Diagnostic Mycologique Past Paper PDF 2024/2025

Institut National de Formation Supérieure Paramédicale - Jijel DIAGNOSTIC MYCOLOGIQUE Dr. BOUKHDENNA I. Praticienne Spécialiste Assistante en Parasitologie Mycologie Médicale Année universitaire : 2024/202...

Institut National de Formation Supérieure Paramédicale - Jijel DIAGNOSTIC MYCOLOGIQUE Dr. BOUKHDENNA I. Praticienne Spécialiste Assistante en Parasitologie Mycologie Médicale Année universitaire : 2024/2025  Plan: 01 02 03 INTRODUCTION FICHE DE RENSEIGNEMENT PRÉLÈVEMENT 04 05 06 EXAMEN DIRECT CULTURE IDENTIFICATION  01 INTRODUCTION  INTRODUCTION Le prélèvement Le diagnostic mycologique comprend 4 étapes L’examen direct importantes: La culture sur milieux appropriés L’identification des champignons isolés 4  INTRODUCTION Le diagnostic des mycoses repose sur un faisceau d’arguments épidémiologiques, cliniques, radiologiques, histologique et biologiques qui placent le laboratoire de mycologie en première ligne dans la prise en charge du patient. 5  02 FICHE DE RENSEIGNEMENT La fiche de renseignements doit comporter :  L’identité du patient (nom, prénom et l’âge)  Adresse ;  Profession ;  Notion de voyages antérieurs ;  Contacts avec des animaux ;  Signes cliniques, paracliniques, biologiques, radiologiques ;  Antécédents médicaux ;  Prise de traitement (antifongique ou autres). 7  03 PRÉLÈVEMENT  La qualité du prélèvement détermine la qualité 9 du diagnostic. PRÉLÈVEMENT Les modalités du prélèvement dépendent de la localisation des lésions (peau, ongle, muqueuses, liquides biologiques…). Les prélèvements: o Effectués au labo o Acheminés rapidement au labo o Conservés à +4°C. 10  PRÉLÈVEMENT Conditions: Avant toute toilette corporelle Avant traitement spécifique ou (prélèvements cutanés après une fenêtre thérapeutique: o 15 jours (ATF local) surtout) o 2-3 mois (ATF systémique, vernis ou solution filmogène). 11  PRÉLÈVEMENT MATÉRIEL NÉCESSAIRE POUR LE PRÉLÈVEMENT : Prélèvements superficielles Prélèvements profonds Curette, Bistouri, Vaccinostyle Flacons stériles (liquides biologiques) Pince à épiler (cheveux et poils) Flacons pour hémoculture Ecouvillon (muqueuses et lésions Tubes stériles (LCR) suintantes) Ruban adhésif (scotch test cutané) Boite de Pétri… Lampe de Wood (teignes) 12  PRÉLÈVEMENT MATÉRIEL NÉCESSAIRE POUR LE PRÉLÈVEMENT : 13  PRÉLÈVEMENT MATÉRIEL NÉCESSAIRE POUR LE PRÉLÈVEMENT : 14  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions cutanées: o Lésions squameuses : grattage en périphérie des lésions en utilisant une curette ou un vaccinostyle, recueillir les squames dans une boite de Pétri. 15  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions cutanées: o Lésions suintantes : grattage en bordure de lésion, ou frotter avec un écouvillon. o Plaies : écouvillonnage. 16  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions cutanées: o Si l’on suspecte un Pityriasis versicolor : faire un scotch test cutané. 17  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions de la barbe et du cuir chevelu (teignes) o Lampe de Wood: les cheveux parasités peuvent apparaitre fluorescents: Vert : teigne microspoprique Jaune-vert : teigne favique Absence de fluorescence : teigne trichophytique et teigne inflammatoire 18  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions de la barbe et du cuir chevelu (teignes) o Arracher avec une pince à épiler les cheveux fluorescents o Ou prélever les cheveux cassés à la loupe o Prélever les squames et les croûtes en raclant à la curette. o Lésion inflammatoire/suppurée: prélever le pus par écouvillon 19 Sycosis  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions unguéales: Onyxis Couper la partie atteinte de Leuconychie Périonyxis l’ongle superficielle Récolter le pus avec un écouvillon stérile Gratter à la surface blanche Gratter le matériel friable à l’interface saine 25  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions des muqueuses et orifices naturels: oBouche: écouvillon, en grattant la zone atteinte. 26  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Lésions des muqueuses et orifices naturels: o Anus: racler les squames en périphérie o Cavité vaginale: écouvillonnage sous spéculum o Oreille: s’il existe un bouchon noirâtre, le prélever à la pince. 27  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Prélèvements pulmonaires : Aspirations bronchiques Crachats Préférables récoltés dans un récipient stérile après rinçage de la bouche avec un antiseptique. Lavage broncho- alvéolaire 28  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Urines : o Désinfection soigneuse des parties génito-urinaires o Urines du milieu du jet o Récolte dans un récipient stérile 29  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Selles : o Récoltés dans des boites propres à fermeture hermétique o Ecouvillonnage rectal: nourrisson 30  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : LCR : o Asepsie rigoureuse o A l’aide d’une aiguille, la ponction se fait entre les vertèbres L4-L5 ou L3-L4 o La récolte se fait dans un tube stérile 31  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Sang : Hémoculture Sérum Tube sec o Fongémie o Sérololgie o Mycoses disséminées o Antigénémie 32  PRÉLÈVEMENT MODALITÉS DU PRÉLÈVEMENT : Biopsies : o Une partie destinée à la o Une partie fixée dans du culture sera mise dans liquide de Bouin ou du formol l’eau physiologique servira à l’examen stérile. anatomopathologique. 33 Localisation Prélèvement Délai Conservation Conditionnement d’acheminement Superficielle Grattage (curette Boites stériles 1 à 3 jours +4°C -Peau (squame) ou vaccinostyle) -Phanères : Pince à épiler cheveux, poils (cheveux parasités) et ongles Sous cutanée Ecouvillonnage Flacons stériles 24 heures +4°C (nodules) Biopsie Broncho-pulmonaire Lavage Flacons stériles 24 heures +4°C bronchoalvéolaire (LBA) Aspiration Crachats Localisation Prélèvement Délai Conservation Conditionnement d’acheminement Pleurale Liquide de ponction Flacons stériles 2 heures Traiter Articulaire Liquide de dialyse, immédiatement Péritonéale drains Cérébrale Ponction lombaire Flacons stériles de 2 heures Traiter (LCR) 1ml immédiatement Septicémie: Hémoculture Flacons stériles 24 heures Température Sang fongique ambiante Cathéters centraux Tissus profonds Biopsie Flacons stériles 2 heures Traiter immédiatement 04 EXAMEN DIRECT  EXAMEN DIRECT o Il est indispensable o Basé sur la mise en évidence du champignon dans les lésions o S’il est positif : Il permet d’apprécier la présence et l’abondance d’un champignon. Il oriente le diagnostic en fonction des éléments fongiques observés. Il permet de débuter un traitement Il fait suspecter ou confirme la pathogénicité du antifongique en cas de diagnostic de : champignon isolé (Aspergillus fumigatus). o Teigne ; o Pityriasis versicolor. 37  EXAMEN DIRECT o Ensuite, l’examen direct sera fait en En pratique courante, déposant un peu de liquide ou des le prélèvement restes de prélèvement sur une lame. d’abord est o Ajouter une goutte de liquide de ensemencé sur montage. milieux de culture. o Déposer une lamelle et lire au microscope. 38  EXAMEN DIRECT o Eau physiologique : à utiliser pour tout prélèvement de muqueuses, par l’écouvillon et pour les selles. 39  EXAMEN DIRECT o Eclaircissants : Lactophénol : utile pour éclaircir des préparations un peu épaisse comme : cheveu, crachats, pus… 40  EXAMEN DIRECT o Eclaircissants : Potasse à 30% : pour l’examen direct des préparations épaisses : squames et fragments d’ongles. 41  EXAMEN DIRECT o Eclaircissants : - Déposer le produit sur lame, ajouter 2 à 3 goutte d’éclaircissant puis recouvrir d’une lamelle ( KOH : on peut chauffer doucement au Bec Bunsen pour accélérer l’éclaircissement). - La kératine se dissocie permettant de visualiser les éléments fongiques. 42  EXAMEN DIRECT o Encre de chine diluée (1/3) : - Indispensable et obligatoire pour l’examen direct du LCR. - Elle permet de mettre en évidence la capsule des Cryptocoques (celle- ci apparaît blanche sur fond noir de la préparation). 43  EXAMEN DIRECT o Noir chlorazol : colore électivement les éléments fongiques en noir et supprime les artefacts. 44  EXAMEN DIRECT o Bleu lactophénol ou bleu coton : colore les éléments fongiques en bleu. 45  EXAMEN DIRECT o Lugol 2% : pour tous les prélèvements, il colore les levures et les filaments mycéliens en brun. 46  EXAMEN DIRECT LCR, LBA, urines ou autres liquides biologiques : Il est préférable d’examiner le culot de centrifugation à 1500 tours/minutes pendant 3 minutes, directement ou après coloration. 47  EXAMEN DIRECT Biopsie d’organe ou tissus, pièces opératoires, moelle osseuse ou frottis (crachat, pus…) : Faire un frottis ou apposition sur lame, fixer à la chaleur ou à l’alcool, colorer avec : o Giemsa : donne de bons résultats ; le cytoplasme des éléments fongiques est coloré en violet, la paroi reste blanche. 48  EXAMEN DIRECT Biopsie d’organe ou tissus, pièces opératoires, moelle osseuse ou frottis (crachat, pus…) : Faire un frottis ou apposition sur lame, fixer à la chaleur ou à l’alcool, colorer avec : o Gram : tous les champignons sont gram +. 49  EXAMEN DIRECT Biopsie d’organe ou tissus, pièces opératoires, moelle osseuse ou frottis (crachat, pus…) : Faire un frottis ou apposition sur lame, fixer à la chaleur ou à l’alcool, colorer avec : o Bleu de méthylène : recouvrir la lame de BM ; laisser agir 3 minutes, rincer, les éléments fongiques sont colorés en bleu. 50  EXAMEN DIRECT Il existe des colorations spécifiques pour les champignons qui sont utilisées en anatomopathologie : o Gomori-Grocott ou imprégnation argentique : colore les parois fongiques en noir, le fond de la préparation est contre-coloré en vert pâle. Il n’est pas possible d’observer le détail de cytoplasme et du noyau. 51  EXAMEN DIRECT Il existe des colorations spécifiques pour les champignons qui sont utilisées en anatomopathologie : o L’Acide Périodique-Schiff (PAS): révèle les polysaccharides de la paroi et le glycogène et colore les champignons en rouge-violet. Le cytoplasme et les noyaux sont bien visibles. 52  EXAMEN DIRECT CHAMPIGNONS LEVURIFORMES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX Genre Candida Malassezia sp. Genre Aspergillus Dermatophytes Levures rondes ou Levures rondes ou Filaments (de 4 à 5 μm de Filaments cloisonnés ovales, de 4-8 μm, ovales, de 2-5 μm, diamètre) , cloisonnés, avec et arthrosporés de bourgeonnantes +/- groupées en amas ramifications diamètre régulier pseudomycélium donnant un aspect en dichotomiques à angle aigu (squames, ongles) «grappe de raisin» à 45°, rarement des têtes 5 types de parasitisme aspergillaires (otomycoses) pilaire (cheveux et poils) 53  EXAMEN DIRECT CHAMPIGNONS LEVURIFORMES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX Genre Candida Malassezia sp. Genre Aspergillus Dermatophytes Levures rondes ou Levures rondes ou Filaments (de 4 à 5 μm de Filaments cloisonnés ovales, de 4-8 μm, ovales, de 2-5 μm, diamètre) , cloisonnés, avec et arthrosporés de bourgeonnantes +/- groupées en amas ramifications diamètre régulier pseudomycélium donnant un aspect en dichotomiques à angle aigu (squames, ongles) «grappe de raisin» à 45°, rarement des têtes 5 types de parasitisme aspergillaires (otomycoses) pilaire (cheveux et poils) 54  Dermatophytes –cheveux et poils- Parasitisme endo-ectothrix Parasitisme endothrix Microsporique Miroïde Mégasporé Tricophytique Favique Spores de 2 μm, +++ Spores de 2 μm Au tour du Cheveu rempli de Quelques filaments st autour du cheveu disposées en cheveu, spores souvent vidés de leur formant une gaine chaînette au tour Spores de grande de 3 à 4 μm cytoplasme, remplacé dense et épaisse du cheveu taille de 5 à 6 μm par de l’air → T.violaceum, → Microsporum sp. → T.mentagrophytes → T.verrucosum T.tonsurans → T.schoenleinii Parasitisme endo-ectothrix microsporique 56 Parasitisme endo-ectothrix microïde 57 Parasitisme endo-ectothrix mégasporée 58 Parasitisme endothrix trichophytique 59 Parasitisme endothrix favique 60  05 CULTURE  CULTURE Elle est absolument nécessaire isolement identification des champignons 62  CULTURE o Le milieu Sabouraud : le milieu universel, le plus simple. Il contient du glucose, de la peptone et de l’agar et convient pratiquement à tous les champignons responsables de mycoses. o Le milieu Sabouraud – chloramphénicol (ou gentamycine) : utilisé pour inhiber la pousse des bactéries qui gênent l’isolement et l’identification. o Le milieu Sabouraud –chloramphénicol –actidione : l’actidione (= cycloheximide) est un inhibiteur des moisissures saprophytes. Il est conseillé d’associer ce milieu au précédent en particulier pour les prélèvements de peau, phanères, pulmonaires. L’actidione inhibe également la croissance de certaines levures et sert alors de caractère d’identification. 63  CULTURE o Les hémocultures doivent être ensemencées sur des milieux spécifiques des champignons comme le milieu Mycosis. o Dans quelques cas précis, on utilise d’autres milieux en complément du milieu Sabouraud : Milieu Sabouraud + huile d’olive pour l’isolement de Malassezia sp. Milieu Brain Heart agar pour l’isolement des dermatophytes exigeants. 64  CULTURE 65 En boite : En tube : o Avantages : grande surface d’isolement en cas o Avantages : les cultures se conservent mieux et d’association de champignons se contaminent moins o Inconvénients : la contamination est plus facile o Inconvénients : la surface d’ensemencement est 65 et le milieu se dessèche rapidement à l’étuve beaucoup plus réduite  CULTURE o Il faut ensemencer en abondance + stérilement. o L’idéal est de disposer d’une hotte à flux laminaire. Sinon, travailler devant un Bec Bunsen. Sabouraud- Sabouraud- Examen direct du chloramphénicol- chloramphénicol reste du produit actidione 66  CULTURE o Liquide : laisser couler le produit liquide sur le tube incliné ou ensemencement par stries en boite. o Ecouvillons : frotter l’écouvillon en le roulant sur toute la surface du milieu. o Squames, fragments d’ongle ou cheveux : déposer le produit pathologique à la surface du milieu de culture. 67  CULTURE o Expectorations, selles : prélever avec une pipette Pasteur recourbée, ensemencer largement sur toute la surface. o Biopsies : découper dans une boite de Pétri stérile avec un bistouri, le produit en petits fragments ou broyer avec un peu d’eau physiologique stérile, ensemencer plusieurs fragments sur la surfaces du milieu. 68  CULTURE A 37°C à l’étuve : pour les levures et A.fumigatus (thermotolérant). A 27°C à l’étuve : pour les champignons filamenteux. 69  CULTURE La lecture des cultures se fait : → Après 24 heures et tout les jours pendant 48 h à 8 jours : levures. → Tous les 5 jours pendant 3 à 4 semaines : dermatophytes. 70  CULTURE Regarder attentivement dans un endroit bien éclairé, les tubes ou boites de culture. Noter l’aspect des colonies : o Colonies crémeuses, lisses ou rugueuses de couleur blanc, beige ou rouge : levures. o Colonies duveteuses, cotonneuses ou poudreuses : champignons filamenteux. 71  06 IDENTIFICATION  IDENTIFICATION Les techniques d’identification dépendent des champignons isolés : levures ou champignons filamenteux. 73 IDENTIFICATION identification des Levures Critères morphologiques Critères physiologiques 75  IDENTIFICATION Examen macroscopique de la souche : o Couleur : blanche à crème. o Consistance : crémeuse et lisse o Durée de pousse : 24 à 48 heures. 76  IDENTIFICATION Test de chlamydosporulation : Il se fait par repiquage sur milieux spéciaux :  Rice Agar Tween 80 (RAT)  Pomme de terre- Carotte-Bile (PCB). 77  IDENTIFICATION Test de chlamydosporulation : Technique : - Couler sur une lame microscopique, à l’aide d’une pipette, 0,8 ml du milieu préalablement fondu. - Ensemencer les levures en faisant 2 ou 3 stries dans la gélose. - Recouvrir d’une lamelle. - Poser la lame dans une boite bien fermée pour éviter la dessiccation. - Mettre à l’étuve à 27°C (Pendant 24 à 48 h). 78  IDENTIFICATION Test de chlamydosporulation : 79  IDENTIFICATION Test de chlamydosporulation : Résultats : C.albicans produit après 24 heures à 48 heures à 27°C en anaérobiose des chlamydospores à l’extrémité des pseudofilaments. La chlamydospore : spore de résistance, peut être terminale ou latérale, de forme ronde, mesure de 10-15 μm, à paroi épaisse, à double contour. 80 IDENTIFICATION 81 IDENTIFICATION 82  IDENTIFICATION Teste de blastèse ou de germination : Technique : - Mélanger une pointe de pipette de levures dans un tube contenant 0,5 ml du sérum animal ou humain. - Mettre à l’étuve à 37°C pendant 3 à 4 heures au maximum. - Prélever une goutte du culot et examiner au microscope entre lame et lamelle. 83  IDENTIFICATION Teste de blastèse ou de germination : Résultat : Si la levure est Candida albicans, on observe l’émission d’un tube germinatif à partir de blastospore. Le tube germinatif est fin, flexueux et ne présente pas une constriction à sa base. 84 IDENTIFICATION 85 IDENTIFICATION 86  IDENTIFICATION Elle est basée principalement sur les caractères d’assimilation et de fermentation des sucres. Auxanogramme : étude de l’assimilation des sucres - Utiliser le milieu yeast-nitrogen-base (YNB) fondu au bain marie, ramené à 45°C ; - Préparé une suspension de levure à étudier dans 2 ml d’eau distillée stérile ; - Dans une grande boite de Pétri, verser la suspension de levures puis le YNB ; - Mélanger le tout. Laisser solidifier ; - Déposer les disques de sucre à la surface de la gélose ; - Incuber 24 à 48 heures à 27°C ; 87 IDENTIFICATION 88  IDENTIFICATION Elle est basée principalement sur les caractères d’assimilation et de fermentation des sucres. Auxanogramme : étude de l’assimilation des sucres → L’assimilation du sucre se traduit par la croissance de la levure autour du disque correspondant. 89  IDENTIFICATION Elle est basée principalement sur les caractères d’assimilation et de fermentation des sucres. Auxanogramme : (Auxanogramme API, Auxacolor) - La levure est placé en aérobiose en présence d’une panel d’hydrates de carbones (oses simples, polyols, osamines..) → L’assimilation du sucre se traduit par un trouble dans la cupule ou par le virage d’un indicateur de pH. 90 Auxanogramme API IDENTIFICATION 91  IDENTIFICATION Auxacolor 92  IDENTIFICATION Elle est basée principalement sur les caractères d’assimilation et de fermentation des sucres. Zymogramme : étude de la fermentation des sucres - Utiliser une batterie de tubes de milieu gélosé molle pour fermentation ; - Ajouter dans chaque tube 1ml du sucre à étudier après avoir fait fondre la gélose. - Laisser solidifier ; 93  IDENTIFICATION Elle est basée principalement sur les caractères d’assimilation et de fermentation des sucres. Zymogramme : étude de la fermentation des sucres - Prélever une pointe de pipette de la levure et ensemencer chaque tube par piqûre centrale jusqu’au fond du tube. (changer de pipette pour chaque tube) ; - Incuber 24 à 48 heures à 37°C. 94 IDENTIFICATION 95  IDENTIFICATION Elle est basée principalement sur les caractères d’assimilation et de fermentation des sucres. Zymogramme : Assimilation des hydrates de carbone comme source de carbone et d’énergie en anaérobiose ( cupules recouvertes d’ huile de paraffine) → Production des métabolites acides avec virage de l’indicateur pH → l'identification de l'espèce est assurée par comparaison à des bases de données. 96  IDENTIFICATION Milieu Chromagar 97 IDENTIFICATION identification des champignons filamenteux principalement morphologique Critères Critères macroscopiques microscopiques 99  IDENTIFICATION o Délai de pousse ; o La consistance de la colonie : glabre, duveteuse, poudreuse, cotonneuse… o La couleur : du recto et du verso ; o La présence d’un pigment diffusible dans la gélose (dermatophytes). 100  IDENTIFICATION - Prélever un fragment de la colonie à l’aide d’une spatule, le déposer sur une lame avec 2 gouttes de bleu lactophénol, poser une lamelle sur la préparation en écrasant doucement la gélose. 101  IDENTIFICATION Technique de drapeau : - Coller l’extrémité d’un fragment de ruban adhésif (scotch) sur une pipette Pasteur, le déposer du bord vers le centre, sur la colonie ; puis le décoller délicatement de la colonie et recoller sur une lame avec une goutte de bleu lactophénol ; recouvrir d’une goutte de colorant (empêcher la formation d’une bulle d’air), puis déposer la lamelle. 102 IDENTIFICATION 103  IDENTIFICATION En absence de sporulation, il faut alors essayer de faire fructifier le champignon en le repiquant sur des milieux spéciaux qui favorisent la sporulation. 104  Champignons filamenteux Milieux Champignons Intérêt MILIEU EAU GELOSEE A 2% (EG Trichophyton rubrum Meilleure fructification 2%) BRAIN-HEART EN BOITE DE T.ochraceum, T. violaceum, Dermatophytes exigeants PETRI T.schoenleinii MILIEU P.D.A (POMME DE Microsporum canis Pigments + Sporulation TERRE- GLUCOSE- AGAR) MILIEUX LACTRIMEL DE T. rubrum, M.canis Pigments + Sporulation BORELLI MILIEU CZAPEK Aspergillus Pigments + Sporulation MILIEU CORN MEAL AGAR Aspergillus Pigments + Sporulation (CMA) MILIEU EXTRAIT DE MALT Aspergillus Pigments + Sporulation DERMATOPHYTES 106 DERMATOPHYTES 107 DERMATOPHYTES 108 DERMATOPHYTES 109 DERMATOPHYTES 110 DERMATOPHYTES 111 DERMATOPHYTES 112 DERMATOPHYTES 113 DERMATOPHYTES Nannizzia gypsea 114 DERMATOPHYTES Nannizzia gypsea 115 DERMATOPHYTES 116 DERMATOPHYTES 117 DERMATOPHYTES 118 DERMATOPHYTES 119 DERMATOPHYTES 120 Aspergillus 121 Aspergillus 122 Aspergillus 123 Aspergillus 124 Aspergillus 125 Aspergillus 126 127 128 129 130 MERCI DE VOTRE ATTENTION