Cytochemia i reakcje cytochemiczne

Typy reakcji cytochemicznych

• Reakcja bezpośrednia: substancja (np. enzym) reaguje z substratem, tworząc produkt wyznaczający jej lokalizację.
• Reakcja dwu- lub kilkuetapowa: zmiana struktury szukanej substancji, a następnie reakcja barwna. Reakcje kilkuetapowe są bardziej czułe niż jednoetapowe.

Wykrywanie związków chemicznych w cytochemii

• Kwasy nukleinowe, cukry i niektóre białka: najlepiej badać w materiałach przygotowanych techniką parafinową.
• Aminy biogenne (np. noradrenalina, adrenalina, histamina, serotonina): najlepiej w materiałach przygotowanych metodą liofilizacji.
• Enzymy, tłuszcze: w technice mrożeniowej. Technika mrożeniowa pozwala badać wszystkie pozostałe substancje chemiczne.

Przykłady reakcji cytochemicznych w mikroskopii świetlnej (MŚ):

• Wykrywanie białek zawierających tyrozynę: reakcja Millona (białka wybarwiają się na kolor ceglastoczerwony).
• Wykrywanie cukrowców: reakcja PAS (cukry wybarwiają się na kolor czerwony).
• Wykrywanie lipidów: Sudan III i IV (tłuszcze pomarańczowe), czerń sudanowa, czerwień oleista.
• Wykrywanie kwasów nukleinowych DNA: reakcja Feulgena.
• Wykrywanie enzymów: oparte na uwidocznieniu produktów ich aktywności (wykrywany enzym musi być aktywny).

Reakcje cytochemiczne:

• Polegają na specyficznym wiązaniu barwników na drodze oddziaływań elektrostatycznych lub chemicznych.
• Wybiórcze uwidacznianie niektórych substancji oparte na ich selektywnej rozpuszczalności w barwnikach.

Reakcje kontrolne:

• Przeprowadzane na innych skrawkach tkanek.
• Sprawdzają swoistość reakcji cytochemicznych i wiarygodność uzyskanych wyników.

Przeciwciała:

• Przeciwciała monoklonalne: otrzymywane z jednego klonu limfocytów B, wykazują jednakową swoistość oraz powinowactwo względem tego samego antygenu (najlepsze do badań).
• Przeciwciała poliklonalne: wykazują różne powinowactwo, ponieważ wiążą różne epitopy tego samego antygenu.

Przygotowanie materiału do badań cytochemicznych i immunocytochemicznych w mikroskopie świetlnym (MŚ):

• Pobieranie materiału: przyżyciowo (zabieg operacyjny, biopsja) lub pośmiertnie.
• Utrwalanie materiału: kluczowe znaczenie w IHC. Najczęściej stosowane utrwalacze: zbuforowana 10% formalina (technika parafinowa) lub 4% paraformaldehyd (technika mrożeniowa).
• Utrwalacze zachowują strukturę tkanki, ale wpływają na tworzenie się wiązań poprzecznych między białkami, zmieniając antygenowość.
• Krótki czas utrwalania (45 minut - paraformaldehyd, 12-24h - formalina) wiązań jest odwracalny.

Technika parafinowa:

• Odwodnienie, prześwietlenie, przepojenie parafiną, zatopienie w parafinie.
• Odzyskiwanie antygenowości:
  • usunięcie parafiny (ksylen),
  • obróbka termiczna w buforze cytrynowym (99oC, 30 minut),
  • odzyskiwanie epitopów metodą enzymatyczną (np. trypsyna).

Blokowanie miejsc niespecyficznego wiązania w IHC:

• Zapobiega fałszywie pozytywnym reakcjom i "tłu” maskującemu właściwy produkt reakcji.
• Stosuje się: surowicę, BSA (Bovine Serum Albumin), odłuszczone mleko, żelatynę, bufory blokujące.

Typy hodowli:

• Hodowla pierwotna: pobranie komórek bezpośrednio z organizmu.
• Linia komórkowa: przeniesienie części hodowli pierwotnej. Ustalona linia komórkowa może być pasażowana do kolejnych hodowli.
• Szczep komórkowy: wyodrębnienie komórek o określonej cechy, która się utrzymuje w trakcie pasażowania.
• Klon komórkowy: populacja komórek wywodząca się z jednej komórki macierzystej.

Najczęściej stosowane typy hodowli:

• Hodowle komórkowe:
  • jednowrstawowa komórek (2D),
  • komórek w zawiesinie,
  • komórek w postaci agregatów.
• Hodowle tkanek:
  • narządowa statyczna,
  • narządowa przepływowa (medią inkubacyjne przepływa przez nią),
  • przestrzenna (3D).

Przykład techniki hodowli jednowarstwowej komórek (2D):

• Komórki pobiera się od zwierząt w różnym wieku.
• Pobieranie wycinków narządów lub całych narządów.
• Izolacja komórek: trawienie enzymatyczne spajającej je tkanki łącznej (jednostopniowe - trypsyna lub kolagenaza i hialuronidazą, dwustopniowe - kolagenaza, a następnie trypsyna), dodatkowo rozdrabnianie mechaniczne.
• Stosuje się pożywki (medium inkubacyjne) (np. DMEM, HAMS F12) z dodatkiem surowicy.
• Pożywki zapewniają: sterylne środowisko wzrostu (brak zanieczyszczenia mikroorganizmami, innymi komórkami lub substancjami toksycznymi).

Mikroskop kontrastowo-fazowy:

• Układ optyczny przekształca przesunięcie fazy światła w zmianę jej amplitudy.
• Struktura w preparacie są widoczne w postaci skontrastowanej (ciemniejsze lub jaśniejsze).
• Stosowany do badania nie zabarwionych, żywych komórek (np. z hodowli komórkowej).
• Wzmacnia ogólny kontrast w słabo zabarwionych preparatach.

Mikroskop interferencyjny:

• Podobny do mikroskopu kontrastowo-fazowego.
• Kondensor rozdziela wiązkę światła na dwie składowe (jedna przechodzi przez preparat, druga obok preparatu przez tło), dochodzi do interferencji.
• Umożliwia obliczenie współczynnika załamania światła, służy do:
  • analizy ilościowej suchej masy badanych struktur,
  • określania grubości skrawków.
• Układ optyczny rozszczepia światło białe, umożliwiając optyczne "wybarwienie" struktur.

Mikroskop z optyką (kontrastem) Nomarskiego:

• Modyfikacja mikroskopii kontrastowo-fazowej i interferencyjnej.
• Wzmacnia kontrast nie zabarwionych struktur komórkowych.
• Uzyskuje się plastyczny, nieomal trójwymiarowy obraz struktur.

Mikroskop pola ciemnego:

• Obserwacja w polu ciemnym umożliwia dostrzeżenie drobnych cząstek poniżej zdolności rozdzielczej układu optycznego (np. włókna o grubości 5 nm).
• Wykorzystuje się dyfrakcję (ugięcie) promieni świetlnych na obiekcie.
• Kondensor blokuje centralne promienie.
• Obiekty widoczne jako świecące punkty na ciemnym tle.
• Stosowany głównie do obserwacji mikroorganizmów w płynach ustrojowych.

Mikroskop polaryzacyjny:

• Służy do badań obiektów anizotropowych w świetle spolaryzowanym.
• Układ optyczny posiada pryzmaty polaryzujące światło (uporządkowanie drgań fali świetlnej).
• Obiekty:
  • izotropowe (nie zmieniają płaszczyzny polaryzacji),
  • anizotropowe (załamują podwójnie światło i zmieniają płaszczyznę polaryzacji).
• Przykłady obiektów anizotropowych:
  • włókna kolagenowe,
  • zmineralizowana substancja międzykomórkowa tkanki kostnej,
  • miofibryle włókien mięśniowych poprzecznie prążkowanych.
• Służy do wykrywania złogów skrobiawiczych (amyloidu) w komórkach.

Hybrydyzacja in situ:

• Metoda wykorzystująca komplementarne wiązanie łańcuchów kwasów nukleinowych (cytozynę z guaniną, adeninę z tymidyną/uracylem).
• Swoistość wiązania leży u podstaw funkcjonowania aparatu genetycznego.