Métodos de Identificación de Lípidos - Clase 7 HQ

CLASE 7 HQ 21.09.21 MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS Existen colorantes ácidos, básicos y neutros y también otros indiferentes. Los lípidos se estudian con colorantes indiferentes, los lisocromos. LISOCROMOS: son colorantes azoicos, el cromóforo es azo y se caracterizan por ser más sol...

CLASE 7 HQ 21.09.21 MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS Existen colorantes ácidos, básicos y neutros y también otros indiferentes. Los lípidos se estudian con colorantes indiferentes, los lisocromos. LISOCROMOS: son colorantes azoicos, el cromóforo es azo y se caracterizan por ser más solubles en el lípido que en el solvente que los contiene. Existen métodos no convencionales como la polarización para identificar a algunos lípidos y puede ser más certeros en algunos casos porque el gran problema es conservar los lípidos, la fijación es compleja porque posterior a la fijación hay un proceso que acabaría con todos los lípidos porque pasa por muchos alcoholes. Por lo tanto, las únicas posibilidades para cortes en parafina son unos lípidos complejos que son glucolípidos (cerebrósidos, sulfátidos, galactosos, etc. Gran variedad de glicolípidos que están presentes en el cerebro) que provocan enfermedades como GOCHÉ, NEMIAN PIK, TAY SACHS, que son enfermedades muy serias.  AQUÍ NO SE FIJA CON LA FIJACIÓN CONVENCIONAL.  Todos los lípidos de carácter neutros se identifican en tejidos congelados (frescos) a -80° y se puede pasar en nitrógeno, pero nunca pasa por un fijador ni por un reactivo químico.  Después de la conservación va el corte y después del corte va la tinción con algún lisocromo y listo. LÍPIDOS Constituyen un grupo químicamente muy diverso. Formados básicamente por carbono hidrógeno y a veces también oxígeno. Pueden contener también fósforo, nitrógeno y azufre Su característica común es que:  Son insolubles en agua  Son solubles en disolventes orgánicos, como éter, cloroformo, benceno, etc. QUÍMICA Constituidos por C, H y a veces también por O (por lo tanto teniendo C, H Y O sabiendo la química, yo podría usar el PAS ya que podría formar aldehídos pero deben tener las condiciones que tienen los hidratos de carbono, lo fundamental es que los carbonos tiene que ser vecinos y estar unido a un grupo hidroxilo, no estar a una distancia no mayor a 1,1 nm [entre 1 nm y 1.1 nm] para representar la misma distancia que tiene la molécula de colorante por lo que no todos los lípidos cumplen ese requisito, hay muchos que son de carácter hidrofóbicos). FÍSICA Son insolubles en agua, pero solubles en los solventes orgánicos, como el ETANOL, XILOL, en general por orgánico entendemos todo aquello que responde a la química del carbono, que está compuesto por carbono, todo lo que es inorgánico es lo que no poseen carbono en su estructura. Por lo tanto, todos aquellos compuestos que actúen como solvente y que puedan disolver algún soluto y que sean de origen orgánico puede solubilizar los lípidos.  La baja solubilidad de los lípidos se debe a que su estructura química es fundamentalmente hidrocarbonada, con gran cantidad de enlaces C-H y C-C La propiedad física de solubilidad se da por una razón química porque su estructura está compuesta por ese tipo de enlace y ese tipo de enlace lo hace hidrofóbico porque no tiene muchas capacidades de combinarse con agua, por lo que los hace de baja solubilidad o insoluble completamente. FUNCIONES DE LOS LÍPIDOS  Función de reserva  principal reserva energética del organismo  Función estructural  bicapas lipídicas de las membranas  Función biocatalizadora  vitaminas lipidias, hormonas esteroideas, entre otras. Una estructural y una de reserva y en algunos libros se describe una biocatalizadora con relación a las hormonas y a las vitaminas de carácter lipídico, pero es menos importante para nosotros. Nos interesan las dos primeras porque ahí se buscan nuestros lípidos, si yo tuviera que buscar un control de lípidos, no iría a buscar un trozo de tejido adiposo, de una mama, porque no entrega todos los elementos diferenciadores que yo requiero. En cambio, en la función de reserva yo puedo tomar un pedazo de músculo cortado transversalmente (la estructura del músculo está constituido por distintos tipos de fibras y las tipo 1 y tipo 2 se diferencian por la cantidad de lípidos que contienen vs la cantidad de glucógeno que tenga la otra, por lo tanto en una encontraremos glicógenos, en otra encontraremos lípidos)  FUNCIÓN DE RESERVA: Principal reserva energética del organismo en ausencia de azúcares. ese tipo de funciones de reserva solo lo podemos abordar con tejidos frescos porque lo que vamos a encontrar ahí van a ser lípidos dispuestos en gotitas que con el microscopio se pueden observar y se ven muy linda con la tinción en rojo cuando se hace con oil red o en negro cuando se hace con sudan blanck.  FUNCIÓN ESTRUCTURAL: la bicapa lipídica que podemos encontrar en la membrana celular está compuesta por proteínas también por lo tanto ahí podríamos tener un pequeño apoyo para procesar muestras congeladas todavía o frescas pero fijadas, y se puede fijar con formol calcio. ¿CÓMO SE PUEDE FIJAR CON FORMOL CALCIO? R: El formol calcio es una de las combinaciones de formaldehído que podía facilitar la conservación de fosfolípidos o de todos los lípidos que están asociados a proteínas porque la formalina actúa directamente sobre las proteínas y el calcio como es catión actuaría sobre la estructura ácidas de los ácidos grasos presentes en la estructura del fosfolípido, por lo tanto, este es un fijador recomendado. ¿Ahora que es lo que tenemos presente a la hora de fijar es que vamos a poner por 24 hrs el musculito dentro del frasco y por inmersión vamos a esperar que se fije con formol calcio para que lo fije? R: no, el tejido sigue siendo fresco lo que vamos a fijar nosotros es el corte, es diferente a la estructura convencional de lo que nosotros hacemos. Lo que se hace en este caso, es tomar el tejido, lo congelamos ya sea a -80°C o con nitrógeno líquido con isopentano o con sucrosa o algún conservador que evite el daño de la muestra, una vez lista la muestra para el criostato, la ponemos en su molde, la cortamos y ese corte que vamos a recoger en la lámina lo dejamos en frío hasta terminar de hacer todos los cortes si es que vamos a hacer más cortes, una vez listo para la tinción, preparamos todos los reactivos y vamos a la tinción, cuando vamos a hacer la tinción se pone 10 min de fijación la lámina en formol calcio osea en el primer paso del procedimiento de tinción va a ser la fijación con formol calcio para que en ese corto lapso de tiempo pueda retener los lípidos presentes en la membrana y no solo en la membrana, si hubieran más lípidos también puede servir para los músculos. (PPT 2020) Componentes de los lípidos: Ácidos grasos  Formadas por una larga cadena hidrocarbonada de tipo lineal, y con un número par de átomos de carbono.  Tienen en un extremo de la cadena un grupo carboxilo (-COOH).  Representado por RCOOH Se conocen unos 70 ácidos grasos que se pueden clasificar en dos grupos  Los ácidos grasos insaturados  Los ácidos grasos saturados CLASIFICACIÓN DE LÍPIDOS  Consisten en una cadena de ácido graso y uno o más grupos como fósforo o nitrógeno.  Se localizan en cerebro y SNC  Ej: fosfolípidos, esfingolipidos, cerebrosidos, etc. 1. LÍPIDOS SIMPLES: En su forma monomérica no aportan nada para el estudio 2. LÍPIDOS COMPUESTOS: Cadena de ácido graso y uno o más grupos como fósforo o nitrógeno. Se localizan en el SNC (cerebro idealmente) Pueden ser conservados por una fijación leve. Ej; cerebrósidos, esfingolípidos, fosfolípidos, etc. 3. LÍPIDOS DERIVADOS: Ac grasos que pueden originarse de lípidos simples o compuestos por hidrólisis, colesterol, ácidos biliares, hormonas sexuales, adrenocorticales. No tienen relevancia histopatológica porque la presencia de estas macromoléculas es para los bioquímicos. (técnica de schultz para el colesterol, pero se hace en cortes en parafina y fijación) Lo que, si nos interesa, es la clasificación histoquímica de los lípidos: SE CLASIFICAN POR:  HIDROFÍLICOS (se puede llegar con colorantes en cortes congelados con colorantes como el sulfato azul de Nilo o el reactivo de shift que es acuoso).  HIDROFÓBICOS (solo se puede acceder mediante la disolución por lo tanto se ocupan los lisocromos, uso de solvente alcohólicos para acceder a ellos).  ÁCIDO, NEUTRO, BÁSICO (pero nos centramos en ácidos y neutros no más) Con los lisocromos podemos identificar los ácidos y los neutros de forma separada PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS  El punto de fusión de un lípido es inversamente proporcional a la longitud de su cadena de ácido graso constituyentes, osea, que el punto de fusión es más bajo (desarmar la cadena de lípido (fundir)) cuando la cadena es más larga. Esta propiedad solo nos sirve para hacer un control negativo, pero no es selectivo, es general en lípidos neutros y ácidos, no distingue).  Saber si son hidrofóbicos o hidrofílicos.  Saber la superficie del líquido porque esta determinará su permeabilidad con reactivos acuosos o solventes orgánicos, saber a qué colorantes son más permeables. Si es hidrofílico es más permeable a los colorantes preparados en agua.  Los fosfolípidos contienen grupos básicos polares que son de carácter hidrofílicos.  Los glicolípidos ácidos (gangliósidos) y los glicolípidos neutros (cerebrósidos) también son hidrofílicos (colorantes acuosos) (podemos usar metacromasia también)  Los lípidos no conjugados, no polares (colesterol y ácidos grasos libres) son hidrofóbicos y se trabaja con colorantes alcohólicos. ESTER: Estado intermedio de los lípidos o de los ácidos carboxílicos cuando pierde un hidrógeno se transforman en un éster, se esterifican, pero a nosotros no nos sirve mucho saberlo. FORMAS DE PRESENTACIÓN  Pueden presentarse en forma de gotas o unidos a otros componentes del tejido  Los lípidos libres no se ven habitualmente, los de forma de gota porque son demasiado pequeños, están como en estado monomérico y nos cuesta mucho conservarlos e interpretar los resultados, por lo tanto, no es una buena forma de identificarlos.  Las grasas simples en tejidos congelados y algunos lípidos como los fosfolípidos y en particular la oxidación de los lípidos como la lipofuscina podrían resistir el procesamiento, de hecho, la lipofuscina se identifica en tejidos en parafina. FIJACIÓN  El método ideal para el estudio de lípidos es la fijación física mediante congelación.  El formaldehído reacciona con grupos C=C y –SH de los enlaces insaturados de los lípidos.  El formol calcio entrega niveles superiores de conservación Método ideal para estudio de lípidos, es la congelación. Si dentro de lo que tenemos que estudiar dentro de los lípidos son los fosfolípidos, hay excepcionalmente algunas formas de conservar algunas estructuras lipídicas importantes a través de la combinación del formol con el calcio (formol calcio). Sin embargo, los lípidos no se insolubilizan tras la fijación con formaldehído por lo que una gran parte se pierde durante el almacenamiento prolongado. Se disuelven con alcohol y xilol. MICROTOMIA  Se recomienda el corte por congelación en criostato  Para bloques en parafina, se recomienda enfriar bastante los bloques, aumentar micrones de corte y enfriar levemente la navaja CONTROLES  Se deben usar para validar cualquier método  Hay como 5 o 6 controles, pero lo que interesa saber es que los controles deben ser por la extracción del líquido, en el fondo es un control negativo. Sí cuando queremos extraer glucógeno, lo que queremos hacer es solubilizarlo, en los lípidos se hace lo mismo.  Si tenemos dos cortes, un corte se deslipida (se le sacan todos los lípidos y se tiñen juntos) 1. EXTRACCIÓN CON ACETONA: Si los lípidos son hidrofóbicos los que se van a eliminar, la acetona es lo recomendado. 2. DESLIPIDACIÓN: Si hay que eliminar todos los lípidos, neutros y ácidos se extrae con cloroformo, metanol, HCL concentrado y agua destilada. 3. CONTROLES POSITIVOS: se pueden conservar tejidos grasos a -70°. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS  La acetona fría remueve glicéridos.  La acetona caliente remueve cerebrósidos.  El cloroformo y metanol caliente remueve todos los lípidos. La interpretación incluye la comparación de las láminas y nos indica la distribución general del material lipídico. (Formas de control que hemos visto: HIDRÓLISIS - DIGESTIÓN ENZIMÁTICA - BLOQUEOS QUÍMICOS - PH SELECTIVO - DESLIPIDACIÓN (extracción de lípidos con solventes orgánicos como el alcohol, metanol, acetona). Hay una clasificación para identificar los lípidos, con distintos métodos. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS Para comprender el fundamento se debe asociar: propiedades fisicoquímicas del lípido en estudio, propiedades y características del método o reactivo químico utilizado, se recomienda la tabla 12.2 del capítulo de lípidos en la página 190 del banco 2007. 1. MÉTODOS FÍSICOS SIN COLORANTES: con luz polarizada o microscopio de fluorescencia primaria se podrían ver los lípidos sin necesidad de teñirla, ni nada. Esta fluorescencia es propia de los lípidos. 2. MÉTODOS FÍSICOS CON COLORANTE: se llaman físicos porque el fundamento de acción no es la afinidad química, ni la polarización, ni nada químico, solo se trata de solubilidad. El lípido se prepara en n alcohol, solvente alcohólico, el alcohol de 70° hay algunos protocolos que dicen que el de 80° también y se pone en contacto con la lámina, si la lámina tiene muchos lípidos, nuestro colorante se va a ir a solubilizar en el lípido y va a abandonar el solvente alcohólico y así se traspasa al tejido (generar el cambio de color por solubilizar el colorante es el sudan black). 3. MÉTODOS QUÍMICOS PARA LÍPIDOS COMPLEJOS: permiten detectar lípidos específicos. Los colorantes lisocromo, no tienen auxocromos, como la HX por ejemplo que tampoco tiene y requiere de un mordiente para unirse al tejido. pero aquí no se unen a un mordiente químicamente, estos colorantes se disuelven en los lípidos para poder colorear, entonces si no hay lípidos en la lámina que estoy tiñendo no marca la tinción. Si pongo una lámina y se ve que en determinadas fibras de un tejido muscular, por ejemplo, aparece lleno de depósitos al interior de cada fibra gotitas de color negro, es porque hay lípidos, pero el mecanismo no es químico, simplemente son más soluble los colorantes lisocromos en el lípido que en el solvente por eso es físico. Prueba de esto sería: si yo en vez de ocupar el sudan black (lisocromo) en el alcohol de 70° lo usara en alcohol de 95°, el lípido que estaba en el tejido, se pierde, el colorante no alcanza a solubilizarse en el lípido por lo que no se tiñe y luego se fue bajando la graduación de alcohol hasta confirmar que el de 70 mantiene los lípidos. Si se hace con una graduación más baja, como 50° se tiñe, pero no es específica la tinción. en el fondo es una competencia entre el solvente en el que está preparado y el lípido y el colorante tiene más afinidad por el lípido en el alcohol de 70° El otro colorante lisocromos que conocemos es el oil red, este colorante no se prepara en alcohol de 70° pero se puede preparar igual y las gotitas se verian de color rojo pero en este protocolo se usa alcohol isopropilico y cuando se usa este alcohol, la marcación es mucho más limpia, también este tiene una graduación mucho menor que el etanol por lo tanto por lo tanto se puede usar como solvente (Cuando hablamos del amiloide decíamos que era anisotrópico, es decir, no hay un equilibrio en las angulaciones que tiene esta estructura beta plegada por lo tanto la luz no pasa de una sola forma como si fuera isotrópica, Si fuera isotrópica la luz pasaría por esta superficie uniforme de manera única, genera una refracción muy débil) MÉTODOS FÍSICOS SIN COLORANTES: Luz polarizada  La grasas neutras y ácidas son isotrópicas (amiloide es anisotrópica)  El colesterol y sus ésteres muestran birrefringencia, agujas romboides y patrones en cruz de malta.  La naturaleza grasa de cualquier birrefringencia debe ser confirmada con una lámina de control (extracción por 10 min con cloroformo y metanol 2:1).  No se usa clínicamente debido a que patrones ópticos similares pueden observarse en distintas estructuras químicas, de modo que no es posible concluir respecto de la naturaleza química de los lípidos.  Los resultados son variables dependiendo del estado de los lípidos y del tiempo de examinación. Generalmente, cualquier lípido en su estado cristalino puede ser birrefringente. MÉTODOS FÍSICOS SIN COLORANTES: FLUORESCENCIA PRIMARIA  Algunos lípidos y sus derivados oxidados exhibirían fluorescencia distintiva  La fluorescencia primaria no es usada como una herramienta clínica positiva para la identificación de lípidos.  Las lipofuscinas, ciertos corticoesteroides y estrógenos son algunos de los mejor conocidos lípidos fluorescentes. MÉTODOS FÍSICOS SIN COLORANTES: FLUORESCENCIA SECUNDARIA  Fluorocromos: Azul de metileno, tioflavina S, rodamina B, rosa bengala, rojo Magdala, etc. MÉTODOS FÍSICOS CON COLORANTES (LISOCROMOS)  Los métodos que usan colorantes como el Sudan y el Oil Red O son las técnicas más antiguas y simples para demostración de lípidos. MECANISMO DE TINCIÓN  Estas técnicas implican un proceso físico. Por solubilidad. El colorante es más soluble en los lípidos que en el solvente original por lo que desplaza al solvente y tiñe los lípidos.  Debido a que la tinción es de naturaleza física, los lípidos químicamente diferentes no pueden ser distinguidos debido a que todos ellos exhiben similares características de tinción. Muestran similares características de tinción ósea que, si hay lípidos diferentes, no pueden ser diferenciados. ALGUNOS SON:  OIL RED: Lisocromo que actúa por disolución en el lípido, es decir por coeficiente de reparto. Tiene los lípidos neutros.  SUDAN IV: Es un lisocromo diazo, actúa por coeficiente de reparto. Tiñe los lípidos neutros.  SUDAN BLACK: Es un lisocromo diazo, actúa por coeficiente de reparto. Tiñe los lípidos en general.  SULFATO AZUL DE NILO: No es un colorante puro, posee una oxacina (colorante básico, por lo que tiñe los lípidos ácidos como gangliósidos o sulfátidos) y una oxazona (actúa como lisocromo tiñendo los neutros). Cuando estamos estudiando por ejemplo el músculo y queremos ver las fibras tipo 1 y tipo 2 diferenciadas a través de lípidos usamos el oil red o el sudan lV y no se usa el sudan black porque no queremos teñir todos los lípidos si usáramos ese nos confundiría el fondo porque va a teñir dentro de las fibras, entre cada fibra, al interior y se vería muy sucio por lo tanto en el músculo se usa el oil red y el sudan 4. LISOCROMOS: MÉTODO DEL SUDAN NEGRO (LISON)  La muestra debe ser fijada en Formol Calcio o Formol al 10%  Colocar los cortes en alcohol de 50% y 70%, durante 2 minutos cada uno  Teñir en solución saturada de negro sudan preparada en alcohol de 70%, durante 3 minutos.  Lavar en alcohol de 70%, 50%, durante 30 segundos cada uno  Lavar en agua destilada  Montar en medio acuoso, Gelatina-Glicerina Resultados: Los lípidos identificados serán teñidos de color negro. APLICACIONES DIAGNÓSTICAS  Para grasas simples es el oil red o, sudan black se utilizan para demostrar lípidos en locaciones inadecuadas tales como el riñón y el cerebro. (Hay un tumor de células claras del riñón, el patólogo si ve células claras podría hacer un estudio de lípidos o podría hacer un paso para descartar).  También cuando las células sufren cambios degenerativos, la membrana lipídica se desorienta y se hace afín a los colorantes de grasas simples. (en la práctica no tiene mucha utilidad porque es raro que se quiera estudiar tejido degenerativo en tejidos frescos, por lo tanto, no se estudia). La característica que define a un colorante o a la coloración es cuando una vez aplicado sobre el tejido y lavado con el mismo solvente no se va. Si el solvente es alcohol y se lava en alcohol, el colorante no se me va, al igual que si el solvente es agua y lavar en agua tampoco se va la coloración. La tinción de grasas simples tales como el Oil red O y sudan Black B son útiles para lo siguiente: 1. Se puede demostrar grasas en localizaciones inadecuadas tales como el riñón o el cerebro. 2. Cuando las células sufren cambios degenerativos, la membrana lipídica se desorienta y se hace a fin a los colorantes de grasas simples.  CLASE 8 HQ 28.09.21 HISTOQUÍMICA DE IONES INORGÁNICOS No existe un método de reemplazo para estas sustancias, solo se hace con un solo método. Los más importantes son la identificación de calcio, de hierro y cobre porque son las 3 de patologías más frecuentes. GENERALIDADES  En esta categoría de iones inorgánicos se encuentran una serie de metales y no metales encontrados en estado fisiológico o patológico y se organizan en: o MINERALES ENDÓGENOS: cobre, calcio y hierro o MINERALES EXÓGENOS: carbón, silicio, asbestos, plomo, berilio, aluminio y plata. Pero solo nos centraremos en calcio, hierro y cobre. ASPECTOS IMPORTANTES: Su detección depende del grado de solubilidad que tenga la sustancia inorgánica y concentración. El calcio se encuentra de dos maneras en nuestro organismo: 1. IONES SOLUBLES: en forma soluble circula por la sangre, accede a todos los sitios del organismo y tiene participación en una serie de procesos, pero nosotros no accedemos a ese calcio porque no podemos hacer estudio en un líquido para identificar calcio o en una citología porque es muy difícil de pesquisas, eso lo hace la bioquímica. 2. IONES INSOLUBLES: es el calcio que se deposita en los tejidos y participan en los procesos patológicos, no difunden y permiten su detección in situ. y tambien se evidencias complejos unidos a proteínas como la hemosiderina. y los insolubles son las sales de carbonato de calcio. CONCENTRACIÓN: Puede estar normal o de forma elevada.  Normal: calcio, hierro y zinc están presentes en suficiente cantidad para permitir su demostración.  Elevada: pueden ser demostrados solo cuando se presentan en alguna enfermedad. Ejemplo: depósitos de cobre.  Intoxicaciones El cobre en un hígado normal por ejemplo si hacemos un estudio de cobre no lo vamos a encontrar porque se encuentra en concentraciones muy bajas y los métodos para el cobre que tenemos son específicos, pero no sensibles o sensible entre comillas porque para las condiciones normales del cobre presente en el hígado no se puede acceder a ellos, habitualmente están unidos a proteína y no hay acceso tan libre al cobre. Al cobre se puede acceder cuando está en un estado de ion ferroso o de ion cuproso y cúprico, pero cuando está libre y ¿cuándo está libre? R: Cuando está en condiciones elevadas, cuando la concentración es tan alta que es posible encontrarlo depositado en los tejidos, en condiciones normales no se encuentra en los tejidos porque forma parte de todos los procesos fisiológicos, solo se encuentra en forma soluble. El calcio, el hierro y el zinc están presentes de forma normal en el tejido, pero con suficiente cantidad para permitir su demostración. Los métodos de estudio para iones inorgánicos se clasifican en dos categorías: 1. QUELACIÓN: El compuesto coloreado es formado por quelación del metal con un ligando orgánico. QUELACIÓN: fenómeno físico químico donde una sustancia conocida “quelante” captura un ion metálico pesado formando un compuesto estable denominado “quelato”. Se estabiliza por enlaces covalentes iónicos y enlaces covalentes coordinados. El hierro unido al grupo hemo de la hemoglobina en los eritrocitos Hay dos agentes quelantes que capturan el ion metálico en el centro y lo estabilizan a través de estos enlaces. enlaces coordinados significa que en la situación que uno de los participantes o el metal no tenga más puntos de unión puede ser facilitado por el agente quelante, este siempre tiene algún doble enlace de oxígeno por ahí que va permitir aportar ese enlace, por esto es más complejo que un enlace simple covalente. Un par de agentes quelantes son capaces de organizarse coordinadamente para capturar un átomo del metal. Es importante grabarse esta imagen porque cuando hablamos del EDTA en la descalcificación siempre hemos dicho que es muy lento y es lento por esta razón porque está sacando selectivamente calcio, solo ese catión, pero lo saca de a uno, lentamente, no lo solubiliza como lo hacen los demás ácidos, este lo extrae de manera individualizada. es más lento y seguro para el tejido porque actúa sólo por el catión y no por las partes landas del tejido. METAL + EDTA = QUELACIÓN Algunos metales fuertemente unidos a ligandos orgánicos (= agentes quelantes) no permiten su demostración como por ejemplo el hierro unido al grupo hemo de la hemoglobina en los eritrocitos. solo necesitamos que el hierro se desprenda para poder identificarlo, por lo tanto si tuviera que encontrar 3 controles para esto, utiliza un tejido para encontrar al hierro solo sería médula ósea, bazo y ligeramente en el hígado porque ahí mueren los eritrocitos y queda disponible el hierro por lo tanto todo el sistema reticuloendotelial es considerado de control positivo para este tipo de sustancia inorgánica porque estos están en tejido normal, pero no es lo recomendable, lo recomendable es buscar un tejido que tenga hemocromatosis o hemosiderosis con esas patologías pero cuando hay que experimentar en el lab se lleva un bazo. (Control positivo siempre debe ser en una muestra patológica). 2. El producto que vamos a identificar lo podemos colorear (este es el que más usamos) entre comillas porque el color al que podemos acceder es azul (identificación de fierro) o negro (uso de tinciones de plata), no hay más variedades EJ: PERLS. MÉTODOS DE ESTUDIO PARA IONES INORGÁNICOS  CALCIO: Alizarina red S (colorante) y Von kossa (método de plata)  FOSFATOS Y CARBONATOS: Von kossa  HIERRO: Azul de Perls (Es el más utilizado en trastornos hematológicos)  COBRE: Método de Rodamina, método del ácido Rubeanico Todas las anteriores son endógenas, cuando están en condiciones normales no se identifican y cuando están elevadas sí)  PLOMO: Método de rodizonato (plomo, silicio y cualquier otro metal que llegue al organismo por alguna razón exógena, porque no forman parte de ningún proceso fisiológico del cuerpo. Es posible identificar, pero no porque esté elevada, simplemente porque no debe estar ahí, está en condiciones de intoxicación). DETECCIÓN HQ DE CALCIO CALCIO INSOLUBLE En forma de sal constituye hueso, dientes en forma de hidroxiapatita (carbonato + fosfato de calcio). Se detecta por el método de Von Kossa, es un método corto, solo dos pasos, se usa con plata.  En forma de sal constituye hueso y dientes en forma de hidroxiapatita ((Ca10(PO4)6(OH)2). Se detecta por método de Von Kossa. IONES LIBRES DE CALCIO En sangre no se pueden detectar, el método del yeso y del oxalato causa formación de cristales de calcio insolubles, pero de localización imprecisa. DEPÓSITOS ANORMALES DE CALCIO Se presentan en áreas necróticas con tuberculosis, infartos, ateromas. Cualquier patología que tenga depósitos de calcio, por ejemplo, cuando estamos estudiando un cáncer de mama o cáncer de tiroides o próstata que se haya calcificado, no es necesario hacer estudio de calcio porque lo vamos a descalcificar y la descalcificación se conoce altiro en la histología, se reconoce el tejido calcificado por lo que no es tan necesario, pero en algunas patologías como musculares si podría ser necesario.  Forman sales de fosfato y carbonato de calcio.  Es muy poco frecuente el estudio de calcio. ALIZARINA RED S Es un colorante que tiene dos funciones, cumple la misma función que el EDTA, es un ligando orgánico (agente quelante), por lo tanto, es un colorante que actúa pro-quelación. Sirve para cortes en parafina y congelados FIJACIÓN: NBF formalina neutra tamponada CORTES: en parafina o congelación El Alizarin Red S es un colorante derivado de la antraquinona. (C.I: 58005). Bancroft dice que el pH es especifico a pH 4,2 pH único de acción, el método seria especifico. pero Kiernan dice que el pH puede variar de pH 4 - 9 por lo tanto no sería especifica la técnica. pero aquí en el laboratorio se hace como bancroft. porque a pH 8 marca menos cosas y más difusas. QUELACIÓN DEL CALCIO POR PARTE DEL ALAZARIN RED S: Las dos moléculas tienen sus ligandos orgánicos disponibles. (el calcio está al medio) Se captura el calcio y se solubiliza (a diferencia del EDTA que captura el calcio, pero lo solubiliza) por eso se puede ver al microscopio el depósito rojo. A la técnica se le puede agregar contraste nuclear con HX de Harris. Es una tinción muy delicada al contrastar, hay que ser muy cuidadoso en los lavados para que no se pierda el tejido. Por lo tanto, lo que hay que saber de la alizarina red s: Que es un método coloreado de identificación de calcio cuyo mecanismo de acción es la quelación. Pasos críticos: el pH, tiene que ser 4,2. Es un método específico, no es sensible, pero a pH 4-9 es sensible porque en ese rango de pH encuentra más depósitos que no se identifican a pH 4,2. El pH constituye a ser una forma selectiva o sensible. Depósitos de calcio en túbulos renales Depósitos de calcio en embrión de rata  Von Kossa  No es un especifico porque tiñe más cosas como los fosfatos y carbonatos asociados al calcio en tejidos calcificados.  Se tratan los tejidos con nitrato de plata 1%  Se reduce con luz solar o bajo una ampolleta de 100 watts durante 15 minutos  Se prepara en agua y se usa solo nitrato de plata al 1% o 5%, el reductor no es químico (no se usa la formalina, ni la hidroquinona, ni el pirocalol) aquí el reductor es por la luz del sol, queda negro donde hay calcio y después de contrasta con un rojo 5 o 10 min y está listo.  Pero nosotros en vez de usar la luz del sol, usamos una ampolleta de 100w por 15 min. En definitiva, lo importante de este método es saber que es un método de plata, se usa plata de un tiempo, no de dos tiempos porque no hay ninguna intervención en la plata, es solo plata y agua, es argirófilo porque requiere de un reductor externo (reductor físico) y es un método físico químico porque aplicamos químicamente una solución y le hacemos una reducción física. histoquímico seria solo la melamina porque tiene un comportamiento argentafin.  Carbonato de calcio o fosfato de calcio + plata = carbonato de plata o fosfato de plata.  Se trata con solución de tiosulfato de sodio  Se puede contrastar con safranina, picro ponso, eosina, etc.  Se trata con solución de tiosulfato de sodio  Se contrasta con safranina.  Es menos especifico que el Alizarin Red S RESULTADOS:  SITIOS CON FOSFATOS Y CARBONATOS INSOLUBLES  negro, café o amarillo  NÚCLEOS  rosados o rojos  DETECCIÓN HQ DE COBRE Histoquimicamente se diagnostica por la enfermedad de Wilson (degeneración hepatolenticular) se acumulan grandes cantidades del cobre en fagocitos en cerebro, hígado y córnea, habitualmente e hígado el tejido de estudio porque a nadie se le saca una biopsia de cerebro.  Tiene baja frecuencia la enfermedad, pero es seria.  El cobre se encuentra unido a proteínas y se libera con vapores de HCL. MÉTODOS DE ESTUDIO: 1. Método del ácido rubeánico. 2. Método de la Rodamina. ÁCIDO RUBEÁNICO  Permite usar cortes en parafina o congelados.  También forma quelatos insolubles con el cobre de color verde oscuro. Solo reacciona con iones cuprosos (cu+1) no reacciona con Cu+2 por lo tanto es específico para cu+1. El ácido rubeánico forma quelatos insolubles con el cobre, color verde oscuro El ácido rubeánico solo reacciona con iones cuprosos Cu+1 ACIDO RUBEANICO Y QUELATOS CON EL COBRE  RODAMINA  Se une solo a iones cúpricos Cu+2 cobre unido a proteína, por lo que se puede encontrar cuando están a una concentración mayor y unidos a proteínas, probablemente el cobre se una al hidrógeno unido al nitrógeno.  Forma un compuesto de color rojo cuando se une al cobre.  No tiene un fundamento claro.  El ácido rubeánico y la rodamina poseen la misma sensibilidad para detectar el cobre, solo que detectan dos colores distintos. La ventaja que tiene la rodamina es que la reconoce también unido a proteínas, la rodamina es más sensible y específica que el ácido rubeánico.  La rodamina entrega una coloración proporcional a la concentración de cobre en el tejido, por lo tanto, otra ventaja es que podría determinar la cantidad de cobre que hay en el tejido. DEPÓSITO DE COBRE EN HÍGADO DETECCIÓN HQ DE HIERRO: MÉTODO DE AZUL DE PERLS Detecta depósitos de Ferritina o hemosiderina que contienen Fe+3 Se tratan tejidos con solución de ferrocianuro y acido clorhídrico El HCL desenmascara el hierro de su forma de hidróxido Fe(OH)3 El ferrocianuro se une a los iones de fierro +3 y forma un compuesto coloreado insoluble de color azul 4Fe+3 + 3[Fe(CN)6]-4  Fe4[Fe(CN)6]3 Sustrato + Reactivo  Producto final coloreado azul  CLASE 9 HQ 05.10.21 HISTOQUÍMICA DE PIGMENTOS PIGMENTOS Son sustancias coloreadas que se encuentran dentro de los tejidos. A veces tienen alguna función fisiológica y en otras ocasiones no. Hay pigmentos que se originan o derivan de alguna alteración metabólica y otros que se originan a partir de un proceso fisiológico, por ejemplo, la liberación del hierro ocurre habitualmente en determinados tejidos 1. ORIGEN ENDÓGENO 1) Pigmentos endógenos a. Hematógenos (molécula de hemoglobina) b. No hematógenos 2) Minerales endógenos 2. Origen exógeno 1) Pigmentos y minerales exógenos 2) Artefactos ENDÓGENOS PIGMENTOS HEMATÓGENOS: por lo general están relacionados con la molécula de hemoglobina, por lo tanto, es uno de los pigmentos detectables, también la hemosiderina (cuando se descompone la hemoglobina, se libera algún anillo pirrólico con fierro); pigmentos biliares que tienen su origen en la sangre, como la bilirrubina o biliverdina, la hematoidina PIGMENTOS NO HEMATÓGENOS: melanina, lipopigmentos MINERALES ENDÓGENOS: cobre, fierro y calcio. PIGMENTOS DE ORIGEN ENDÓGENO: ORIGEN DE SU ACUMULACIÓN  Alteraciones metabólicas con productos celulares normales (ritmo metabólico inadecuado)  Alteraciones genéticas que afectan el metabolismo normal  Acumulación de sustancia anormal. o Acúmulos intracelulares o daño celular  Los pigmentos de origen endógeno se producen en el tejido y cumplen alguna función fisiológica y a veces son parte del residuo o producto de alguna actividad metabólica.  Una alteración metabólica puede ocurrir cuando un paciente se hace una trasfusión de sangre que sea excesiva en volumen, es muy probable que aumente el número de determinados pigmentos como la hemoglobina, hemosiderina, ya que se está insuflando una buena cantidad de glóbulos rojos, por lo tanto, está aumentando enormemente su capacidad para transportar oxígeno. Esto es una alteración metabólica con productos celulares normales. Ejemplo: los residuos que pudieron ser eliminados del hígado, se van instalando en el parénquima hepático y van formando un hígado graso  Alteraciones genéticas, implican una falta de enzima que impide el metabolismo normal de alguno de estos pigmentos, por lo que se va generando un depósito, tal como ocurría con las proteínas beta plegadas en el amiloide. Son insolubles en agua, alcohol, xilol, prafina, etc.  Acumulaciones de sustancias anormales. Por ejemplo, en hemorragia masiva, donde hay gran pérdida de glóbulos rojos y rompimiento de estos, probablemente genere un aumento de la hemosiderina o del fierro.  Plegamiento en el transporte de la proteína, cuando esto ocurre, va formando un depósito de estas proteínas plegadas dentro de la célula  Lo otro, que sería más bien exógeno seria la ingestión de materiales no digeribles, es decir, que a la célula ingresen algunos contenidos que sean pigmentados y son imposibles de sacar najo ningún mecanismo interno de la célula que permita sacar y degradar, lo que da origen a algún pigmento  Se producen en el tejido y cumplen alguna función fisiológica o son parte del producto de alguna actividad metabólica. EXÓGENO  Son aquellos que ingresan al organismo por vía aérea o contacto, la mayoría son minerales con poca pigmentación. No cumplen ninguna función biológica, como la antracosis, el carbón, el sílice o residuos metálicos que se depositan en la gente que trabaja en la faena minera  Pigmentos por origen artefactual puede ocurrir por efecto de la fijación, surge el pigmento formolado donde no está tamponada la solución. También puede ocurrir con los pigmentos metálicos cuando se usa bicloruro de mercurio o algún fijador formador de sal, que generalmente generan pigmentos que pueden inducir a error. Es típico de  la formalina cuando se acidifica y se une a la hemoglobina de los glóbulos rojos, entonces en todos los sitios donde haya glóbulos rojos se verá ese pigmento café  Minerales exógenos como pigmento de tatuajes, de amalgama, carbón, solicio, asbesto, plomo, berilio y aluminio, plata CLASIFICACIÓN GENERAL DE PIGMENTOS  Pigmentos endógenos  Hematogenos  Hemosiderina  Hemoglobina  Pigmentos biliares  No hematógenos  Melanina  Lipopigmentos  Minerales endógenos  Calcio  Cobre  Pigmentos artefactuales  Formalina  Malaria  Mercurio  Oxido crómico  Almidón  Precipitados de plata  Pigmentos y minerales exógenos  Pigmento de tatuajes  Pigmento de amalgama  Carbón  Silicio  Asbesto  Plomo  Berilio y aluminio  Plata PIGMENTOS DE ORIGEN HEMATÓGENO: HEMOSIDERINA Es el pigmento más importante, recurrente. De color amarillo-café, intracelular y se acumula en macrófagos. Es un compuesto insoluble formado por hidróxido férrico más una proteína llamada apoferritina, de vital importancia para el transporte de oxígeno en la hemoglobina. Cuando se quiere identificar se debe separar el ion férrico del hidroxilo y de la proteína, por lo que el método que se va a usar tendrá esta actividad: primero separarlos, el hidróxido y la apoferritina se pierden y luego centrarse en el ion férrico. El 30% del hierro se almacena en el sistema reticuloendotelial, especialmente en la médula ósea El hierro se incorpora en la producción de hemoglobina durante la formación de glóbulos rojos hematíes.  Por exceso de hierro (inyecciones o transfusión de sangre o problemas metabólicos) se produce sobrecarga de hemosiderina.  Por descomposición de la hemoglobina en la globina y el grupo hemo, y posteriormente de éste en hemosiderina y biliverdina.  Soluble en ácidos, insoluble en álcalis, alcohol y agua  La formalina no remueve iones férricos  MÉTODO DE PERLS PARA HEMOSIDERINA  Detecta depósitos de ferritina o hemosiderina que contienen Fe+3. Se usa una solución de ferrocianuro potásico y ácido clorhídrico.  Lo que provoca es que el ácido clorhídrico va a escindir la parte hidróxido Fe(OH)3 y la parte Apoferritina y se va a liberar solo el ion férrico (Fe+3) el que luego se une al ferrocianuro de potasio y se transforma en ferrocianuro férrico, y se forma un compuesto coloreado insoluble de color azul. 4Fe+3 + 3[Fe(CN)6]4  Fe4[Fe(CN)6]3 AZUL DE PRUSIA Sustrato + Reactivo  Producto final coloreado azul (ferrocianuro de potasio)  reactivo  A nosotros nos interesa que reconozca los iones férricos que están en el tejido y no en la solución porque esta empieza a cambiar de color. Por esto, se hace en 2 cambios, cuando lleva 30 min la solución se empieza a poner de color verde, esta se bota y se pone una solución fresca media hora más para no generar fondo y que solo el azul predomine en el tejido  Cuando uno habla sobre hemosiderina y se preguntan algunos aspectos clínicos, está relacionado con el rompimiento de glóbulos rojos, con la liberación del ion férrico en forma de hidróxido y además unido a una proteína  Cuando se habla de aspectos técnicos, se refiere a que: o El tiempo de tinción varía en función de la cantidad de hemosiderina, si luego de la primera media hora esta toda la hemosiderina reconocible no es necesario hacer el segundo cambio. Tiempo máximo 1 hora o La solución de HCl y ferrocianuro se debe preparar al momento de usar (proporción 1:1). El HCl se prepara al 2% al igual que el ferrocianuro. Se mezclan 25ml de cada uno y se aplican a la lamina o Se debe usar control positivo (Ej: un pulmón postmortem producto de falla cardiaca) o Se puede contrastar con fast red o safranina, también se puede usar eosina. El fast red y la safranina además de teñir el fondo, tiñe los núcleos (y la safranina también el citoplasma) PEARLS CONTRASTADO CON FAST RED  HEMOGLOBINA (ppt no lo dijo el profe) Proteína básica conjugada responsable del transporte de O2 y CO2 en la sangre. TECNICA DE LA BENCIDINA  Aplicada sobre tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina  Se ha dejado de utilizar debido al efecto carcinógeno de la bencidina  Se basa en una reacción denominada “pseudoperoxidásica”  La hemoglobina libera oxígeno a partir de agua oxigenada  este oxida la bencidina que es incolora hacia un compuesto de color verde  Actualmente se puede utilizar diaminobencidina que posee menor riesgo carcinógeno  PIGMENTOS BILIARES  En este grupo se encuentran la bilirrubina y biliverdina, que son básicamente el mismo compuesto, pero en distinto grado de oxidación; y la hematoidina, que es poco frecuente, se presenta en tejidos o zonas muy hemorrágicas y de hemorragias frescas, no antiguas. ANILLO PIRRÓLICO  Vida útil del glóbulo rojo 7 días  El grupo hemo se fragmenta formando iones férricos y anillo pirrólico, este último cuando se desprende del ion férrico se denomina biliverdina que es de color verde a azul.  La biliverdina se transporta a los riñones donde se reduce a bilirrubina de color amarillo anaranjado. Se encuentra habitualmente en el hígado, igual que la biliverdina  Control (+) hígado muy afectado o un hígado rechazado  En hemorragias antiguas por ejemplo en bazo o cerebro, se forma un depósito extracelular denominado hematoidina, de color amarillo brillante  Los pigmentos biliares son microscópicamente parecidos a la lipofuscina, la diferencia es que los pigmentos biliares no son autofluorescentes y no generan birrefringencia, la lipofuscina si  En caso de ictericia acentuada pueden acumularse en túbulos renales  En general los acúmulos son de color café amarillento y de localización extracelular  TÉCNICA DE HALL PARA BILIRRUBINA  Para tejido fijado en formalina y cortes en parafina, es permanente  Se usa el reactivo de Fouchet recién preparado (TCA* y cloruro ferrico). El cloruro ferrico se une al pigmento, lo oxida y se transforma en biliverdina, lo que se ve de color verde esmeralda  Ácido tricloro acético  Se contrasta con solución de van gieson PIGMENTOS DE ORIGEN NO HEMATÓGENOS: MELANINA  Es un pigmento de color café claro a negro que se encuentra normalmente en melanocitos de la piel, ojos, folículos del cabello, sustancia gris del cerebro  La DOPA oxidasa (dihidroxifenilalanina oxidasa) o tirosinasa, es la enzima que cataliza el metabolismo de la tirosina, que es un aminoacido que por oxidación da origen al pigmento de melanina. El color café claro o negro tiene que ver con el grado de oxidación que haya alcanzado  Bajo condiciones patológicas se encuentra en células tumorales de nevos benignos, melanomas e hiperpigmentaciones  Lo más importante de esto es detectar una metastasis de melanoma por ejemplo en pulmón  La melanina se produce a partir de la tirosina. La DOPA oxidasa actúa lentamente sobre la tirosina produciendo DOPA (dihidroxifenilalanina), luego la DOPA reacciona con la misma enzima polimerizando y formando melanina. Por lo tanto, una de las formas de  detectar la melanina es identificando la tirosinasa, porque podríamos ponerle el sustrato (tirosina), la enzima del tejido actuaria sobre esta y produciría la melanina  La melanina y sus precursores (DOPA) son capaces de reducir la plata y el ferrocianuro, entonces, si estos se ponen en contacto con la melanina, la plata quedara de color negro y el ferrocianuro de color verde azulado (impregnación metálica, y reactivo ferrico)  Es insoluble en solventes orgánicos, como todos los pigmentos que hemos visto. Esto en la melanina se da debido a que se unen a proteínas en los melanosomas  Se puede blanquear por agentes oxidantes fuertes.  CONTROL POST-BLANQUEAMIENTO una lámina se somete a blanqueamiento y luego se junta con la lámina a estudiar, se procesan y se someten a impregnación juntas. Este control se puede usar tanto para la plata como el ferrocianuro. Esta tinción es de tipo histoquímico, clasificada como argentafin (con reductor en el tejido) y es de 2 tiempos, ya que usa plata amoniacal (plata inestable preparada con agua y amoniaco, lo que oxida la plata. Mientras más oxidada la plata, más intensa será la tinción. MELANINA EN PIEL CON HE MÉTODOS DE ESTUDIO:  Reducción de plata de Fontana-Masson  Reducción de Schmorl’s con ferrocianuro-férrico  Método enzimático de reacción DOPA  Fluorescencia  Inmunohistoquímica, el panel especifico que se usa es S100 (SNP), HMB45 y Melan-A, también SOX-10 y langerina  REDUCCIÓN DE PLATA DE FONTANA-MASSON  Impregnación argéntica, es inespecífica porque si vamos a estudiar la piel, en esta estarán los melanocitos, pero la oxidación que hagamos al tejido antes de hacer la tinción va a permitir identificar a demás la membrana basal, ya que tiene hidratos de carbono que también se van a oxidar y van a reducir la plata. Si la muestra tiene, aunque sea una microcalcificación también la va a detectar  Se utiliza una solución de plata amoniacal durante 30 a 40 minutos a 56ºC  Contraste con rojo nuclear (fast red) o safranina  La Eumelanina adquiere un color rojo intenso FONTANA MASSON, CONTRASTE CON SAFRANINA REDUCCIÓN DE SCHMORL’S  La melanina reduce el ferricianuro a ferrocianuro produciendo un color azul (Azul de Turnbull)  Método inespecífico ya que puede teñir lipofucsina y pigmento biliar  Utiliza una solución de ferricianuro de potasio y cloruro férrico, preparada antes de usar. Se puede contrastar con rojo nuclear o safranina  La melanina adquiere un color azul oscuro  MÉTODO DE DOPA OXIDASA  Usa la capacidad de la enzima DOPA oxidasa presente en los melanomas para oxidar DOPA y formar un compuesto insoluble de color café. Usa dihidroxifenilalanina en tampón fosfato a pH 7.4 (el pH de todas las enzimas es de 7.2 a 7.4)  Es altamente específico para la melanina  Debe usarse en cortes por congelación. Se incuba durante 45 minutos a 37ºC  Las zonas con actividad DOPA-oxidasa adquieren color negro-parduzco. Usa contraste de carmin o verte metilo  Si nosotros somos capaces de conservar el tejido sin que se solubilicen los componentes ni se pierdan las enzimas, solo tendríamos que poner un sustrato, mantener el pH entre 7.2 – 7.4 y conservar la temperatura de 37ºC óptima para todas las reacciones enzimáticas  MÉTODO DE IHQ PARA MELANINA  Es la más específica ya que se trabaja con anticuerpos monoclonales HMB-45 (marca un 75% de las células productoras de melanina), Melan-A (identifica el 100% de las células productoras de melanina) y S100 que identifican a las células que contienen melanina. Se usa solo un corte, no una cinta. Control Blanqueamiento de la melanina (debe hacerse al mismo momento del que se va a demostrar)  Se usa peróxido de hidrogeno al 10% durante 1 a 2 días. También se puede usar permanganato de potasio al 0,25% y ácido oxálico al 5%. Primero se blanquea la lámina que se usara de control y luego se mete al agua junto con la otra sin blanquear para procesar al mismo tiempo IHQ CON HMB-45 EN PIEL  LIPOFUCSINA Y PIGMENTO SEROIDE Cuando el lipido se oxida y se sobreoxida se empieza a formar el pigmento seroide, pero cuando esto se va acrecentando en el tiempo y se va sobreoxida varias veces más, se forma la lipofucsina LIPOFUCSINA  De color amarillo-café a rojizo-café. Producto de procesos oxidativos de lípidos y lipoproteínas, esta oxidación ocurre lenta y progresivamente.  El pigmento proporciona una tinción variable con diferentes colores, tamaños y textura (depende de cada proceso de oxidación en que se encuentre) Se puede encontrar en procesos fisiológicos o patológicos de células envejecidas:  Hepatocitos mezclados con otros pigmentos  Células musculares cardiacas de personas ancianas (más frecuente)  Corteza adrenal en pacientes tras prolongado estrés  Testículos, especialmente en células de Leydig  Cerebro tras hemorragia o infarto  Ovario, tras la involución a cuerpo lúteo  Desordenes lipídicos Lipopigmentos se pueden demostrar por diversos métodos:  Reacción de PAS, se necesita tejido fresco  Reducción de Schmrol’s  Método de Zhiel-Neelsen  Sudan Black B, se necesita tejido fresco  Fontana Masson  Método de Kluver-Barrera, se usa sulfato azul de nilo Ninguna es especifica ya que reconocen otras moléculas  LIPOFUCSINA CON MÉTODO DE KLUVER-BARRERA PIGMENTO SEROIDE Es una lipofucsina de fase inicial de formación, posee características distintivas de la lipofucsina:  Adopta un color parduzco  Es PAS (-)  Sudan Black (-)  Azul de Nilo (-) Posee autofluorescencia y también tiñe con el método Zhiel-Neelsen PIGMENTOS DE ORIGEN EXÓGENO: PIGMENTOS Y MINERALES EXÓGENOS  Pigmento antracótico  Se denomina a todo acúmulo de carbono exógeno que se produce tras inhalación a través de los pulmones y que puede provenir de Smog, polvo y humo de tabaco  Pigmento de tatuajes  Tintes con óxidos de hierro u orgánico son digeridos por macrófagos que almacenan el material de por vida.  Tatuaje de amalgama  Es una lesión benigna causada por la implantación de material de relleno dental en los tejidos Pigmento antracotico en pulmón  PIGMENTOS DE ORIGEN EXÓGENO: PIGMENTOS ARTEFACTUALES PIGMENTO FORMOLADO La fijación prolongada en formaldehido no tamponado provoca la formación de este pigmento. Se elimina con ácido pícrico saturado en etanol durante 1 hora PIGMENTO MALÁRICO  Se observa en macrófagos de diversos órganos junto a hemosiderina. Es negro y granular.  Producido por los plasmodios de la malaria a partir de la hemoglobina, contiene fierro difícil de evidenciar.  Se observa especialmente en el hígado, bazo, ganglio linfático, que adquieren un color gris o gris negruzco. PIGMENTOS DE ORIGEN EXÓGENO: PIGMENTOS ARTEFACTUALES PIGMENTO SALES DE MERCURIO  Precipitados de color negro-café interfieren con la morfología normal del tejido PIGMENTO DE OXIDO CRÓMICO  Tras la fijación con sales de cromo se deben lavar los tejidos durante 12 a 48 horas en agua corriendo para evitar la formación de precipitados pigmentados  CLASE 10 HQ 19.10.21 DEMOSTRACIÓN HQ DE ENZIMAS GENERALIDADES Concepto: Enzimas Compuesto de naturaleza proteica presente en todos los tejidos y Cuya función consiste en catalizar reacciones bioquímicas al interior de la célula. Son biocatalizadores eficientes(sensibles) y específicos. (sustrato determinado). Sensible porque es capaz de pesquisar el más mínimo de sustrato y es especifico porque actúa sobre un único sustrato Las enzimas disminuyen la energía de activación, acortando tiempos, disminuyendo temperatura de reacción, etc. Las patologías musculares y la cadena respiratoria no han podido ser superadas por la inmuno. La mejor forma es hacer las pruebas en tejido fresco Un objetivo de la fijación es inhibir a las enzimas para que no se degraden. ¿IMPORTAR EL FIJADOR QUE USEMOS? R: si importa, porque si está fijado químicamente hay que recuperar los antígenos. Cuando esta sobre fijado hay que informar (para recuperar mas tiempo) Hay fijadores aldehídos que generar enmascaramiento y hay que hacer recuperación. Si esta fijado en OH se coagulan las proteínas por lo que no hay que recuperar nada porque no hay formación de aldehídos (no hicimos puentes de metileno), si usamos sales tampoco. Solo en los fijadores que formen aldehídos tendré que hacer la recuperación porque están enmascarados. Si se trata de otros fijadores no se hace. ¿A LAS CITOLOGÍAS SE LES PUEDE HACER INMUNO? R: SI, a los citológicos que se pueden ser impronta se les puede hacer inmuno solo que no se debe hacer recuperación de antígenos porque están fijadas en OH. Las inmunos se pueden hacer en tejidos en fresco (el corte en parafina es delgado, seriado) hay algunos anticuerpos que son solo para tejidos frescos porque son muy sensibles para tejidos fijados). REACCIÓN ENZIMÁTICA La reacción enzimática como ya sabemos tiene 2 elementos que se consideran esencial (sitio activo que es el más se debe cuidar, es el que nos permite hacer la demostración, si tenemos bloqueado el sitio activo o tenemos denaturado el sitio activo de la enzima entonces no tenemos ninguna posibilidad de generar un resultado positivo) A lo que nosotros nos importa es generar un producto INSOLUBLE Y COLOREADO. Como en mucho de los caos los resultados de las enzimas son soluble e incoloros es decir debemos cambiar sus dos características esenciales. Que buscamos con las HQ en relación a las enzimas, es que se busca algo distinto a la inmuno ya que hay patologías que solo se ven a través del estudio enzimático y son las mas complejas. En HQ interesa saber la localización de la enzima (si están en la cresta mitocondrial, en la membrana mitocondrial interna o externa o superpuesto sobre ella) ¿Por qué? Es fundamental la actividad enzimática que vamos a encontrar este ubicada en el sitio de acción de la enzima. No nos sirve que aparezca en otro sitio porque eso podría indicar o generar un distantico erróneo y se necesita ubicarla en el sitio donde ella actúa. Lo que nos interesa saber en HQ es donde esta ubicada la enzima y si tiene o no actividad enzimática. CONCEPTO: ENZIMAS  Presentan gran capacidad de regulación, y todo dependerá de la vía metabólica donde éstas se encuentren. Las enzimas presentan una subunidad catalítica y otra regulatoria.  En histoquímica interesa la localización y actividad de las enzimas. MODELO ENCAJE INDUCIDO DE KOSHLAND Cuando se habla de localización y actividad se refiere a falsos positivos y falsos negativos. El principal resultado de una actividad enzimática es un falso negativo cuesta conseguir preservar una actividad enzimática y demostrar que le enzima está presente en el tejido. Y se demuestra haciéndola actuar. ¿Cómo se hace? R: se le agrega un sustrato en específico y se hace actuar la enzima, pero para ello es necesario que la enzima este completamente disponible, su sito activo debe estar completamente in vivo, no hay ninguna posibilidad de que se vea afectado por fijación o desecación o por cambios de temperatura. En musculo es muy complejo porque hay q considerar muchas variables. Todo esto se realiza en fresco.  cuando se pregunta por las condiciones ideales para hacer un estudio de enzimas se dice tejido fresco, luego se dice que excepcionalmente que se identifica fosfatasa acida y alcalina con una fijación química pero muy limitada por ejemplo 2 hrs en etanol, pero a 4°C no a T° ambiente.  IMPORTANCIA DE SU DEMOSTRACIÓN  La IHQ aporta información en cuanto a la enzima como proteína antigénica. (localización, ya que solo pone un antígeno donde la enzimática, pero la va a localizarla solamente y no va demostrar su actividad, no se sabe si su actividad esta plena o a toda capacidad o está trabajando de manera deficiente, ya que solo se puede medir ene estudio enzimático).  En HQ, detectamos la actividad de la enzima, (sustrato por acción enzimática puede sufrir hidrólisis; reducción; oxidación y generar un producto) en ambos casos el resultado sigue siendo el mismo = (PRODUCTO: COLOREADO E INSOLUBLE) La inmuno es muy específica, pero está demostrando puntualmente la enzima pero no la actividad enzimática. En la HQse evalúa si hay o no actividad enzimática, si no la hay va a estar blanco si la hay va a estar de color azul y está a medias el color será mas claro. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 1) Temperatura: siempre considerar las reacciones a t° fisiológica 2) Ph: considerar el pH de acción óptima de cada enzima 3) Concentración de los componentes de la reacción: a) Concentración de la enzima ¿Va a depender de nosotros? No, va a depender en parte de como manejemos el tejido. Las enzimas son solubles y si no fijamos rápidamente el tejido lo que va a ocurrir es que se vana comenzar a insolubilizar y van a difundir (la [ ] va depender del tejido)  b) Concentración del sustrato si esta en exceso se inhibe la enzima, entonces la concertación del sustrato es crítica.  ¿Qué ocurre si yo preparo por ejemplo me dice que prepare un sustrato al 0,3% y lo preparo al 0,26%  no respeto la [ ]? R: a 0,3% se supone que va a funcionar bien, si fuera el caso de que es mucha la [ ] de sustrato se va a inhibir y en el caso de que es menor, la velocidad de la actividad enzimática va a ser mayor. Si el producto de la reacción sale más rápido no se alcanza a capturar todo y se produce alguna difusión. Cuando las concentraciones se modifican lo que puede ocurrir es que se pierda alguna parte del producto solubilizándose. c) Concentración del producto si hay mucha actividad enzimática va a ver mucho producto d) Concentración de los electrolitos del medio. Se encontrar en el pH cuando agregamos tampones. Y esos tampones están preparados en sales, actúan compitiendo por los sitios del sustrato. Genera un producto indeterminable. El agente capturante es la sal de diazonio. CLASIFICACIÓN DE ENZIMAS 1. Hidrolasas 2. Oxidoreductasas 3. Transferasas 4. Liasas 5. Ligasas o sintetasas 6. Isomerasas CONSIDERACIONES TÉCNICAS (KIERNAN)  PREPARACIÓN DEL TEJIDO:  El tejido debe congelarse rápidamente. Se recomienda utilizar tejidos sin fijar.  Si se elige fijar, el químico no debe inhibir la actividad enzimática.  CONDICIONES DE LA REACCIÓN:  La incubación debe realizarse a 37°C excepcionalmente a 4ºC)  Las plantas desarrollan actividad enzimática a 25° C.  Para menor difusión de enzimas se recomienda usar temperaturas de incubación más bajas. CONSIDERACIONES TÉCNICAS: FIJACIÓN  El tejido se prepara con la intención de mantener la localización de la enzima y a conservar su actividad.  La fijación química puede desnaturalizar la enzima que queremos demostrar.  La T°, el pH, el tipo de fijador son variables que debemos considerar estrictamente.  Muchas de las enzimas que deseamos estudiar son solubles, por lo que la fijación contribuiría a la insolubilización de estas.  Idealmente se estudian en estado fresco sin fijar o se congelan y cortan en criostato.  Enzimas que resisten bien la fijación: Tiempos breves y a baja T°. OBJETIVOS DE FIJACIÓN Y CONSERVACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA OBJETIVOS DE LA FIJACIÓN DEL TEJIDO  Conservar la morfología  Insolubilizar la enzima  Aumentar la permeabilidad de la célula. (La fijación permite hacer permeable la célula a los productos presentes en la mezcla incubadora) MANEJO DE LA CONSERVACIÓN ENZIMÁTICA. 1. Congelación- criosustitución (requieren isopentano y nitrógeno) 2. Tejido sin fijar; corte por congelación; fijación post corte y post reacción (fijo el corte, generalmente con formalina en tiempo limitado 10 min  cual es la gracia de la formalina dependiendo del estudio, todo esto para insolubilizar la enzima para que no difunda) 3. Breve fijación previa al corte por congelación Hay enzimas como la SDH (deshidrogenasa succínica) que particularmente no puede ser conservada se genera el producto final insoluble y coloreado. ¿Cómo se monta? Si lo montamos en agua se nos va a perder la coloración en poco tiempo, los medios de montaje acuoso se van mezclando, se van insolubilizando y se va perdiendo la coloración y el único que lo permite es el OH, xilol y montaje y para pasarlas por OH primero requerimos hacer una fijación post reacción ¿Qué se va a conseguir con esto? (fijar con formalina o formol calcio) conserva la morfología y volver insoluble. Cuando se trata de cortes congelados podemos hacer una fijación posterior cuando queremos insolubilizar algunos compuestos, pero vamos a insolubilizar el producto de la reacción. Se va a montar en un medio anhidro. FORMAS DE USAR UN FIJADOR: 1. Fijando el tejido al inicio 2. Post fijación no solo con enzimas, lípidos o cualquier componente 3. Cuando queramos preservar el producto final de la reacción  Cuando una muestra esta fijada si se puede cortar en el criostato solo que va a costar mas tomarla  La localización y actividad enzimática es lo que importa  La fijación química daña el tejido son muy senisbles al fijador  La T° es critica y el pH igual  Las enzimas son solubles TIPOS DE REACCIONES HISTOQUÍMICAS Existe 5 tipos de reacciones histoquímicas disponibles para demostración de enzimas 1. Método de precipitación de metales 2. Método de copulación simultanea (Todos los componentes de la reacción van en un solo baño  sustrato, buffer, inhibidor específico si queremos hacer control, activador si es necesario, agente capturante; solo captura el final de la reacción) 3. Método de postcopulacion 4. Reacción con sustrato coloreado 5. Reacción con sustrato incoloro 1. MÉTODO DE PRECIPITACIÓN DE METALES SEGÚN GOMORI  Método antiguo de múltiples pasos  El sistema de captura y transformación química entre las distintas soluciones sirve de base para los métodos actuales  Se va marcando la enzima con algún metal, generalmente con fosfato de calcio, fosfato de cobalto. Se van sustituyendo uno al otro los metales, cuando teñimos calcio las reaccione son siempre insolubles ya pero no se logra la coloración por lo tanto hay que hacer algún par de cambios para poder conseguir el segundo propósito que sea coloreado. 2. MÉTODO DE COPULACIÓN SIMULTANEA  Método más usado en demostración enzimática. En este método va todo en la mezcla incubadora  La unión o “copulación” es formada por la enzima y un sustrato adecuado, conocido como producto primario de reacción (PPR).  Este PPR se combina con las sales de diazonium (SD) formando el producto final de la reacción (PFR) el cual es coloreado S + E = PPR + SD = PFR  PROBLEMAS DE DIFUSIÓN CON EL PRP: o Proporción de hidrólisis del sustrato (va a depender de la proporción de hidrolisis del sustrato [ ] ) o Coeficiente de difusión del PRP por el buffer (pH adecuado) o Proporción de acople del PRP con la sal de diazonio (que esta sal de diazonio en la concentración en la que esta, está disponible para recibir el producto primario de reacción en una cantidad de 2 por cada segundo y hay un desajuste en la proporción porque o no está en la [ ] requerida o esto está actuando más rápido y está generando un producto de reacción mucho más rápido y eso genera una alteración al resultado final)  Lo que ocurre aquí es que hay una enzima que está presente en el tejido y le agregamos un sustrato en las condiciones óptimas.  Se va a generar un producto de reacción primario y ese producto va a copular o se va a unir a una sal de diazonio (tiene la particularidad de que es coloreada e insoluble) y eso da como resultado el producto final de la reacción.  Para este método hay que asegurarse de colocar el sustrato y todos los componentes que acompañan al sustrato incluyendo las condiciones óptimas de T° y pH, para que la enzima actúe sobre el y genere este producto de reacción primeria y este producto será captura inmediatamente por este agente capturante (sal de diazonio)  Todo esto ocurre en un solo baño como de media hora en algunos una hora.  Estos factores pueden ser controlados para mejorar la localización de la enzima, alterando el sustrato usado y modificando la sal de diazonio.  El tipo de sustrato usado, la elección de la sal de diazonio, y la proporción de acople afecta la proporción de hidrólisis.  Si la concentración de sustrato soluble es muy alta entonces la proporción de hidrólisis del sustrato se puede inhibir.  El medio buffer debe tener un pH en el cual la enzima exhiba su máxima actividad y el sustrato muestre una razonable solubilidad.  La sal de diazonio se incluye en el medio de incubación y requiere un pH óptimo para una proporción de acople más eficiente Y también tiene una concentración crítica, de manera que un exceso de sal de diazonio causaría una inhibición de la proporción de formación del PRF. 3. MÉTODO DE POSTCOPULACION  La enzima reacciona con un sustrato apropiado formando un producto primario de la reacción  Se somete a un segundo paso de incubación (en el caso anterior era simultaneo) en este método hay dos incubaciones. o Primero pusimos la enzima que está en el tejido y agregamos el sustrato a activadores, buffer, inhibidores, etc. Y se generó un producto primario de reacción y luego lo pase a un segundo frasco donde tengo solo el agente capturante y ese me da el producto final insoluble y coloreado.  Se forma un producto final coloreado estable e insoluble S + E = PPR + AC = PFC  Método que demanda mayor tiempo.  La localización suele ser deficiente por la difusión de los productos.  VENTAJA: Se puede usar diferentes pH en cada incubación. (pH óptimo para la hidrólisis del sustrato). Uno puede hacer la primera incubación en las condiciones óptimas para la enzima porque esta es la que importa tenerla a T° adecuada, pH y concertación adecuados. El segundo paso puede tener otras condiciones óptimas.  DESVENTAJA: es que el PRP es frecuentemente soluble (difusión del PRP ocurre antes del acoplamiento). Todo esto va a depender de la sal de diazonio que estemos utilizando, hay algunas que tienen la particularidad de que se disuelven en un buffer de distintos pH la mayoría son neutros, pero alguno de ellos es más alcalino. Cuando se utiliza en el mismo pH que la reacción primaria uso una incubación única. Todo depende del protocolo que uno siga, el agente capturante es el que necesita pH distintos. Si usamos el mismo buffer en ambos lados se usa el método 2 que va todo junto. RESUMEN PROFE El estudio de la actividad enzimática de los tejidos está muy encomendando a determinas patologías básicamente a patologías musculares y la enfermedad de Hirschsprung (aganglionosis), ene sos casos alas enzimas que se identifican son la acetil colinesterasa que es la que determina la acción de los movimientos peristálticos dentro del intentito por lo tanto no hay un reemplazo puntual para determinar o reconocer si efectivamente o no la enzima está actuando o está actuando de forma ineficiente o si hay algún problema de conexión Otra patología es la cadena respiratoria del musculo no hay ningún anticuerpo que reemplace la enzima para determinar si que hay algún problema en la cadena respiratoria. Para hacer un estudio enzimático hay que considerar varias cosas, pero la principal escomo conservamos la enzima. 1. La ideal es congelar en isopentano y nitrógeno líquido en criosustitución: de esa manera garantizamos que la enzima esta con su actividad, necesitamos que este bien conservada para ver su actuar. Por esto debemos tener todos los ingredientes para que esta enzima actué.  En la copulación simultanea: van a ir todos los reactivos juntos se prepara todo un buffer y en él se agrega sustrato (beta glicerol fosfato al 0.3%) le agregamos un activados si requiere (magnesio al 0.01%) después agregamos un agente capturante (NBT una sal de diazonio, que al capturar algún producto se generar los colorantes azoicos a treves de ese medio cuando se fusionan con un nitrógeno, por lo tanto, las sales de diazonio están compuestas por estructuras nitrogenadas. Solo capturan productos de reacción primaria o productos enzimáticos con camerísticas nitrogenadas. Como tienen la particularidad de que uniéndose a ellas cambian de color y se insolubilizan en presencia de componentes que sea reductores de ella, entonces el agente capturante se coloca en la misma muestra, pero como en estado oxidado y luego que se produce la reacción se empieza a ver en cada fibra donde el agente capturante este reduciéndose. Si se trata del NBT seria de color azul)  T° siempre a 37°C y pH que depende de la enzima la mayoría son de pH fisiológico  Si requiere de algún activador se le agregan activador, si requiere de algún inhibidor específico para que usemos como control se le agrega el inhibidor especifico y el agente capturante y todo eso se revuelve en un matraz y está listo.   Yo tomo el corte congelado con el portaobjetos lo envuelvo en papel aluminio y lo meto a -80°C lo voy a congelar mientras saco todos los cortes (4, 6 u 8 cortes). Cuando voy a hacer la tinción los saco y espero que lleguen a T° ambiente y lo incorporo a la mezcla incubadora y espero pacientemente entre media hora o una hora dependiendo del protocolo y espero que el resultado se produzca. o Que espero como resultado: que en todos aquellos sitios donde la enzima estuvo conservada se accione se active cuando reciba el sustrato específico y generar un producto que está capturando inmediatamente por el agente capturante en la misma mezcla y se va a insolubilizar y va a cambiar de color. Al término del tiempo (30 min, por ejemplo) yo saco la lamina la lavo en agua y la micro al microscopio y veo si esta la marcación que corresponde, si las fibras están bien diferenciadas con otras y listo o Para impedir que se decolore con el tiempo voy a intentar montarla en un medio anhidro y en ese caso optare por hacer una post fijación, el resultado ya lo tengo, lo que yo no quiero es que se decolore e insolubilice y por eso lo pongo en formalina (10 min o 15 min) y luego de la formalina se lava en agua, OH, xilol y montaje y conservo la lámina de musculo tal cual como las otras muestras 4. REACCIÓN CON SUSTRATO COLOREADO  Pocas enzimas permiten este método  Se utiliza un sustrato coloreado (Sc) que también es soluble.  Durante la reacción enzimática se remueven grupos solubles del sustrato sin verse afectado el color.  El producto primario de la reacción es insoluble y coloreado a la vez (PPRc) Sc + E = PPRc 5. REACCIÓN CON SUSTRATO INCOLORO Este método utiliza un sustrato soluble incoloro(Si) Tras la reacción enzimática debido a rearreglos intermoleculares se genera un producto de reacción coloreado e insoluble Si + E = PPRc En M:E se utiliza mucho este tipo de reacción ya que es fidedigna en cuanto a su localización. Es característica de las oxidoreductasa. En ella el sustrato es soluble e incoloro cuando se encuentra oxidado e insoluble y coloreado en estado reducido.  CLASE 11 HQ 09.11.21 DEMOSTRACIÓN HISTOQUÍMICA DE ENZIMAS MUSCULO Lo fundamental es preservar la enzima por la crio-preservación, luego reconocer los factores importantes para el estudio enzimático: pH de acción de la enzima, temperatura única de la especie humana 37°C, y factores en los que uno puede intervenir de alguna manera; sustrato específico para la enzima (en algunas enzimas se exige un activador o una coenzima, hay que conocer de qué forma actúa de manera óptima la enzima), buffer adecuado, pH adecuado, concentración y pesajes adecuados. Existen distintos métodos; copulación simultanea es la más importante porque que a sido la que ha resultado lejos la mejor, en ella ocurre todo en una sola incubación, desde la acción de la enzima sustrato y la generación del producto la captación de este por algún agente capturante es por esto que ha resultado el óptimo. La poscopulacion tiene una sola ventaja que es que se puede utilizar a distintos pH en la incubación 1 y 2 donde se agrega el agente capturante hasta producir el producto insoluble y coloreado. El principal problema que ocurre con las patologías musculares y específicamente con las enzimas es que son termo lábiles y son difíciles de preservar.  ATPasa Subconjunto de Ez capaces de producir hidrólisis del ATP en ADP y liberación de un ion fosfato libre Es utilizado a distintos pH para distinguir entre los distintos tipos de fibras musculares de miosina (I, II, IIa, IIb y IIc). Permite diagnosticar patrones morfológicos característicos.  Lo principal es de ATP generar ADP liberando un ion fosfato y lo que queremos lograr es capturar este ion fosfato y generar un producto insoluble y coloreado HE: corte congelado se les hace inmediatamente una HE ¿Qué estrategia se podría utilizar para resolver tal caso? R: o es una patología inflamatoria, o por enfermedad de deposito, distrofia donde hay una gran disparidad de tamaños de fibra o es una enfermedad centro nuclear genética donde los núcleos son centrales o si se trata de una enfermedad enzimática (única que no se puede ver con HE) lo que se vera con la HE es; el tamaño de la fibra, la forma de la fibra, la ubicación del núcleo, pero en ningún caso podrá identificar la fibra 1 de la 2 de acuerdo a su capacidad oxidativa. FUNDAMENTO HISTOQUÍMICO  Tamaño, número y distribución o proporción de los tipos de fibras musculares. (en algunos casos el musculo tendrá tanto daño, que puede estar reducido el tamaño y numero de fibras)  La reacción histoquímica se basa en:  La sensibilidad de la enzima frente a soluciones ácidas y alcalinas. (el pH es relevante al momento de identificar uno de la otra)  La detección de fosfato liberado por acción enzimática de la ATPasa.  La sensibilidad al pH ácido y alcalino está dada por la variación de isoformas. FUNDAMENTO: CAPTURAR EL ION FOSFATO Y LA SENSIBILIDAD DE ACUERDO CON EL PH  FUNDAMENTO HISTOQUÍMICO DE LA ATPASA:  ATPasa enzima importante en el musculo  Se basa en la actividad de una enzima en las fibras musculares, pero para reconocer la actividad o la capacidad oxidativa de cada fibra.  En la histología se pueden reconocer fibras lentas o rápidas. Cada una de ellas tiene una diferencia morfológica y fisiológica.  Para ver la falta de movilidad clínica de un paciente, habitualmente es necesario determinar lo en una serie de estudios, entre ellos, las enzimas del punto de vista bioquímico, pero cuando el trastorno es más severo, se requiere de un estudio más complejo y se tiene que llegar a la histopatología.  Cuando se reciben biopsias de musculo son para estudios muy complejos entre ellos la histoenzimologia o IHQ. PRINCIPAL OBJETIVO DEL ESTUDIO: 1. Determinar el tamaño y la complejidad de la fibra en relación a la ATP, cuando se aplica la ATPasa se ven las fibras tipo I y II. Se puede determinar el tamaño real de la fibra. 2. El número de fibras de tipo I y II. Se puede determinar mediante el número de fibras, algunas patologías. 3. La distribución de los tipos de fibras. 4. Determinar la capacidad oxidativa de cada fibra. (lo que se espera que ocurra en estos estudios) La reacción histoquímica se basa: La sensibilidad hacia los pH, la enzima es muy sensible a determinados pH. Tanto acido como alcalino. Va a determinar la forma en cómo se va a realizar la técnica  ATPASA: TIPOS DE FIBRAS El músculo esquelético está compuesto por una mezcla de fibras que difieren en sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. Fibras tipo I: Roja-Lenta- NADH-SDH-COX-LIPIDOS (capacidad oxidativa)  Denominada miosina de contracción lenta  Posee estabilidad enzimática en soluciones ácidas (pH 4.3).  Si se realiza un estudio de lípidos en el Musculo, aparecerá con mayor intensidad y mayor depósito de lípidos en su interior serán las fibras tipo I. Fibras tipo II: Blanca-Rápida-PAS  Denominada miosina contracción rápida  posee estabilidad enzimática en soluciones alcalinas (pH 9.4). O 10,3  Cuando se hace en un tejido normal la técnica de PAS, me va a marcar positivo todas las fibras con una intensidad muy superior aquellas fibras de tipo II. Porque son caracterizadas por la presencia de glucógeno. Junto con determinar el tipo de contracción de cada fibra, está asociada al pH. Fibras de tipo I 4,3. Fibras de tipo II a pH 9,4  Un corte de tejido de musculo fresco que fue preparado en isopentano, fue congelado por nitrógeno líquido, fue cortado 6-7 micrones en criostato y posteriormente fue estudiado a través de estos estudios enzimáticos, la ATP por lo menos se tendría que hacer a dos pH distintos.  ATPasa a ph 4,3 para lo que necesitare de un buffer que me permita ese pH  ATPasa a pH 9,4 en otro buffer. Se determinará cual es la cantidad o la distribución de las fibras tipo I o II en el tejido. PRETRATAMIENTO DEL TEJIDO EN UN MEDIO ÁCIDO O BÁSICO  El medio ácido inactiva las miosinas de las fibras tipo IIa y IIb. (forman parte de las fibras de tipo reactivo que existen en cualquier tejido que haya sido dañado en algún tipo de lesión)  El medio alcalino inactiva la miosina presente en las fibras tipo I Esto es para saber a que pH vamos a trabajar y que enzima queremos demostrar.  FIBRAS TIPO II: ATPASA PH 9.4  En un PAS marcaria las fibras más oscuras Musculo cortado en criostato; estos siempre van a generar artefactos como: la formación de cristales, estos cortes son mas gruesos (mas de 6 micrones)  ATPASA: FUNDAMENTO HISTOQUÍMICO O QUÍMICO De ATP generar un ADP con un ion fosfato libre o un ácido fosfórico (algún derivado fosfato libre) Le vamos a poner un sustrato ATP la enzima va actuar sobre este ATP y va a generar ADP + ácido fosfórico, este se une al cloruro de calcio y este va a generar cloruro de calcio (hasta este punto se sigue con un producto que no es coloreado e tampoco insolubles) luego se le agrega cloruro de cobalto y se genera fosfato de cobalto y este producto es insoluble y luego se le agrega sulfuro de amonio y finalmente transforma este fosfato de cobalto en sulfuro de cobalto que es un producto insoluble y coloreado. Similar a lo que se hace en la fosfatasa alcalina o acida. Siempre hay liberación de un fosfato, que será capturado por un catión metálico, en este caso el Calcio. Parte con el calcio forma fosfato de calcio, interactúa con el cloruro de cobalto para formar fosfato cobalto que pasaba a ser insoluble. Finalmente, con sulfuro de amonio se generaba el resultado final insoluble y coloreado. SUSTITUCIÓN DE SALES METÁLICA DE GOMORI  copulación simultanea  ATPasa a pH 9.4 ATPasa a ph 4.3 Se identifican fibras de tipo I de contracción lenta. Si se le hace PAS, marcaria las fibras claras de esta imagen. FALSO NEGATIVO  Falso negativo, entrega una información errónea.  Es común que se den falsos negativos, donde se tiene que preservar primero es la enzima, para poder demostrar su actividad. Si no se preserva bien, simplemente lo resultados no se van a dar.  Si tenemos un agente capturante disponible (sal de diazonio) para capturar a ese producto de reacción primario, y transformarlo en insoluble y coloreado. No tendremos resultado, el producto de la reacción final será tinción negativa. Se tiene que repetir o no se puede diagnosticar. Cuando nosotros queremos estudiar la cadena respiratoria no hacemos el estudio de cada una por separado, sino que se hacen de todos se estudian en conjunto. La primera es el NADH (reducido) [NAD oxidado] lo que ocurre es que el desplazamiento de un hidrogeno o un electrón que va a ir de un NADH a un NAD hacia el ambiente. Para estudiar el NADH podríamos tener dos opciones podríamos poner el NAD oxidado y esperar que se reduzca acá en UQ (ubiquinona verde) porque si la actividad enzimática dentro de todo el tejido se ha conservado yo podría poner un NAD oxidado para que reaccione el hidrogeno para estimular el traspaso de H o también podría trabajar con el NADH reducido y al ponerlo en contacto con el tejido entregue su hidrogeno y se transforme en un NAD oxidado. (el H va a al espacio intermembrana) El segundo paso con la deshidrogenasa succínica va a liberar un H que ingresar también a la ubiquinona y su función es entregar esos dos H que tiene a la etapa 4 donde hay un oxígeno y lo necesitamos transformar en agua para hacer la respiración celular. A través de la citocromo oxidasa se pasan los H. Debemos aplicar un sustrato adecuado de manera que esta enzima se active y genere el producto y capturemos el producto con agente capturante que será una sal de diazonio o un colorante azoico. Resultados del NADH  Con NADH-TR se puede diferenciar claramente las fibras tipo 1, debido a su alta capacidad oxidativa  Ejemplo: miopatía centro nuclear con atrofia de fibras tipo 1  NADH, se va oxidando y reduciéndose de manera de ir transportando los hidrógenos. NADH por el espacio intermembrana de la mitocondria pasa su hidrogeno a la ubiquinona. Por lo tanto, en esta reacción para identificar la actividad de esta enzima o coenzima, se debe tener un receptor artificial o una sal de diazonio que se reduzca y cambie de color. Cuando se produce se insolubiliza y cuando cambia de color es diagnosticable. Por lo tanto, los dos objetivos que se buscan están relacionados con la transformación de estos. Se replica el procesamiento de la etapa I del NADH. - De un nad reducido libera su hidrogeno se oxida, después toma a otro hidrogeno se reduce ser oxida y así. En ese intercambio va transportando el hidrogeno. - Para poder visualizarlo es interponer una sal de diazonio que recogiendo o aceptando un hidrogeno se reduzca y cambie de color. - La sal de diazonio más utilizada es NBT (nitroblue tetrazolium) Para identificar el NADH debemos tener, un pH o un buffer de incubación, se podría comprar la solución en polvo de NAD oxidado o NADH reducido. Si se compra el NADH reducido, y se estimula, lo que pasara es la diaforaza actuara sobre el y va a liberar el hidrogeno. Si se compra el NAD oxidado, otro de los que esta reducido liberar el hidrogeno y lo va a capturar esta NAD. NAD y NADH = NAD oxidado a NADH reducido. (transportarse un hidrogeno está regulado por una enzima que se llama diaforaza que es de carácter general y que va a catalizar todas estas reacciones de transporte de electrones. Para determinar esta actividad y saber que está funcionando bien, se puede poner el NAD + hidrogeno que está presente en el tejido, me lo va a reducir + NBT. Por lo tanto, cuando este hidrogeno se libere lo va a capturar este NBT cambiara de color azul negruzco y sería el término de la reacción. La sal de diazonio será un aceptor universal de H. esta es la responsable de la insolubilización y del color que se va a generar para poder visualizarlo en el tejido. El NADH es reconocer la capacidad oxidativa de las fibras tipo 1. El NADH es azul el agente caputarante es el nitroblue tetrazolium y el sustrato sería el NADH o el NAD. En la mezcla junto al NADH vamos a poner el NDT Para evitar el paso por lo OH lo que se propone es lavar en acetona en dos o tres cambios y tiene como objetivo fijar y así se podrá montar en un medio anhidro y así se puede pasar por xilol (post fijación)  Necesitamos una sustancia que se oxide El recorrido que sigue normalmente es el camino negro lo que vamos a hacer nosotros es capturar el H en la línea verde, se tiñe ahí y se insolubiliza. En el 2 pasa que actúa una enzima deshidrogenasa (retiro un H) succínica que actúa sobre el succinato de sodio (forma parte del ciclo de Krebs) por lo tanto el será nuestro sustrato entonces preparamos la técnica de SDH. El H se captura en la línea naranja con el nitroblue tetrazolium. Finalmente, en el mismo musculo vamos a hacer una tercera incubación con la cox (citocromo oxidasa) actúa sobre el citocromo c (sustratos) y esta toma los dos H y los desplaza a la cuarta etapa y los transforma en H2O. Sustancia que se oxide y cambia de color  DAB Cuando aparece negativo es porque el musculo no esta funcionando bien.  Segunda enzima que forma parte de la cadena SDH.  El succinato de sodio es el sustrato de la enzima deshidrogenasa succínica.  Esta enzima deshidrogenasa, saca hidrógenos. Transforma la molécula de succinato y le saca hidrógenos.  El hidrogeno que se saque, terminara en la ubiquinona.  la diferencia con la etapa I es el sustrato, que aquí en la segunda etapa es el succinato de sodio.  En la sal de diazonio puede ser la misma, ya que se tiene que capturar el hidrogeno que pasa por el espacio intermembrana de la mitocondria hacia la ubiquinona.  odo el resultado de insolubilización y tinción de la fibra estará determinado por la enzima SDH.  Si sale negativa la capacidad oxidativa, significa que la enzima esta deficiente siempre y cuando se haya usado un buen control. Si sale negativo hay dos problemas - Es que sea efectivamente negativo. - Es que sea un falso negativo.  Si sale positivo, quiere decir que está bien. Puede ver bien la actividad de la capacidad oxidativa de las fibras y las discriminó bien una de otras.  RESULTADOS SDH  El aceptor artificial de electrones es (NBT), el cual, al momento de reducirse genera un Diformazán que es un compuesto muy estable, insoluble, y coloreado.  Que sea estable significa que el resultado, uno podría después aclarar, deshidratar y montar.  Que sea estable en el tiempo, y se mantenga la marcación en el tiempo.  Proporciona un patrón fibrilar característico (fibras tipo I). Tiene un problema, se tiende a difundir con el paso por los alcoholes. Se tendría que montar en un medio de montaje acuoso. Para evitar el paso por los alcoholes. Todo que está en montaje acuoso tiende a difundir y a generar una polaridad dentro del medio, que hace que los colores difundan un poco. Hay que reforzar esta insolubilidad. En presencia de agua por mucho tiempo podría difundirse. Por lo tanto, se utiliza formalina al 10%, ya que el objetivo es insolubilizar las proteínas, el resultado o producto que se generó por la captura del hidrogeno y la formación de diformazan, entonces este diformazan que ya es insoluble, va a terminar siendo aún más insoluble. Corte fresco, formalina 10% por 10 minutos y el producto de toda la reacción enzimática va a quedar permanente PPT DESHIDROGENASA SUCCÍNICA  Al igual que NADH, la SDH posee como aceptor final del complejo a la CoQ.  El ubiquinol cargado de electrones se desplazan por la bicapa lipídica mitocondrial hasta el tercer complejo y sigue la gradiente de electrones que tiene como objetivo la producción de ATP y eliminación de radicales de oxígeno mediante la formación de moléculas de agua. FUNDAMENTO HISTOQUÍMICO Fundamento: aceptor artificial de electrones que, al reducirse por acción enzimática, genera un compuesto insoluble y coloreado en el tejido La enzima actúa sobre el sustrato donador de electrones, Succinato, pero estos electrones no fluyen por el complejo enzimático, sino que quedan atrapados en el aceptor artificial provocando su reducción y la consecuente formación del precipitado coloreado  CITOCROMO OXIDASA  Recibe los electrones circulantes y los lleva al aceptor final que es el oxígeno molecular (O2) para reducirlo agua, eliminando así los radicales de oxígeno producidos en la generación del gradiente de electrones para la producción de ATP DIFICULTAD  Cuando hay mucho oxígeno y está llegando muchos hidrógenos, se va formar peróxido de hidrogeno H2O2. Si se genera H2O2 se tiñeran todas las fibras.  También el paciente podría no tener una buena citocromo c buena. Sera un falso positivo. Porque se formará mucho peróxido de hidrogeno y como el DAB es oxidable, se va a estar descomponiendo el peróxido de hidrogeno en gua y se estará oxidando. En este caso se hace un control interno, un inhibidor competitivo, con una enzima la catalasa, impide la formación de peróxido de hidrogeno.  Citocromo C es el sustrato de la citocromo oxidasa o COX.  Es la tercera enzima en estudio.  Diferencia, es que se necesita un dador de electrones  Llegaran dos hidrógenos de NADH y Succinato. Citocromo C sustrato, buffer de pH 7 o 7,2, un activador si es necesario, una coenzima si es necesario, y algún agente que sea dador de electrones o se desprenda de los hidrógenos. Que se oxide. También la catalaza que impida que se forme peróxido de hidrogeno. El más conocido cromógeno que tenemos disponible para esto y el mas de fácil acceso es el DAB. DAB dador de electrones. Se oxidará un compuesto como el cromógeno DAB para que cambie de color y se insolubilice cuando desprendan los hidrógenos. El citocromo oxidasa que está en el tejido y bien conservada, en presencia de su sustrato va a liberar los dos hidrógenos y se encontrara con el DAB. Se produce el producto y se capta de inmediato con el DAB. Cambiará de color y se tornara de color café. FUNDAMENTO:  Se basa en la utilización de un donador artificial de electrones que, al momento de ser oxidado por acción enzimática, precipita como un compuesto insoluble y coloreado, indicando la actividad enzimática en el tejido.  EL sustrato donante de electrones más usado es el 3,3  Diaminobencidina Tetrahidrocloruro (DAB), el cual al ser oxidado por acción enzimática precipita rápidamente formando un producto de color pardo sobre la zona del tejido que presente acción enzimática. Este precipitado es insoluble en compuestos orgánicos como alcohol o xilol El tejido contiene H2o2, y se debe considerar siempre que frente a las miopatías mitocondriales con déficit de COX puedan generarse falsos positivos, a causa de la actividad endógena de peroxidasas. (cuando COX no esté activo). Se controla el H2O2 presente en tejido usando catalasa en la solución de trabajo.  SALES DE TETRAZOLIUM  Son compuestos que poseen 1 o más grupos tetrazol.  Aceptor artificial de hidrógenos que al reducirse se vuelve insoluble y coloreado denominándose formazán. SALES DE MONOTETRAZOLIUM  Sales que poseen sólo un grupo tetrazol en su estructura, y al ser oxidado por la enzima, genera un precipitado rojo y soluble, por lo cual se debe recurrir a la quelación con cobalto para formar un producto insoluble SALES DE DITETRAZOLIUM  Sales que poseen en su estructura 2 grupos tetrazol.  Al momento de oxidarse producen un precipitado de diformazán color azul sobre el tejido.  El diformazán por sí solo es un precipitado insoluble, sin la necesidad de usar un agente quelante