Demostración HQ de enzimas. Generalidades PDF

Demostración HQ de enzimas. Generalidades Jorge Carrasco Sanhueza Tecnólogo Médico Morfofisiopatología y Citodiagnóstico Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna Concepto: Enzimas Compuesto de naturaleza proteica presente en todos los tejidos y cuya función consiste en...

Demostración HQ de enzimas. Generalidades Jorge Carrasco Sanhueza Tecnólogo Médico Morfofisiopatología y Citodiagnóstico Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna Concepto: Enzimas Compuesto de naturaleza proteica presente en todos los tejidos y cuya función consiste en catalizar reacciones bioquímicas al interior de la célula. Son biocatalizadores eficientes(sensibles) y específicos. (sustrato determinado). Las enzimas disminuyen la energía de activación, acortando tiempos, disminuyendo temperatura de reacción, etc. Esquema de reacción enzimática Concepto: Enzimas Presentan gran capacidad de regulación, y todo dependerá de la vía metabólica donde éstas se encuentren. Las enzimas presentan una subunidad catalítica y otra regulatoria. En histoquímica interesa la localización y actividad de las enzimas. Modelo encaje inducido de Koshland Importancia de su demostración. La IHQ aporta información en cuanto a la enzima como proteína antigénica. (localización). En HQ, detectamos la actividad de la enzima, (sustrato por acción enzimática puede sufrir hidrólisis; reducción; oxidación y generar un producto. IHQ / HQ enzimática Factores que influyen en la actividad enzimática 1.-Temperatura: siempre considerar las reacciones a t° fisiológica 2.-Ph: considerar el pH de acción óptima de cada enzima 3.-Concentracion de los componentes de la reacción: a- concentración de la enzima b- concentración del sustrato c- concentración del producto d- concentración de los electrolitos del medio. Clasificación de enzimas 1. Hidrolasas 2. Oxidoreductasas 3. Transferasas 4. Liasas 5. Ligasas o sintetasas 6. Isomerasas Consideraciones técnicas (KIERNAN) Preparación del tejido: El tejido debe congelarse rápidamente. Se recomienda utilizar tejidos sin fijar. Si se elige fijar, el químico no debe inhibir la actividad enzimática. Condiciones de la reacción: La incubación debe realizarse a 37°C excepcionalmente a 4ºC) Las plantas desarrollan actividad enzimática a 25° C. Para menor difusión de enzimas se recomienda usar temperaturas de incubación mas bajas. Consideraciones técnicas: fijación El tejido se prepara con la intención de mantener la localización de la enzima y a conservar su actividad. La fijación química puede desnaturalizar la enzima que queremos demostrar. La T°, el pH, el tipo de fijador son variables que debemos considerar estrictamente. Muchas de las enzimas que deseamos estudiar son solubles, por lo que la fijación contribuiría a la insolubilización de las mismas. Consideraciones técnicas: fijación Idealmente se estudian en estado fresco sin fijar o se congelan y cortan en criostato. Enzimas que resisten bien la fijación: Tiempos breves y a baja T°. Objetivos de fijación y conservación de actividad enzimática Objetivos de la fijación del tejido Conservar la morfología Insolubilizar la enzima Aumentar la permeabilidad de la célula. (La fijación permite hacer permeable la célula a los productos presentes en la mezcla incubadora) Manejo de la conservación enzimática. 1. Congelación- criosustitución 2. Tejido sin fijar: corte por congelación; fijación post corte y post reacción 3. Breve fijación previa al corte por congelación Tipos de reacciones histoquímicas Existe 5 tipos de reacciones histoquímicas disponibles para demostración de enzimas Método de precipitación de metales Método de copulación simultanea Método de postcopulacion Reacción con sustrato coloreado Reacción con sustrato incoloro 1.- Método de precipitación de metales según gomori Método antiguo de múltiples pasos El sistema de captura y transformación química entre las distintas soluciones sirve de base para los métodos actuales 2.- Método de copulación simultanea Método mas usado en demostración enzimática. La unión o “copulación” es formada por la enzima y un sustrato adecuado, conocido como producto primario de reacción (PPR). Este PPR se combina con la sales de diazonium (SD) formando el producto final de la reacción (PFR) el cual es coloreado S + E = PPR + SD = PFR Problemas de difusión con el PRP : – Proporción de hidrólisis del sustrato – Coeficiente de difusión del PRP por el buffer – Proporción de acople del PRP con la sal de diazonio 2.-Método de copulación simultanea Estos factores pueden ser controlados para mejorar la localización de la enzima, alterando el sustrato usado y modificando la sal de diazonio. El tipo de sustrato usado, la elección de la sal de diazonio, y la proporción de acople afecta la proporción de hidrólisis. Si la concentración de sustrato soluble es muy alta entonces la proporción de hidrólisis del sustrato se puede inhibir El medio buffer debe tener un pH en el cual la enzima exhiba su máxima actividad y el sustrato muestre una razonable solubilidad. La sal de diazonio se incluye en el medio de incubación y requiere un pH óptimo para una proporción de acople más eficiente Y también tiene una concentración crítica, de manera que un exceso de sal de diazonio causaría una inhibición de la proporción de formación del PRF. 3.- Método de postcopulacion La enzima reacciona con un sustrato apropiado formando un producto primario de la reacción Se somete a un segundo paso de incubación. Se forma un producto final coloreado estable e insoluble S + E = PPR + AC = PFC Método que demanda mayor tiempo. La localización suele ser deficiente por la difusión de los productos. 3.-.Método de postcopulacion Ventaja : Se puede usar diferentes pH en cada incubación.(pH óptimo para la hidrólisis del sustrato). Desventaja : es que el PRP es frecuentemente soluble (difusión del PRP ocurre antes del acoplamiento ). 4.- Reacción con sustrato coloreado Pocas enzimas permiten este método Se utiliza un sustrato coloreado (Sc) que también es soluble. Durante la reacción enzimática se remueven grupos solubles del sustrato sin verse afectado el color. El producto primario de la reacción es insoluble y coloreado a la vez (PPRc) Sc + E = PPRc 5.- Reacción con sustrato incoloro Este método utiliza un sustrato soluble incoloro(Si) Tras la reacción enzimática debido a rearreglos intermoleculares se genera un producto de reacción coloreado e insoluble Si + E = PPRc En M:E se utiliza mucho este tipo de reacción ya que es fidedigna en cuanto a su localización. Es característica de las oxidoreductasa. En ella el sustrato es soluble e incoloro cuando se encuentra oxidado e insoluble y coloreado en estado reducido.  Sales de diazonium y azocopulacion sales de diazonio pueden acoplarse con compuestos aromáticos muy reactivos como fenoles y aminas aromáticas para dar lugar a azocompuestos, muchos de los cuales son sustancias coloreadas que reciben la denominación de colorantes azoicos. Sal Diazonio + Azocopulacion Compuesto grupo fenol de tirosina azoico coloreado Sales de diazonium y azocopulacion Reaccionan con el PRP de las reacciones histoquímicas enzimáticas para producir un producto de reacción altamente coloreado e insoluble. Las sales en si mismas son incoloras pero unas pocas son colorantes por ejemplo la pararrosanilina. Enzimáticamente los componentes libres de naftol, se acoplan con las sales de diazonio, se forma el grupo cromóforo azo el cual es visible como reacción coloreada. La solubilidad de las sales de diazonio es limitada especialmente en el rango de pH alcalino. Sales de diazonium y azocopulacion Los sustratos, sales de diazonio y otros reactivos químicos se deterioran con el tiempo produciendo ocasionalmente falsos positivos. Un control positivo debería incubarse junto al tejido en estudio para verificar la reactividad de las soluciones. La omisión del sustrato del medio de incubación y la inclusión de inhibidores específicos de la enzima constituyen un control adecuado. Controles enzimáticos Inhibidores competitivos se agregan a la solución de incubación. Los cortes también pueden ser pretratados en agua hirviendo por unos pocos minutos y seguir con el protocolo original. También se puede “incubar” los cortes en agua destilada. En todos los casos la ausencia de un PFR indica que los resultados positivos obtenidos con la técnica enzimática desarrollada nos entregan información útil respecto de la distribución de la enzima. Aplicaciones de las técnicas enzimáticas Biopsias de musculo esquelético Detección de ganglios y tejido nervioso en diagnóstico de enfermedad de Hirschprung Demostración de alteraciónes enzimáticas en biopsia yeyunal Identificación de células de sistema hematopoyético Demostración de mastocitos Actividad osteoblástica Estudios neurohistologicos complejos Sigue siendo una herramienta fundamental para estudios musculares y enfermedad de Hirschprung. 1.- Fosfatasas Hidrolizan ésteres de ácidos fosfóricos. Se clasifican según su acción a pH óptimo. Las que muestran su máxima actividad alrededor de un PH 9.0 son Fosfatasas alcalinas y alrededor de pH 5.0 Fosfatasas ácidas. Son inespecíficas debido a que catalizan la hidrólisis de un amplio rango de ésteres de fosfatos orgánicos. Las fosfatasas pueden ser divididas en: – Fosfatasas alcalinas. – Fosfatasas ácidas – Fosfatasas específicas 1.1.- Fosfatasas alcalinas Se localizan en la membrana celular del riñón ( y otros tejidos). Son Enzimas hidrolíticas responsables de la ruptura de los ésteres de fosfato por la introducción de una molécula de agua. No son específicas con respecto al OH ligado al ácido fosfórico, por lo tanto hidrolizan gran variedad de fosfatos orgánicos. Actúan a pH entre 8,6 y 9,4. La mayoría de las fosfatasas requieren como activador el Magnesio. 1.1. Fosfatasas alcalinas La fosfatasa alcalina actúa sobre un éster fosfórico( sustrato) desdoblándolo en alcohol aromático más ácido fosfórico. Procesamiento Tejido fresco El fijador ideal es el OH absoluto a 4° C o acetona fría. Los métodos de inclusión rutinarios con parafina( 57-58°C) (excepcionalmente 42 a 44°C ). El secado de muestras se realiza a 35° C. 1.1.a.- Fosfatasas alcalinas: captura de ion por sales metálicas.(Método de calcio de gomori 1951). Reacción de post acoplamiento en la cual la enzima hidroliza el sustrato, beta glicerofosfato de sodio para producir iones de fosfato. Este PRP reacciona con iones de calcio para formar fosfato de calcio Nitrato de cobalto para producir un precipitado de fosfato de cobalto(incoloro) debe ser diluido con sulfuro de amonio para producir un precipitado o depósito granular de sulfuro de cobalto, negro y visible. 1.1.a.- Fosfatasas alcalinas: captura de ion por sales metálicas.(Método de calcio de gomori 1951). 1.1.a.- Fosfatasas alcalinas: captura de ion por sales metálicas.(Método de calcio de gomori 1951). 1.1.a.- Fosfatasas alcalinas: captura de ion por sales metálicas.(Método de calcio de gomori 1951). El método sugiere fijación en formol calcio a 4°C y cortes en criostato. La mezcla incluye: Beta glicerofosfato de sodio al 2% 2,5 ml. Veronal de sodio al 2% 2,5 ml. Nitrato de calcio al 2% 5 ml. Cloruro de magnesio al 1% 0,25 ml. Agua destilada 1,25 ml. El pH final de la mezcla de incubación está entre 9 y 9,4. El veronal de sodio actúa como buffer y los iones de magnesio como un activador enzimático. 1.1.b.- Captura simultanea con colorantes azoicos. Menton 1944 y gomori 1951 Este tipo de reacción implica el uso de sales de diazonio que proveen un medio de localización visible del PRP producido por la acción de la enzima sobre el sustrato. Se puede emplear dos tipos de sustratos: 1.- Fosfato orgánico simple (alfa naftil fosfato de sodio), el PRP formado por la hidrólisis enzimática es moderadamente insoluble (difusión leve). La hidrólisis de éste sustrato produce alfa naftol. El PRP es acoplado a una sal de diazonio por ejemplo el fast red TR. 1.1b.- Captura simultanea con colorantes azoicos. Menton 1944 y gomori 1951. 2.- Fosfato comercial (Naftol AS-BI fosfato). El PRP con éste sustrato es completamente insoluble , la difusión del PRP es mínima, permitiendo una mejor localización del PRF obtenido. DESVENTAJA: Alto costo. VENTAJAS: mejor localización del PRF y la estabilidad de las soluciones que contienen sustitutos del naftol. El principio de la reacción es similar al que ocurre con el alfa naftil fosfato (pero es altamente insoluble en agua). La hidrólisis del sustrato produce un derivado de naftol insoluble el cual es acoplado a una sal de diazonio como fast red TR para producir un colorante azo insoluble de color rojo en el sitio de actividad enzimática.. Reacción del alfa-naftol con fosfatasa alcalina; formación con sal de diazonium con posterior formación de colorante azoico 1.2.- Técnicas para demostración de fosfatasas acidas El principio de estos métodos es similar al descrito para Fosfatasas alcalinas. Precipitación metálica La técnica de precipitación metálica descrita por Gomori y usada para la demostración de actividad enzimática de F. alcalinas solo modifica el pH del medio de incubación a 5.0. La hidrólisis del sustrato produce iones fosfato como PRP, que serán tratados con otros iones metálicos (Calcio, y cobalto) para producir un precipitado metálico incoloro que finalmente será tratados con sulfuro de amonio para producir un precipitado visible de sulfuro metálico en el sitio de actividad enzimática. Método de precipitación metálica para fosfatasas acidas Fosfatasa acida con naftol y sal de diazonium Métodos para demostración de fosfatasas especificas c.- ATPasa: Técnica de precipitación metálica. El sustrato es el ATP. es la técnica de elección para el estudio de músculo esquelético. También puede ser demostrada por precipitación metálica de Gomori usada para la demostración de Fosfatasas alcalinas. d.- Esterasas: Se fija el tejido en OH absoluto a 4°C por 18 hrs para cortes en parafina. Fijación en formol Baker a 4°C por 3 hrs. y cortes en congelación. Cortes en críos tato de tejidos sin fijar, recibirlos en porta, secar por 30 minutos, fijar en acetona a 4°C por 15 minutos.