Ćw. 2 Biologia Komórki 2023 PDF

Katedra Histologii i Embriologii 2023 Biologia Komórki 2023 - Ćwiczenie 2 Techniki stosowane w mikroskopii świetlnej pobieranie utrwalanie płukanie odwadnianie płyny pośrednie materiału krioprotekc...

Katedra Histologii i Embriologii 2023 Biologia Komórki 2023 - Ćwiczenie 2 Techniki stosowane w mikroskopii świetlnej pobieranie utrwalanie płukanie odwadnianie płyny pośrednie materiału krioprotekcja zamrażanie zatapianie w odparafinowanie krojenie parafinie nawadnianie barwienie odwadnianie Technika parafinowa prześwietlanie zamykanie Technika mrożeniowa TECHNIKA MROŻENIOWA polega na utwardzeniu materiału biologicznego przez jego zamrożenie. technikę mrożeniową stosuje się w histochemii i immunocytochemii, gdyż zachowuje aktywność biologiczną białek (enzymów) oraz skład chemiczny wszystkich substancji komórki (m.in. lipidów), materiał biologiczny utrwalamy przez 45 minut w 4% paraformaldehydzie, następnie płuczemy w buforze fosforanowym, ok. 70% masy materiału biologicznego stanowi woda, która podczas zamrażania zamienia się w bardzo liczne i szybko przybierające na masie i wielkości kryształki, które mogą uszkodzić struktury komórek. By temu zapobiec i zminimalizować proces krystalizacji, przed zamrożeniem stosuje się krioprotekcję tkanek – czyli przepojenie utrwalonej tkanki substancją, której wodny roztwór nie tworzy kryształków, lecz ulega żelifikacji. Najczęściej stosuje się roztwory sacharozy lub glicerolu (30%). Tak przepojoną tkankę zamraża się potem w temperaturze minimum -25°C (przy dłuższym czasie przechowywania nawet -80°C), krojenie zamrożonego materiału przy pomocy kriostatu – jest to zmodyfikowany mrożeniowy mikrotom rotacyjny umieszczony w komorze chłodniczej o temperaturze regulowanej od -25 do -60 ºC. Elementy sterujące (napęd, regulacja grubości skrawków, odległości noża od materiału) są wyprowadzone na zewnętrznej obudowie komory, by zapobiec odmrożeniu rąk pracującego. Kroimy skrawki grubości 8-16 µm. pojedynczy skrawek z noża zbiera się bezpośrednio na szkiełko, na którym jest rozmrażany, suszony i od razu barwiony (bez konieczności stosowania alkoholi i innych rozpuszczalników organicznych jak w technice parafinowej). 1 Katedra Histologii i Embriologii 2023 KROJENIE MATERIAŁU NIEUTWARDZONEGO stosowane w cytochemii i immucytochemii w mikroskopii elektronowej krojenie przy pomocy wibratomu (nóż drga z określoną częstotliwością) skrawki grube 50 – 100 μm, nierówne jest to metoda najszybsza W medycynie zaletą krojenia na wibratomie i w kriostacie jest wykorzystanie tych technik np. w czasie kilkugodzinnych operacji, gdy chirurg wycinając fragment tkanki i przekazując do analizy, może liczyć na to, że w trakcie operacji wróci do niego wynik histopatologiczny. Wówczas wie dokładnie, z jaką tkanką patologiczną ma do czynienia i odpowiednio do tego zmodyfikować przebieg zabiegu. Mikroskop fluorescencyjny Fluorescencja – emitowanie światła (widzialnego) przez substancję chemiczną pod wpływem naświetlania jej promieniami ultrafioletowymi (UV). Własność tę posiadają niektóre substancje obecne w komórkach i tkankach (porfiryny, witamina A, lipofuscyny, chlorofil) oraz specjalne barwniki tzw. fluorochromy używane w metodyce histologicznej i histochemicznej. Źródłem światła w mikroskopie fluorescencyjnym jest specjalna żarówka emitująca promieniowanie UV. Dodatkowo mikroskop ten posiada zestaw filtrów przepuszczających jedynie widzialne UV o 2 Katedra Histologii i Embriologii 2023 pożądanej długości fali, chroniąc tym samym narząd wzroku przed szkodliwym działaniem pozostałych promieni UV. Światło to pada na powierzchnię preparatu i pobudza fluorochromy do świecenia. Obrazem w mikroskopie fluorescencyjnym są widoczne na ciemnym tle świecące (fluoryzujące) struktury komórek i tkanek. Kolor fluorescencji zależy od rodzaju substancji fluoryzującej. Konfokalny skaningowy mikroskop świetlny - nowoczesna odmiana mikroskopu fluorescencyjnego, w którym źródłem światła jest laser, skupiany w wiązkę o średnicy zaledwie 0,1 μm, co stanowi teoretyczną zdolność rozdzielczą tego mikroskopu, - mikroskop ten jest sprzężony ściśle z odpowiednim programem komputerowym, - wiązka lasera z dużą szybkością skanuje preparat na określonej równoległej płaszczyźnie, komputer rejestruje obrazy serii przekrojów optycznych wszystkich warstw preparatu (np. warstw o grubości 1-2 µm w skrawku histologicznym o grubości 20 µm), łączy je razem i umożliwia tworzenie trójwymiarowego obrazu badanego obiektu, który ogląda się na monitorze. W innych typach mikroskopu świetlnego ostry obraz można uzyskać tylko z jednej określonej głębokości – warstwy preparatu uwarunkowanej m.in. jego odległością od obiektywu, - w większości przypadków mikroskopy konfokalne wykorzystują fluorescencję emitowaną pod wpływem laserowego światła przez odpowiednio zabarwiony preparat. METODY CYTOCHEMICZNE Zasady metod cytochemicznych: - pozwalają na zidentyfikowanie w komórkach (cytochemia) i tkankach (histochemia) określonych substancji chemicznych oraz enzymów, - stanowią one połączenie metodyki histologicznej i reakcji chemicznych, - w odróżnieniu od barwienia histologicznego (mającego na celu głównie skontrastowanie struktur komórek i tkanek), reakcje cytochemiczne prowadzą do uwidocznienia w preparacie mikroskopowym jedynie ściśle określonych substancji chemicznych będących przedmiotem badań (np. zawartość lipidów, glikogenu, konkretnych enzymów i białek w komórkach, co ułatwia identyfikację różnych typów komórek w danej tkance), - na szkiełku podstawowym przeprowadza się reakcję chemiczną, która przebiega pomiędzy szukaną substancją zawartą w materiale biologicznym oraz wprowadzonym do środowiska reakcji związkiem chemicznym (substratem); w miejscu wykrywanej substancji powstaje produkt reakcji cytochemicznej, którego lokalizacja i ilość jest oceniana w MŚ lub ME, 3 Katedra Histologii i Embriologii 2023 - produkt reakcji musi być widoczny (barwny - MŚ, fluoryzujący - MF lub elektronowo gęsty - ME) i nierozpuszczalny (co zapobiega jego wypłukaniu i zatarciu pierwotnej lokalizacji) w środowisku reakcji, - reakcje cytochemiczne cechuje duża specyficzność (swoistość). Typy reakcji cytochemicznych: - bezpośrednia – reakcja wykrywanej substancji (np. enzymu) z substratem prowadząca do powstania produktu wyznaczającego miejsce jej lokalizacji, - dwu lub kilkuetapowa – w której wstępnie dochodzi do zmiany struktury chemicznej szukanej substancji, a potem ten zmieniony związek chemiczny jest wykrywany przez przeprowadzenie końcowej reakcji barwnej, reakcje kilkuetapowe są bardzie czułe niż jednoetapowa. Wykrywanie związków chemicznych w cytochemii: kw. nukleinowe, cukry i niektóre białka – można badać w materiałach przygotowanych techniką parafinową, aminy biogenne, np. katecholaminy (noradrenalina i adrenalina), histamina, serotonina - najlepiej w materiałach przygotowanych metodą liofilizacji (proces suszenia zamrożonego materiału w próżni i w obniżonej temperaturze) enzymy, tłuszcze – w technice mrożeniowej, w tej technice można badać wszystkie pozostałe substancje chemiczne. Przykłady reakcji cytochemicznych klasycznym MŚ: wykrywanie białek zawierających tyrozynę - reakcja Millona, białka wybarwiają się na kolor ceglastoczerwony wykrywanie cukrowców - reakcja PAS., cukry wybarwiają się na kolor czerwony wykrywanie lipidów - głównie Sudan III i IV (tłuszcze pomarańczowe), czerń sudanowa, czerwień oleista, wykrywanie kwasów nukleinowych DNA - reakcja Feulgena, wykrywanie enzymów - oparte jest na uwidocznieniu produktów ich aktywności (wykrywany enzym musi być aktywny; do środowiska wprowadzamy substrat, który pod wpływem aktywności wykrywanego enzymu ulega przemianie w barwny produkt po dodaniu barwnika – chromogenu w MŚ lub elektronowo gęsty strąt w ME). Reakcje te polegają na specyficznym wiązaniu barwników na drodze oddziaływań elektrostatycznych lub chemicznych lub wybiórczym uwidacznianiu niektórych związków opartym na selektywnej rozpuszczalności w nich barwników (np. wykrywanie lipidów Sudanem). Równolegle razem z właściwymi reakcjami cytochemicznymi, na innych skrawkach zawsze przeprowadza się reakcje kontrolne - pozwalają one na sprawdzenie swoistości reakcji cytochemicznych, a przez to wiarygodności uzyskanych wyników. Typy reakcji kontrolnych: - swoiste blokowanie chemiczne badanej substancji, - opuszczanie procedur wstępnych w przypadku reakcji wieloetapowych, 4 Katedra Histologii i Embriologii 2023 - inkubacja bez substratu (w reakcjach enzymatycznych), - blokowanie wykrywanych enzymów swoistymi inhibitorami. Jeśli zastosowana metoda cytochemiczna jest prawidłowa, to w reakcjach kontrolnych uzyskuje się wynik negatywny. Reakcje cytochemiczne w mikroskopie elektronowym: Cytochemia w mikroskopii elektronowej ograniczona jest głównie do reakcji enzymatycznych. Cukrowce i lipidy uwidaczniają się w postaci dobrze skontrastowanych czarnych struktur na preparatach przygotowywanych typową rutynową techniką do badań w TEM. METODY IMMUNOCYTO(HISTO)CHEMICZNE (IHC) Charakteryzują się najwyższą swoistością. Polegają na wykrywaniu i lokalizacji składników komórek (cyto) i tkanek (histo) na zasadzie reakcji antygen – przeciwciało, czyli wykrywaniu substancji o charakterze antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał. Antygen - jest to substancja (zazwyczaj białko proste lub złożone, rzadziej związek o niższej masie cząsteczkowej) wykazująca zdolność do wywoływania produkcji swoistych przeciwciał przez system immunologiczny oraz swoistego wiązania wytworzonych przeciwciał i tworzenia z nimi kompleksów. Każda struktura komórkowa, w skład której wchodzą białka (lub inne substancje zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej) ma potencjalne własności antygenowe i to właśnie wykorzystuje immunocytochemia. Epitop (determinanta antygenowa) to fragment antygenu, miejsce bezpośredniej interakcji z przeciwciałem. Na powierzchni jednego antygenu może znajdować się kilka determinant antygenowych. Przeciwciało - białko – immunoglobulina, o masie cząsteczkowej 150-970 kDa, wytwarzane przez plazmocyty (pobudzone limfocyty B) w trakcie odpowiedzi humoralnej, zdolne do wiązania się z antygenem. Ma ono kształt litery Y i składa się z dwóch ciężkich i dwóch lekkich łańcuchów polipeptydowych. Pod wpływem trawienia papainą rozpada się na fragment Fc (fragment crystallizable) oraz dwa fragmenty Fab (fragment antygen-binding), które zawierają miejsca wiążące antygen. Przeciwciała do badań uzyskuje się w laboratoriach w wyniku immunizacji zwierząt. Uzyskuje się generalnie dwa typy przeciwciał: przeciwciała monoklonalne – otrzymywane z jednego klonu limfocytów B, wykazują jednakową swoistość oraz powinowactwo względem tego samego antygenu (najlepsze do badań), przeciwciała poliklonalne – wykazują różne powinowactwo, ponieważ wiążą różne epitopy tego samego antygenu 5 Katedra Histologii i Embriologii 2023 Przygotowanie materiału do badań cytochemicznych i immunocytochemicznych w mikroskopie świetlnym: 1. Materiał do badań może być pobrany przyżyciowo (w trakcie zabiegu operacyjnego, metodą biopsji) lub pośmiertnie. 2. Utrwalanie materiału ma kluczowe znaczenie w IHC. Najczęściej stosowanymi utrwalaczami są zbuforowana 10% formalina (technika parafinowa) lub 4% paraformaldehyd (technika mrożeniowa). Utrwalacze te pozwalają na zachowanie odpowiedniej struktury tkanki, jednak wpływają na tworzenie się wiązań poprzecznych między białkami, zmieniając tym samym ich antygenowość. Przy odpowiednio krótkim czasie utrwalania (od 45 minut – w przypadku para formaldehydu, do 12 – 24 h w przypadku formaliny) wiązania te są odwracalne. 3. Utrwalony materiał zostaje następnie poddany: odwodnieniu, prześwietleniu, przepojeniu parafiną oraz zatopieniu w parafinie (technika parafinowa) lub wypłukany w buforze fosforanowym, poddany krioprotekcji (sacharoza 30%) i zamrożony w -25˚C (technika mrożeniowa). W przypadku techniki parafinowej, konieczne jest odzyskanie antygenowości, które przeprowadzamy w następujący sposób: ▪ usunięcie parafiny przy użyciu ksylenu, ▪ poddanie skrawków obróbce termicznej w buforze cytrynowym w łaźni wodnej o temp. 99oC przez 30 minut lub w mikrofalówce, ▪ odzyskiwanie epitopów metodą enzymatyczną przy użyciu np. trypsyny. Blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania w przypadku IHC Pomimo specyficzności wiązania przeciwciał z odpowiednimi antygenami, w tkance mogą występować inne białka o zbliżonej budowie, do których przeciwciała mogą się przyłączać i dawać fałszywie pozytywną reakcją lub tzw. „tło” maskujące właściwy produkt reakcji. Aby wyeliminować to zjawisko wykonujemy „blokowanie” miejsc niespecyficznego wiązania przy użyciu: surowicy, albuminy surowicy bydlęcej BSA (Bovine Serum Albumin), odłuszczonego mleka, żelatyny, komercyjnie dostępnych buforów blokujących. Typy reakcji immunocytochemicznych 1. reakcje bezpośrednie (jednoetapowa) – dodaje się znakowane (najczęściej pojedyńczą cząsteczką enzymu lub fluorochromem) przeciwciało pierwotne bezpośrednio przeciwko szukanemu antygenowi, 2. reakcje pośrednie – bardziej swoiste, w I etapie przeprowadza się reakcję antygenu z nieznakowanym przeciwciałem pierwotnym, w II etapie stosuje się znakowane antyprzeciwciała (przeciwciało wtórne łączące się swoiście z 6 Katedra Histologii i Embriologii 2023 przeciwciałami pierwotnymi) – by taka reakcja mogła zajść, antyprzeciwciała muszą pochodzić od innego gatunku zwierzęcia (np. w I etapie używa się nieznakowane pierwotne przeciwciała królicze, a w II etapie znakowane przeciwciała wtórne kozy przeciwko pierwotnym przeciwciałom króliczym). Przykłady reakcji pośrednich: a. reakcja awidyna – biotyna (metoda ABC). Reakcja ABC zachodzi w trzech etapach: 1) antygen tkankowy reaguje z przeciwciałem pierwotnym, 2) kompleksu antygen-przeciwciało pierwotne reaguje z przeciwciałem wtórnym związanym z biotyną (witaminą H) 3) reakcja powstałego kompleksu antygen tkankowy- przeciwciało pierwotne-przeciwciało wtórne z biotyną z awidyną i peroksydazą. Awidyna (białko obecne w jajach) wykazuje duże powinowactwo do biotyny i jest to jedno z najmocniejszych zaobserwowanych w przyrodzie interakcji niekowalencyjnych. Jedna cząsteczka awidyny wiąże cztery cząsteczki biotyny. Z cząsteczkami biotyny łączy się też peroksydaza, powstanie więc wspólny kompleks przeciwciało wtórne-awidyna-biotyna-peroksydaza, do którego dodajemy substrat. Przebieg tej reakcji ocenia się na podstawie aktywności peroksydazy w reakcji enzymatycznej (dodanie substratu dla peroksydazy). Metoda jest czulsza niż reakcja bezpośrednia, gdyż na jednym przeciwciale wtórnym tworzy się duży kompleks wielu enzymów połączonych z awidyną i biotyną, co zapewnia później intensywne barwienie produktów tych enzymów nawet dla słabo eksponowanych antygenów. b. detekcja polimeryczna - przeciwciało pierwotne połączone z antygenem łączy się z przeciwciałem wtórnym połączonym ze spolimeryzowanymi cząsteczkami enzymu HRP (peroksydaza chrzanowa HRP – horseradish peroxidase) oraz innymi przeciwciałami wtórnymi za pośrednictwem tychże polimerów HRP. Powstaje duży kompleks wielu przeciwciał wtórnych ze spolimeryzowanymi cząsteczkami HRP przyłączony do jednego przeciwciała pierwotnego. Podobnie jak w reakcji ABC, metoda jest znacznie czulsza i umożliwia lepszą penetrację przeciwciał do miejsca wiązania z antygenem, zapewnia intensywne barwienie dla słabo eksponowanych lub nawet pojedynczych antygenów. Znakowanie i wizualizacja przeciwciał: a) w metodach immunoenzymatycznych – do przeciwciał znakowanych enzymami (np. peroksydazą HRP lub fosfatazą zasadową) do środowiska reakcji dodajemy substrat (dla enzymu 7 Katedra Histologii i Embriologii 2023 HRP jest to najczęściej nadtlenek wodoru), a w ostatnim etapie chromogen (barwnik), np. DAB, AEC (czerwony, czarny), umożliwiający otrzymanie barwnego produktu reakcji – do oglądania w MŚ, b) w immunofluorescencji – najpowszechniejszej - przeciwciała znakowane są fluorochromami - barwnikami pochłaniającymi UV i emitującymi światło widzialne (fluorescencyjne) dla oka człowieka, do oglądania w mikroskopie fluorescencyjnym. Najczęściej używanymi fluorochromami w IHC są: zielony FITC, czerwona rodamina i niebieskie DAPI. c) znakowanie przeciwciał metalami ciężkimi - ferrytyną (białko zawierające żelazo) i złotem – tylko do badania w ME. Przygotowanie do badań IHC oraz cytochemicznych (enzymatycznych) w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM): 1. Utrwalenie. 2. Pokrojenie materiału nieutwardzonego na skrawki wibratomowe o grubości 50-100 µm. 3. Reakcja cytochemiczna lub immunocytochemiczna na skrawku wibratomowym. 4. Zatapianie w żywicy epoksydowej. 5. Krojenie na ultracienkie skrawki. 6. Kontrastowanie i obserwacja w TEM. HODOWLA KOMÓREK I TKANEK IN VITRO - jest metodą umożliwiającą utrzymywanie poza organizmem, czyli in vitro, komórek, fragmentów tkanek lub narządów przez okres dłuższy niż 24 godziny (hodowla do 24 godzin to inkubacja), - termin hodowla tkanek jest pojęciem szerokim i obejmuje hodowlę wycinków tkankowych, hodowle narządowe, hodowle komórek (pierwotne, linii i szczepów komórkowych). Często używane są dwa terminy: - hodowla komórek (w odniesieniu do wyizolowanych, rozproszonych komórek, które nie wytwarzają wyżej zorganizowanych struktur tkankowych), - hodowla tkanek (w stosunku do hodowli embrionalnych zawiązków narządów jak i całych lub fragmentów narządów, hodowli przestrzennych). Metoda pozwala na obserwowanie zachowania i badanie żywych komórek i tkanek pozbawionych kontrolnego i regulacyjnego wpływu organizmu. Z hodowlą wiążą się pewne specyficzne określenia: - hodowla pierwotna – zapoczątkowana pobraniem komórek lub tkanek bezpośrednio z organizmu - linia komórkowa – powstaje przez przeniesienie części hodowli pierwotnej do odrębnej hodowli. Jeśli materiał daje się potem wielokrotnie przenosić („pasażować”) do kolejnych hodowli, mówi się o ustalonej linii komórkowej. - szczep komórkowy – wyprowadza się go z hodowli pierwotnej lub linii komórkowej poprzez wyodrębnianie komórek z określoną cechą, która się utrzymuje w trakcie dalszych pasaży 8 Katedra Histologii i Embriologii 2023 szczepu. Cecha ta może dotyczyć np. zdolności do produkcji konkretnego związku chemicznego, braku jakiegoś enzymu lub organelli, niewrażliwości na jakąś substancję toksyczną, konkretnego wyposażenia chromosomowego lub antygenowego. - klon komórkowy – to populacji komórek wywodząca się z jednej komórki macierzystej powstałą na drodze jej wielokrotnych podziałów. Najczęściej stosowane typy hodowli: 1. Hodowle komórkowe: a. hodowla jednowarstwowa komórek (w płaskim naczyniu) (2D), b. hodowla komórek w zawiesinie, c. hodowla komórek w postaci agregatów. 2. Hodowle tkanek: a. hodowla narządowa statyczna, b. hodowla narządowa przepływowa – medium inkubacyjne przez nie przepływa i jest zbierane w różnych odstępach czasowych do oznaczania w nim różnych metabolitów uwalnianych przez komórki, c. hodowla przestrzenna (trójwymiarowa 3D). Przykład techniki hodowli jednowarstwowej komórek (2D): - komórki do hodowli jednowarstwowej mogą być pobrane od zwierząt w różnym wieku, - pobiera się wycinki narządów lub całe narządy, których komórki izoluje się poprzez trawienie enzymatyczne spajającej je tkanki łącznej, (jednostopniowe – trypsyną lub kolagenazą i hialuronidazą lub dwustopniowe - kolagenazą, a następnie trypsyną), dodatkowo przygotowanie zawiesiny komórek można wspomagać rozdrabnianiem mechanicznym tkanki - do zakładania i prowadzenia hodowli stosuje się pożywki (medium inkubacyjne) (np. DMEM, HAMS F12) do których jako suplement dodaje się surowicę cielęcą płodową, neonatalną lub surowicę końską, - pożywki (medium) zapewniają: - sterylne środowisko wzrostu (nie dopuszczają do zanieczyszczenia hodowli mikroorganizmami, innymi komórkami lub substancjami toksycznymi). Do pożywek dodaje się czasem antybiotyki chroniące hodowle przez zakażeniami bakteryjnymi, grzybiczymi lub wirusowymi - dostarczają komórkom niezbędnych związków odżywczych i energetycznych - węglowodany, aminokwasy, białka i peptydy, kw. tłuszczowe, cholesterol, lipidy, witaminy, sole mineralne; - zastępują komórkom ich naturalne środowisko - pH pożywek jest zbliżone do naturalnego pH organizmu (utrzymywane przez występujące w pożywce bufory) i wynosi od 6,8 do 7,2. 9 Katedra Histologii i Embriologii 2023 - dodane surowice dostarczają hormonów, czynników wzrostu i różnicowania komórek pobudzających wzrost, intensyfikują różnicowanie się komórek. - hodowle prowadzi się w naczyniach polistyrenowych przystosowanych do adhezji komórek, na siatkach z poliwęglanu lub na szkle, - przy zakładaniu hodowli umieszcza się 1-5 x 105 komórek na 1 cm2, - hodowla prowadzona jest specjalnych inkubatorach (cieplarkach) w atmosferze nawilżonego powietrza o temp. 37-38ºC w przypadku komórek ssaków i 38-40ºC w przypadku komórek ptaków oraz dodatkiem 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. - hodowla komórkowa może by prowadzona w warunkach statycznych lub w przepływie medium. Najczęstszym do wykorzystania materiałem komórkowym, stwarzającym najmniej problemów metodycznych, są fibroblasty, które rosną żywiołowo na każdym podłożu. Bardzo chętnie wykorzystuje się je w badaniach, które mają na celu wykrycie i analizę genetycznie uwarunkowanych chorób metabolicznych. Praktykuje się też krótkotrwałe hodowle leukocytów krwi obwodowej, które poddaje się działaniu mitogenów (substancji inicjujących podziały mitotyczne), następnie zatrzymaniu mitozy na etapie metafazy w celu analizy morfologicznej najlepiej na tym etapie rozwiniętych chromosomów, co pozwala wykryć nieprawidłowości i zaburzenia chromosomowe w badaniach cytogenetycznych. Z odpowiednio wybarwionych chromosomów sporządza się kariogram (mikroskopowy obraz chromosomów uporządkowanych w parach według kolejności). Schemat zestawu do hodowli przepływowej narządowej – przykład: 1 – zasobnik uzupełniający, 2 – pompa perystaltyczna dwukanałowa, 3 – zasobnik główny na medium, 4 – zasobnik na medium z NE, 5 - zawory trójdrożne, 6 – komory hodowlane, 7 – pompa perystaltyczna wielokanałowa, 8 – kolektor próbek, 9 – łaźnia wodna, 10 – źródło światła, 11 - butle z CO2 i O2, 12 – przepływomierz z zaworem, 13 – mieszalnik gazów, 14 – filtr gazu o porach 0,22 μm, 15 – rozgałęźnik i linie dostarczające mieszaninę gazów do zasobników. 10 Katedra Histologii i Embriologii 2023 MIKROSKOPY ŚWIETLNE STOSOWANE DO OGLĄDANIA HODOWLI KOMÓRKOWYCH i nie tylko… : Mikroskop odwrócony - stosowany dla preparatów biologicznych wymagających mikroskopowania „od dołu”, np. hodowli komórek w płaskich naczyniach, w których komórki osiadają na dnie, a nad nimi jest warstwa płynu (odżywki) utrudniająca tradycyjne mikroskopowanie od góry (uniemożliwia zbliżenie obiektywu od góry na odległość niezbędną do wytworzenia ostrego obrazu), - układ optyczny jest odwrócony o 180º (źródło światła i kondensor są w górnej części mikroskopu, a obiektyw i okular w dolnej), - specjalne obiektywy (20 - 60 x) o dużej odległości roboczej pozwalają na obserwacje poprzez dna naczyń wykonane ze szkła lub tworzywa sztucznego o grubości 0,2 – 1,5 mm, - mikroskop odwrócony może posiadać dodatkowo specjalny układ optyczny (kontrastowo- fazowy, fluorescencyjny, polaryzacyjny). Obraz w mikroskopie odwróconym jest rzeczywisty, powiększony i nieodwrócony, co bardzo ułatwia mikromanipulację (np. w zapłodnieniach in vitro). Mikroskop kontrastowo- fazowy Siatkówka oka rejestruje tylko 2 z 3 parametrów fizycznych fali świetlnej – długość fali (odbiera ją jako barwę) - amplitudę fali (odbiera jako stopień jasności). Trzeci parametr – faza fali świetlej - nie jest rejestrowany przez siatkówkę. Faza jednak ulega zmianom przy przechodzeniu światła przez preparat. Różne struktury obecne w preparacie powodują przesunięcie fazy fali świetlnej. To zjawisko wykorzystano w mikroskopii kontrastowo- fazowej. Żywe komórki ssaków (z wyjątkiem tych zawierających pigment) są obiektami fazowymi. Światło przechodzi przez nie jak przez przejrzyste szkło. Obserwator nie dostrzega żadnych zmian ani w jego natężeniu ani w barwie. Jedyną zachodzącą zmianą, którą ludzkie oko nie potrafi ocenić, jest zmiana (przesunięcie) fazy światła. Mikroskop kontrastowo-fazowy zawiera specjalny układ optyczny, który przekształca przesunięcie fazy światła w zmianę jej amplitudy (czytelną dla oka), dzięki temu struktury obecne w preparacie widoczne są w postaci skontrastowanej, czyli jako ciemniejsze lub jaśniejsze. Zastosowanie: - powszechnie używany do badania komórek nie zabarwionych, z reguły żywych (np. z hodowli komórkowej), - do wzmocnienia ogólnego kontrastu w słabo zabarwionych preparatach. Mikroskop interferencyjny - działa także na zasadzie przekształcenia różnic faz fal świetlnych w różnice ich amplitudy 11 Katedra Histologii i Embriologii 2023 - posiada jednak odmienną konstrukcję kondensora, który dodatkowo rozdziela wiązkę światła na dwie składowe (jedną przechodzącą przez preparat, drugą obok preparatu, przez tło - tzw. wiązkę odniesienia, charakteryzującą się m. in. stałym współczynnikiem załamania światła. W tubusie dochodzi do interferencji między nimi, czyli ponownego zespolenia dwóch wiązek w jedną składową). – układ optyczny kontrastuje obraz oraz dzięki temu, że umożliwia obliczenie współczynnika załamania światła promieni przechodzących przez preparat, może służyć do analizy ilościowej suchej masy badanych struktur i do określania grubości skrawków. Istnieje bowiem poznana zależność między stężeniem substancji wchodzących w skład komórki (białka, cukry, lipidy) a wartością współczynnika załamania światła. - układ optyczny pozwala też na rozszczepianie światła białego na barwne części widma i optyczne „wybarwienie” struktur widocznych w obrazie mikroskopowym. Mikroskop z optyką (kontrastem) Nomarskiego - modyfikacja mikroskopii kontrastowo- fazowej i interferencyjnej, - pozwala na znaczące wzmocnienie kontrastu nie zabarwionych struktur komórkowych, - uzyskanie plastycznego, nieomal trójwymiarowego obrazu tych struktur. Mikroskop pola ciemnego - obserwacja w polu ciemnym umożliwia dostrzeżenie w preparacie drobnych cząstek o wymiarach poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego. Wykorzystuje się zjawisko dyfrakcji (ugięcia) promieni świetlnych padających na obiekt o bardzo małych rozmiarach. Przykładowo, drobne cząstki kurzu w powietrzu w normalnych warunkach są niewidoczne, ale gdy znajdą się w smudze światła padającej do pokoju, świecą się. Widzimy to, gdy patrzymy na jasną smugę światła widoczną na ciemnym tle. - w mikroskopie pola ciemnego występuje specjalny kondensor, którego centralna część jest nieprzepuszczalna dla światła; promienie świetlne przechodzą przez preparat pod bardzo ostrym kątem, a do obiektywu trafiają tylko te promienie, które załamują się na krawędziach oglądanych obiektów. Obiekty te widać jako drobne świecące punkty na ciemnym tle, - wykorzystując zjawisko rozpraszania światła na obserwowanych strukturach, można w polu ciemnym rozpoznać np. włókna o grubości zaledwie 5 nm, a więc o wymiarach nawet około 40 razy mniejszych od wartości zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, - mikroskopię ciemnego pola stosuje się głównie do obserwacji mikroorganizmów w płynach ustrojowych Mikroskop polaryzacyjny - używany do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym, - posiada w układzie optycznym pryzmaty powodujące polaryzację światła (uporządkowanie chaotycznych drgań fali świetlnej w jednej płaszczyźnie). Wszystkie obiekty biologiczne pod 12 Katedra Histologii i Embriologii 2023 względem ich wpływu na polaryzację przechodzącego przez nie światła dzielimy na izotropowe (załamują pojedynczo światło i nie zmieniają płaszczyzny polaryzacji, nie są więc widoczne w mikroskopie polaryzacyjnym) oraz anizotropowe (załamują podwójnie światło i zmieniają płaszczyznę polaryzacji promieni świetlnych, są wtedy widoczne) - do obiektów anizotropowych, które można oglądać, należą substancje, w których występuje wysoce uporządkowany układ cząsteczek, np. włókna kolagenowe, zmineralizowana substancja międzykomórkowa tkanki kostnej, miofibryle włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych, krystaliczne i parakrystaliczne wtręty wewnątrzkomórkowe - w histopatologii mikroskop polaryzacyjny służy m. in. do wykrywania złogów skrobiawiczych (amyloidu) w komórkach. Hybrydyzacja in situ Jest to metoda badawcza wykorzystująca jedno z najbardziej swoistych wiązań między makrocząsteczkami żywego organizmu, czyli wzajemne wiązanie komplementarne łańcuchów kwasów nukleinowych oparte na wybiórczym tworzeniu par przez zasady purynowe i pirymidynowe (cytozynę i guaninę oraz adeninę i tymidynę lub uracyl w RNA). Swoistość ta leży u podstawy funkcjonowania całego aparatu genetycznego. Do pojedynczych łańcuchów rozspiralizowanego DNA lub RNA w komórce mogą się przyłączać komplementarne fragmenty łańcuchów kwasów nukleinowych pochodzące z innych źródeł niż z komórki (np. uzyskane sztucznie w laboratorium). Proces ten nazywamy hybrydyzacją. Może ona zachodzić między wszystkimi rodzajami kwasów nukleinowych: - DNA-DNA - DNA-RNA - RNA-RNA. W technice mikroskopowej hybrydyzację wykorzystuje się do precyzyjnej lokalizacji określonych sekwencji nukleotydów (genów) w obrębie komórki, in situ – czyli w miejscu ich naturalnego występowania. Stąd nazwa – hybrydyzacja in situ. Hybrydyzacja in situ umożliwia: - lokalizację konkretnych genów lub ich fragmentów w obrębie chromosomów (tworzenie map genowych, diagnostyka chorób dziedzicznych, wykrywanie onkogenów), - wykrywanie obcego materiału genetycznego (np. wirusów), - ocenę ekspresji konkretnych genów w komórkach poprzez wykrywanie w nich mRNA będącego efektem transkrypcji szukanych genów. Do hybrydyzacji in situ wykorzystuje się swoiste sztucznie wytworzone sondy zbudowane z nukleotydów, komplementarne do tych odcinków DNA lub RNA, które ma wykryć. Najpierw izoluje się wzorcowe odcinki DNA lub RNA, na bazie których wytwarza się sztuczne sondy przy użyciu zaawansowanych technik genetyki molekularnej (z użyciem enzymów rozcinających i powielających kwasy nukleinowe, a także aparatu genetycznego bakteriofagów i bakterii). 13 Katedra Histologii i Embriologii 2023 Aktualnie stosuje się cztery podstawowe rodzaje sond: - dwuniciowe (dwułańcuchowe) sondy DNA, - jednoniciowe sondy DNA, - jednoniciowe sondy oligonukleotydowe, o długości 25-50 nukleotydów, - jednoniociowe sondy RNA. Sondy te są znakowane w celu ich późniejszego uwidocznienia w obrazie mikroskopowym. Do znakowania sond stosuje się substancje, które się wbudowuje do nukleotydów: - znaczniki radioaktywne, czyli izotopy promieniotwórcze: 3H, 32P lub 35S; wykrywane na drodze autoradiografii. - biotynę; - znaczniki antygenowe, które po połączeniu z nukleotydami tworzą determinanty antygenowe, pobudzające układ immunologiczny do tworzenia przeciw nim swoistych przeciwciał. Wykrywane więc za pomocą przeciwciał w immunocytochemii - enzymy; - fluorochromy. 14