina iperglicosilata (quindi con un maggior enumero di acidi sialici) —> Darbopoetin. ff fi ff ff ff fi  La darbopoietina è più acida e quindi ha un PI più basso dell’EPO alfa e beta. Più acido salico si ha più acida diventa la proteina. Di erent primary sequence from EPO: mutated AA (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn, Pro90Thr), to have two additional N-glycosylation sites (Asn30 and 88) result in 22 residues of sialic acid. Queste due mutazioni sitospeci che hanno permesso di ottenere un nuovo sito di attacco per la glicosilazione (—> 2 glicani in più). The more sialic acid the longer the circulation. In realtà, la proteina ha subito in totale 5 mutazioni, alcune di queste sono mutazioni compensatorie per garantire il corretto folding della proteina e la corretta esposizione dei nuovi siti di glicosilazione. PM: 37.1 KDa; 51 % carbohydrates; CHO production; Half life: (25 hr vs 8.5 r-huEPO). NB: EPO è sia un farmaco che una sostanza dopante! Esistono quindi analisi speci che per sapere se l’atleta ha assunto EPO per migliorare le performance, queste sono: - Haematocrit : viene poco utilizzato in quanto non dà indicazione della presenza di EPO ricombinante, perchè l’ematrocrito è variabile in base al paziente. Tutti gli atleti che assumono EPO, hanno un ematocrito molto denso. - Hb : emoglobina, conta degli eritrociti. Anche questa però è variabile e non indica la presenza di EPO ricombinante. - Test speci ci : di cile da trovare la proteina ricombinante in quanto i biologici sono fatti apposta per mimare quanto più possibile la proteina umana, in modo da evitare risposta immunitaria. L’unica di erenza tra la EPO normale e la ricombinante sta nella glicosilazione. Quindi, la principale speranza per trovare se qualcuno fa uso di rEPO è che poi quando si va a fare l’isoelettrofocalizzazione si abbiano dei PI diversi e quindi si trovano le di erenze nella glicosilazione e perciò risalire se uno ha fatto uso di della proteina o no. Mircera (continuous erythropoiesis receptor activator) Pegylated Epoetin beta : longer plasmatic half life (130-140 h); One 30 Kda PEG; PM 60 Kda. I siti di PEGilazione sono noti e sono o l’ammino gruppo all’N- terminale della proteina, o i due ammino gruppi in ε delle lisine. EPO E ects: sxaggerated pharmacodynamic response to EPO may result in hypertension and thrombotic complications. Moreover, pure red cell aplasia (PRCA) due to neutralising anti-epoetin antibodies has been observed, predominantly in renal anaemia patients treated with subcutaneously administered epoetin (—> riconosce anche EPO endogena e va a diminuire anche le concentrazioni di essa, causando e etti devastanti). In addition, possible angiogenic and tumour promoting e ects of epoetin might be of importance in selected populations I test speci ci vanno a trovare le di erenze tra EPO ricombinante e naturale, che stanno nella glicosilazione. Un test usato nel tour the france del 1998 è l’isoelettrofocusing (IEF): in questo modo facciamo migrare la proteina in un gel elettroforetico con un gradiente di pH —> distinguiamo il pI delle proteine che può essere dovuto ad una diversa sequenza amminoacidica (non in questo caso perché i biologici in questo senso copiano le proteine naturali) o nella glicosilazione (di erenza nel numero di acidi sialici). ff ff ff fi fi ff ffi ff fi ff ff ff fi ENZYMES - Enzymes (most of them used for rare disorders) - Clotting factors - Anticoagulants Utilizzati principalmente per terapie sostitutive. 1. Enzymes - Pulmozyme (DNase : Dornase Alpha) : enzima capace di idrolizzare il DNA. Viene utilizzato per il trattamento della brosi cistica (malattia genetica), approvato nel 1998 e somministrato giornalmente per nebulizzazione. L’enzima non cura la malattia, ma serve a migliorare la qualità di vita del paziente e ad aumentare la penetrazione di altri farmaci, in quanto ha attività mucolitica. Pulmozyme® una soluzione di DNasi I umana ricombinante sterile, incolore altamente puri cata, usata per il trattamento sintomatico della Fibrosi Cistica. La Deossiribonucleasi I umana un’endonucleasi normalmente presente nella saliva, nelle urine, nelle secrezioni pancreatiche e nel sangue. Il ruolo siologico di catalizzare l’idrolisi del DNA extracellulare in oligonucleotidi più piccoli: il DNA genomico presente nel muco dei pazienti, che deriva da batteri morti, leucociti, cellule necrotiche ecc, contribuisce alla formazione e alla viscosità del muco (il DNA genomico è molto viscoso, più è lungo più è viscoso —> idrolizzandolo diminuiamo la lunghezza del DNA e diminuiamo la viscosità della soluzione). Mechanism of Action : In CF patients, retention of viscous purulent secretions in the airways contributes both to reduced pulmonary function and to exacerbations of infection. Purulent pulmonary secretions contain very high concentrations of extracellular DNA released by degenerating leukocytes that accumulate in response to infection. Pulmozyme is recombinant human deoxyribonuclease I (rhDNase), an enzyme which selectively cleaves DNA. In preclinical in vitro studies, Pulmozyme hydrolyzes the DNA in sputum of CF patients and reduces sputum viscoelasticity. Terapie sostitutive è fi è fi fi è  Non chiede cosa fanno, è giusto per sapere che ci sono. - Fabrazyme (agalsidase beta) Recombinant human α-galactosidase (r-hαGAL); produced by genetically engineered Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. Used for treatment of Fabry Disease: a rare X-linked recessive glycosphingolipid storage disorder that is caused by de cient activity – subnormal or absent - of the lysosomal enzyme, α-galactosidase A. It is an extremely rare disorder, with an estimated prevalence of 500 to 1000 patients within the EU. - Imiglucerase (Cerezyme) Glucerebrosidase analog from CHO cells; Enzyme replacement therapy (ERT) for Gaucher disease. Gaucher disease, also called glucosylceramide lipidosis or ß- glucocerebrosidase (GCR) de ciency, is the most common of the sphingolipidoses or lipid storage diseases. It is characterised by the accumulation of glucocerebroside in tissue macrophages. 3. Anticoagulants The thrombolytics/anticoagulants segment is one of the smaller biologics markets (in competizione con i farmaci di sintesi assunti per via orale) and has been experiencing consistently declining sales. The past ve years have seen combined US sales for molecules in this category contract from $347 million in 2004 to $328 million in 2009. This decline in sales is likely due to several new small-molecule anti-coagulants that have reached the market. - Activase (tissue plasminogen activators (tPA)): thrombolytics from CHO cells. Treatment of acute massive pulmonary embolism (une 1990); acute myocardial infarction (accelerated infusion) (April 1995); ischemic stroke within 3 to 5 hours of symptom onset (June 1996). Primo farmaco ad essere stato fatto nelle CHO. - Retavase (modi ed human from E.Coli) : copia modi cata del tPA per vere e etto ancora più veloce. - Metalyse (mdoi ed human from CHO cells): is used to treat adults suspected of having an acute myocardial infarction (heart attack) and embolism within six hours of the rst symptoms appearing. It is used to dissolve the blood clots that have formed inside the blood vessels supplying the heart. Use to treat ischemic strokes. The active substance in Metalyse, tenecteplase, is a modi ed copy of the human enzyme ‘tissue plasminogen activator’, which the body uses to break down clots. It works by converting a protein in the clots called plasminogen into its active form, plasmin, which breaks down the brous protein holding the clot together. With the blood clot broken down, blood can ow more easily into the heart muscle, allowing the heart to keep working and helping to save the patient’s life. fi ff fi fi fi fi fi fi fi fl fi