Cours Biochimie 5-7 PDF

Cours Biochimie I Leçon 5: Explorer les gènes et les génomes Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant (1970s) Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant (1970s) Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Electrophorèse de DNA sur gel application d'un champ électrique puits gel agarose Electrophorèse de DNA sur gel le puits Gel d’agarose Gel d’agarose baisser la température 'filet de pèche' Gel d’agarose récipient avec agarose et un peigne solution aqueuse verser l'agarose dans l'apparéil Electrophorèse de DNA sur gel Dans quelle direction est-ce que le DNA va migrer? (pôle négatif ou positif) Charge des nucléotides Électrophorèse sur gel des protéines (SDS PAGE) Dans quelle direction est-ce que les protéines se déplacent? (pôle négatif ou positif) Électrophorèse sur gel des protéines charge négative (-) charge positive (+) sodium dodecyl  En direction du pôle positif sulfate (SDS) Electrophorèse sur gel du DNA marker 1 2 de DNA pièces 3 séparées sur gel d'agarose pôle - direction de migration pôle + Electrophorèse sur gel du DNA marker 1 2 3 Quelles sont les pôle - tailles des fragments de DNA direction de migration pôle + Electrophorèse sur gel du DNA marker 1 2 3 Quelles sont les pôle - tailles des fragments de DNA 2600 pairs de base direction de 1700 pairs de base migration 850 pairs de base pôle + Electrophorèse sur gel du DNA marker 1 2 3 Le DNA peut aussi pôle - être quantifié avec l’électrophorese de gel agarose: Marker: 100 ng de chaque fragment direction de migration 1 mg 150 ng pôle + Electrophorèse sur gel du DNA Comment peut-on visualiser le DNA dans un gel d’agarose? Electrophorèse sur gel du DNA l’éthidium bromide Electrophorèse sur gel du DNA Electrophorèse sur gel du DNA Comment peut-on visualiser les protéines sur des gels de polyacrylamide? Coloration des protéines après électrophorèse en utilisant du bleu de Coomassie Une quantité de 0.1 mg de protéine peut être détectée Des protéines avec une différence de masse de 2% peuvent être séparées (e.g. 50 et 51 kDa; 10 aminoacides) Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Enzymes de restriction Coupent les deux brins Réaction d'hydrolyse Hydrolyse avec les enzymes de restriction H2O - H Coupent les deux brins Réaction de hydrolyse Exemple d’une réaction de restriction 5‘-GTGACCGAATTCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATA 3‘-CACTGGCTTAAGTTTCCACGGAAAATAGTAGTGAAATTTTTATTTTTTGTTAATGAGTCACGGACAATAT GCAATTAATTAGAATTCTGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTGCCTTA CGTTAATTAATCTTAAGACTAACTACGGATGTAGTGTTGTTTTTGACTAAATTGTTTACCAACCAGACGGAAT AAACCTTATCCCTATCCAAGAAGTGATG-3‘ TTTGGAATAGGGATAGGTTCTTCACTAC-5‘ EcoRI 5‘-GTGACCG-3‘ 3‘-CACTGGCTTAA-5‘ 5‘-AATTCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATAAGCAGCAATTAATTAG-3‘ 3‘-GTTTCCACGGAAAATAGTAGTGAAATTTTTATTTTTTGTTAATGAGTCACGGACAATATTCGTCGTTAATTAATCTTAA-5‘ 5‘- AATTCTGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTATATTTGAACATTATCTTGATTATATTA-3‘ 3‘- GACTAACTACGGATGTAGTGTTGTTTTTGACTAAATTGTTTACCAACCAGATATAAACTTGTAATAGAACTAATATAAT-5‘ Les enzymes de restriction coupent toujours des séquences palindromiques Pourquoi est-ce que les enzymes de restriction coupent des séquences palindromique? Les enzymes de restriction coupent toujours des séquences palindromiques Les enzymes de restriction sont des homo-dimères: unité 1 et unité 2 Plus de 1000 enzymes de restriction ont été isolées des bactéries de Escherichia Coli de Haemophilius aegyptius Plus de 1000 enzymes de restriction ont été isolées des bactéries Pourquoi est-ce que les bactéries produisent des enzymes de restriction? Mécanisme de protection contre les virus Les bactéries de E.coli produisent l’enzyme de restriction EcoRI Escherichia Coli EcoRI Mécanisme de protection contre les virus Infection d’une cellule de bactérie Mécanisme de protection contre les virus Infection d’une cellule de bactérie Pourquoi est-ce que le DNA des bactéries n’est pas clivé? Mécanisme de protection Enzymes de restriction Werner Arber Hamilton O. Smith Daniel Nathans Biozentrum Basel Johns Hopkins University Johns Hopkins University Nobel prize in 1978 Nobel prize in 1978 Nobel prize in 1978 Première personne à avoir utilisé les Ont découvert les enzymes de enzymes de restriction restriction Application des enzymes de restriction Pour quel application est-ce qu’on pourrait utiliser les enzymes de restriction? L’analyse des longues molécules de DNA cyclic DNA, 48’500 pairs de bases Lambda phage (un virus) L’analyse des longues molécules de DNA + enzyme de restriction (p.ex. BamHI) Combien de fois est-ce que l’enzyme BamHI a coupé le DNA du lambda phage ? L’analyse des longues molécules de DNA + enzyme de restriction (p.ex. BamHI) Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Technologie du DNA recombinant transférer expression un gène d’une protéine spécifique spécifique 5’ 3’ 5’3’ organisme 1 organisme 2 (p.ex. une vache) (p.ex. bactérie) ‘Vecteur’ de DNA Plasmide = DNA circulaire DNA génomique de bactérie (environ 4000 nucléotides, peut se (En E.coli, 4.6 million de nucléotides, répliquer de façon autonome contient tous les gènes du bactérie) dans la bactérie) Vecteur de DNA ouverture des cellules, isolation des plasmides Plasmide isolé (deux brins) Insertion d’un gène dans un plasmide de DNA Insertion d’un gène dans un plasmide de DNA Clivage du plasmide et du DNA extérieur EcoRI extrémités cohésives extrémités cohésives Fusion du plasmide et du DNA extérieur extrémités cohésives Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Séquençage du DNA Frederick Sanger Prix Nobel en 1958 et 1980 Cambridge University Pour quelle contribution a-t-il reçu le premier Prix Nobel? Frederick Sanger Séquence primaire de l'insuline 1953: Détermination de la séquence des aminoacides de l'insuline 1958: Prix Nobel en chimie 1970ies: Développement d’une méthode pour séquencer le DNA 1980: Prix Nobel en chimie Séquençage du DNA Comment pourrait-on séquencer un gène dans un morceau de DNA? 5‘-GTGACCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTA TAAGCAGCAATTAATTATGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGT CTGCCTTAGAAAGTATATTTGAACATTATCTTGATTATATTATTGATAATAATAAAAACCTTATCCC TATCCAAGAAGTGATGCCTATCATTGGTTGGAATGAACTTGAAAAAATTAGCCTTGAATACATT ACTGGTAAGGTAAACGCCATTGTCAGCAAATTGATCCAAGAGAACCAACTTAAAGCTTATGAT AGTGATGTGCTTAAAAACTTACTCAATGGCTGGTTTATGCATATCGCAATACATGCGAAAAACC TAAAAGAGCTTGCCGATAAAAAAGGCCAATTTATTGCTATTTACCGCGGCTTTTTATTGAGCTT GAAAGATAAATAAAATAGATAGGTTTTATTTGAAGCTAAATCTTCTTTATCGTAAAAAATGCCCTC TTGGGTTATCAAGAGGGTCATTATATTTCGCGGAATAACATCATTTGGTGACGAAATAACTAAGCA CTTGTCTCCTGTTTACTCCCCTGAGCTTGAGGGGTTAACATGAAGGTCATCGATAGCAGGATAA TAATACAGTAAAACGCTAAACCAATAATCCAAATCCAGCCATCCCAAATTGGTAGTGAATGATTAT AAATAACAGTAAACAGTAATGGGCCAATAACACCGGTTGCATTGGTAAGGCTCACCAATAATCCC TGTAAAGCACCTTGCTCATGACTCTTTGTTTGGATAGACATCACTCCCTGTAATGCAGGTAAAG- 3’ Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer matrice (un brin de DNA à séquencer) dATP amorce de DNA dCTP DNA polymérase dGTP (‘primer’) dTTP 5’-CTTAAGCGATTACG-3’ Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer amorce de DNA (‘primer’) 5’ 3’ matrice (un brin de DNA à séquencer) Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase amorce de DNA (‘primer’) 5’ 3’ dATP matrice (un brin de DNA à séquencer) Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase amorce de DNA (‘primer’) C3’-O-H 5’ 3’ dATP matrice (un brin de DNA à séquencer) Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase PPi = Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase DNA polymérase catalyse la ligation des nucleotides Élongation dans la direction 5’ → 3’ Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase dATP dCTP dGTP dTTP di-deoxy-adenosine-triphosphate Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer amorce de DNA (‘primer’) 5’ 3’ matrice (un brin de DNA à séquencer) Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase amorce de DNA (‘primer’) 5’ 3’ dATP 5’ matrice (un brin de DNA à séquencer) di-deoxy-ATP Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer DNA polymérase amorce de DNA (‘primer’) C3’-O-H 5’ 3’ dATP 5’ matrice (un brin de DNA à séquencer) di-deoxy-ATP Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer O-H 3’ Synthèse du brin complémentaire du gène à séquencer O-H 3’ Séquençage du DNA d’après Sanger Electrophorèse sur gel: fragment de 12 nucléotides  thymidine en position 12 fragment de 7 nucléotides  thymidine en position 7 fragment de 2 nucléotides  thymidine en position 2 Template-XTXXXXTXXXXT Electrophorèse sur gel: fragment de 9 nucléotides  guaninosine en position 9 fragment de 5 nucléotides  guanosine en position 5 Template-XTXXGXTXGXXT CTAAGCTCGACT Di-deoxy-nucléotides dans les année 1990s Di-deoxy-nucléotides fluorescents Quel est l’avantage des di-deoxy-nucléotides fluorescents? Séquençage du DNA d’après Sanger avec des nucléotides fluorescents DNA polymérase Séquençage de génomes entiers Chef du ‘Human Genome Project’ Fondateur de Celera Genomics Human Celera Genome Genomics Project Février 15, 2001 Février 16, 2001 - Génome humaine: 3'000'000'000 nuclèotides - Sequencer avec la méthode de Sanger: 500-1000 nucléotides milliards de nucléotides - Génome humaine: 3'000'000'000 nuclèotides - Sequancer avec la méthode de Sanger: 500-1000 nucléotides Comment serait-il possible de séquencer un génome humain entier avec la méthode de Sanger? milliards de nucléotides Séquençage du génome Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Amplification des séquences de DNA par la « polymerase chain reaction » (PCR) Kary Mullis Prix Nobel en 1993 deux matrices! Amplification des séquences de DNA par la « polymerase chain reaction » (PCR) PCR vs réplication normale Copies de DNA: Cycles PCR Réplication normale 0 1 1 1 2 2 2 4 3 3 8 4 4 16 5 5 32 6 6 64 7 7 128 8 8 256 9 9 512 10 10 1024 11............ DNA produit par une réaction PCR nombre de cycles de PCR Cycles30 marker 25 20 15 10 5 0 Leçon 5 Electrophorèse de DNA sur gel Enzymes de restriction (1970) Technologie du DNA recombinant Séquençage de DNA (1975) Réaction en chaîne par polymérase (PCR) (1985) Série 4 Question 1 Série 4 Question 2 Série 4 Question 3 Série 4 Question 4 Série 4 Question 5 Série 4 Question 6 Série 4 Question 7 Cours Biochimie I Leçon 6: Synthèse des protéines / expression recombinant Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Leçon 6 Synthèse des protéines - RNA - Ribosome Expression de protéines recombinantes - DNA isolé d’un donneur - Plasmide (vecteur) de DNA - Expression dans un hôte différent DNA d’une protéine fluorescente une méduse souris fluorescentes Synthèse des protéines ? Synthèse des protéines 64 codons T T T T T T Exemple: T T T TTC  Phe T T T Quelques amino T acids ont T T plusieurs codes: T TCT  Ser TCC  Ser TCA  Ser T TCG  Ser AGT  Ser AGC  Ser T Quelques T aminoacids ont T T seulement un code: T ATG  Met TGG  Trp T T Synthèse des protéines ? DNA  RNA  protéine RNA polymérase Le RNA est la matrice pour la synthèse des protéines Ribosome RNA Le RNA est un polymère linéaire composé de nucléotides comme le DNA Le RNA possède un seul brin (ne forme pas de double hélices comme le DNA) RNA Le RNA est un polymère linéaire composé de nucléotides comme le DNA Le RNA possède un seul brin (ne forme pas de double hélices comme le DNA) Quelles sont les différences entre la structure chimique du DNA et du RNA? Structure chimique de RNA Le ribose C3’ C5’ Les bases de DNA et RNA Les bases et nucléosides de DNA et RNA DNA thymin thymidine RNA uracil uridine Transcription Transcription ATP, CTP, GTP, UTP (matrice) Transcription ATP, CTP, GTP, UTP (matrice) Quel processus ressemble à la transcription ? La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse du DNA processus pour doubler le DNA La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse du DNA Enzyme DNA polymérase Direction 5’3’ Matrice DNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse du DNA Synthèse du RNA Enzyme DNA polymérase Direction 5’3’ Matrice DNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse du DNA Synthèse du RNA Enzyme DNA polymérase RNA polymérase Direction 5’3’ Matrice DNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse de DNA Synthèse de RNA Enzyme DNA polymérase RNA polymérase Direction 5’3’ 5’3’ Matrice DNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse de DNA Synthèse de RNA Enzyme DNA polymérase RNA polymérase Direction 5’3’ 5’3’ Matrice DNA DNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP La synthèse du RNA est semblable à celle du DNA Synthèse de DNA Synthèse de RNA Enzyme DNA polymérase RNA polymérase Direction 5’3’ 5’3’ Matrice DNA DNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP ATP, CTP, GTP, UTP Transcription du RNA Brin matrice de DNA mRNA Brin codant de DNA mRNA (=messenger RNA) Brin matrice de DNA Brin codant de DNA Mécanisme de transcription matrice brin mRNA Comparaison avec la DNA polymérisation Comparaison de la RNA et DNA polymérisation Synthèse de RNA Synthèse de DNA RNA DNA polymérase polymérase (amorce) RNA Comparaison de la RNA et DNA polymérisation Synthèse de RNA Synthèse de DNA RNA DNA polymérase polymérase (amorce) RNA Comment est-ce que la RNA polymérase sait-elle à quelle position dans le gène elle doit commencer? La transcription commence près des sites promoteurs position relative au 5’ terminus du mRNA - 35 - 10 1 premier nucléotide Brin matrice de DNA Brin codant de DNA site promoteur RNA polymérase ence La transcription commence près des sites promoteurs Brin codant de DNA région de -35 Pribnow box TTGACA TATAAT La transcription commence près des sites promoteurs Brin codant de DNA similaire Brin codant de DNA Transcription du RNA Brin matrice de DNA mRNA Brin codant de DNA Quand est-ce que la polymérase du RNA termine la synthèse? Séquence de sites de terminaison épingle à cheveux (dans la séquence de mRNA) Séquence de sites de terminaison séquence complémentaire épingle à cheveux (riche en C et G) (dans la séquence de mRNA) plusieurs résidus U Dans les cellules eucaryotes: séquence d’adénulates (queue poly A) Transcription Traduction traduction Transcription Comment le RNA peut-il être traduit en protéines? Translation de RNA adaptateur Translation de RNA adaptateur Translation de RNA adaptateur Quel type de molécule est utilisé comme adaptateur? tRNA (RNA de transfert) tRNA (RNA de transfert) un site d’attachement de l’aminoacide un site de reconnaissance de la matrice (=anticodon) tRNA (RNA de transfert) un site d’attachement de l’aminoacide Comment l’aminoacide peut-il être attaché? un site de reconnaissance de la matrice (=anticodon) Le groupe hydroxyle (3’ ou 2’) du ribose est lié à l’aminoacide par une liaison ester Comment le tRNA peut-il être chargé avec un aminoacide? Le groupe hydroxyle (3’ ou 2’) du ribose est lié à l’aminoacide par une liaison ester Aminoacyl-tRNA synthétase tRNA (RNA de transfert) Translation de RNA adaptateur Translation de RNA Comment est-ce que les adaptateur aminoacides sont connectés? Ribosome 50S 30S Ribosome 2 sous-unités (50S et 30S) Constituants du ribosome: protéines et RNA (rRNA) Ada Yonath Traduction par le ribosome Image d’un mRNA et des ribosomes par microscopie électronique Traduction par le ribosome Comment le ribosome sait-il à quelle position sur le mRNA il doit commencer la traduction? Reading frame: 3 possibilités Reading frame: 3 possibilités Phe – Ser – Asp – Leu - Glu - … Ser – Arg – Thr – Trp – Arg - … Leu – Gly – Pro – Gly - Asp - … Reading frame: 3 possibilités Phe – Ser – Asp – Leu - Glu - … Ser – Arg – Thr – Trp – Arg - … Leu – Gly – Pro – Gly - Asp - … Comment le ribosome sait-il à quelle position sur le mRNA il doit commencer la traduction? La traduction commence toujours avec une méthionine Signal de départ (start codon): AUG Séquence de Shine-Dalgarno Premier aminoacide chez les procaryotes: fMet Signal d’initiation: région avec plusieurs bases de purine (Shine-Dalgarno) Terminaison de la chaîne Comment le ribosome sait-il à quelle position sur le mRNA il doit terminer la traduction? Codons et facteurs de terminaison Codons de terminaison: des tRNA n’existent pas pour quelques codons: UAA, UAG, UGA Facteurs de terminaison: des protéines specifiques Transcription et traduction ? Que se passe-t-il avec le RNA quand la protéine a été synthétisée et que le RNA n’est plus nécessaire? Transcription et traduction Le mRNA est beaucoup moins stable que le DNA  Le mRNA est décomposé Stabilité du DNA et RNA C3’ C5’ Pourquoi est-ce que le RNA est chimiquement moins stable que le DNA? Leçon 6 Synthèse des protéines - RNA - Ribosome Expression de protéines recombinantes - DNA isolé d’un donneur - Plasmide (vecteur) de DNA - Expression dans un hôte différent DNA d’une protéine fluorescente une méduse souris fluorescentes Insuline structure primaire structure tertiaire 51 aminoacides (5808 Da) Protéine importante pour la régulation de la concentration en glucose Une des premières protéines produites par la technologie recombinante Découverte de l'insuline 1921: Les injections d'extrait d'insuline d‘un pancréas de chien diminuèrent la concentration en glucose L'insuline des animaux (cochon, vache) est utilisée pour les personnes diabétiques Quelles sont les limitations de l'insuline porcine ou bovine? Banting and Best Découverte de l'insuline 1921: Les injections d'extrait d'insuline d‘un pancréas de chien diminuèrent la concentration en glucose L'insuline des animaux (cochon, vache) est utilisée pour les personnes diabétiques Quelles sont les limitations de l'insuline porcine ou bovine? - insuline de porc: 1 mutation d‘aminoacide Banting and Best - insuline bovine: 3 mutations d‘aminoacide Insuline humaine recombinante 1978 Genentech produit de l’insuline ‘humaine’ dans des bactéries de Escherichia coli par la technologie de DNA recombinant Expression recombinante de insuline Expression recombinante de insuline Isolation du matériel génétique: - DNA génomique - mRNA Expression recombinante de insuline Isolation du matériel Synthèse génétique: de DNA: - DNA génomique - cDNA - mRNA Expression recombinante de insuline Isolation du matériel Synthèse Insertion dans génétique: de DNA: un vecteur: - DNA génomique - cDNA - plasmide - mRNA Expression recombinante de insuline Isolation du matériel Synthèse Insertion dans Transfert génétique: de DNA: un vecteur: dans l’hôte: - DNA génomique - cDNA - plasmide - bactérie - mRNA Expression recombinante de insuline Isolation du matériel Synthèse Insertion dans Transfert génétique: de DNA: un vecteur: dans l’hôte: - DNA génomique - cDNA - plasmide - bactérie - mRNA mRNA de Transcription inverse plusieurs gènes transcriptase inverse cDNA = DNA complémentaire Transcription inverse transcriptase inverse dATP, dCTP, dGTP, dTTP (enzyme d’un virus) cDNA = DNA complémentaire Transcription inverse transcriptase inverse dATP, dCTP, dGTP, dTTP (enzyme d’un virus) cDNA = DNA complémentaire Polymérases DNA polymérase RNA polymérase transcriptase inverse Quelles sont les fonctions de ces trois polymérases? Polymérases DNA polymérase RNA polymérase transcriptase inverse Fonction duplication de DNA synthèse mRNA synthèse DNA Polymérases DNA polymérase RNA polymérase transcriptase inverse Fonction duplication de DNA synthèse mRNA synthèse DNA Matrice DNA DNA RNA Nucléotides dATP, dCTP, dGTP, dTTP ATP, CTP, GTP, UTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP Transcription inverse transcriptase inverse dATP, dCTP, dGTP, dTTP (enzyme d’un virus) cDNA = DNA complémentaire Synthèse de DNA du gène d’insuline cDNA (DNA complémentaire) cDNA de plusieurs gènes (pas seulement d‘insuline!) Comment pourrait-on synthétiser de grandes quantités de DNA du gène de l'insuline? Synthèse de DNA dans une réaction PCR PCR cDNA (DNA complémentaire) amorces (= primer) spécifiques pour le gène de l'insuline 25 cycles environ 106 copies du gène de l’insuline Expression recombinante de l'insuline Isolation du matériel Synthèse Insertion dans Transfert génétique: de DNA: un vecteur: dans l’hôte: - DNA génomique - cDNA - plasmide - bactérie - mRNA Plasmide de DNA Plasmide = DNA circulaire (environ 4000 nucléotides, peut se DNA génomique de bactérie répliquer de façon autonome (Dans E.coli, 4.6 million de nucléotides, dans la bactérie) contient tous les gènes de la bactérie) Origine de réplication L’origine de réplication permet au plasmide de se répliquer Résistance d'antibiotique Example: résistance ampicillin  expression de la protéine b-lactamase E. coli plasmid pBR322 Expression recombinante de l'insuline Isolation du matériel Synthèse Insertion dans Transfert génétique: de DNA: un vecteur: dans l’hôte: - DNA génomique - cDNA - plasmide - bactérie - mRNA Plasmide de DNA ouverture des cellules, isolation des plasmides isolés plasmides (deux brins) Plasmide de DNA ouverture des cellules, isolation des plasmides isolés plasmides (deux brins) Comment pourrait-on insérer le DNA de l'insuline dans un plasmide? Enzymes de restriction EcoRI extrémités cohésives Ligation du gène de l'insuline dans un plasmide ‘sticky end’ ‘blunt end’ + gène de l'insuline plasmide Ligation du gène de l'insuline dans un plasmide ‘sticky end’ ‘blunt end’ + gène de l'insuline Comment pourrait-on lier le plasmide et le gène de l'insuline? plasmide Introduire des sites de restriction dans le gène de l’insuline par PCR Exemple d’une amorce: 5’-GAATTCGTACCGTTAGTG-3’ ‘sticky end’ ‘sticky end’ Insertion d’un gène dans un plasmide Expression recombinante de l'insuline Isolation du matériel Synthèse Insertion dans Transfert génétique: de DNA: un vecteur: dans l’hôte: - DNA génomique - cDNA - plasmide - bactérie - mRNA Transformation du plasmide dans les bactéries Comment pourrait-on ‘injecter’ le plasmide dans les bactéries? Transformation du plasmide dans les bactéries ampicilline Toutes les bactéries poussent sur la plaque Transformation du plasmide dans les bactéries ampicilline Toutes les bactéries poussent sur la plaque Comment pourrait-on identifier les bactéries qui contiennent le plasmide? Transformation du plasmide dans les bactéries ampicilline Transformation du vecteur dans les bactéries et expression de la protéine Purification des protéines recombinantes bactéries sans bactéries avec plasmide plasmide Ces bactéries expriment une protéine en plus Purification des protéines recombinantes bactéries sans bactéries avec plasmide plasmide Ces bactéries expriment une protéine en plus Comment pourrait-on purifier la protéine recombinante? Méthodes pour la purification des protéines Méthode: Principe de séparation: Chromatographie par gel-filtration Taille Chromatographie par échange d'ions Charge Chromatographie d'affinité Affinité spécifique Chromatographie d’affinité Billes avec des groupes chimiques (par exemple glucose) Une protéine qui a une affinité pour le glucose se fixe sur la colonne Expression de protéines recombinantes avec un ‘tag’ = tag Expression de protéines recombinantes avec un ‘tag’ La protéine ‘GST’ peut se lier au tripeptide ‘glutathione’ GST Purification par chromatographie d’affinité Leçon 6 Synthèse des protéines - RNA - Ribosome Expression de protéines recombinantes - DNA isolé d’un donneur - Plasmide (vecteur) de DNA - Expression dans un hôte différent DNA d’une protéine fluorescente une méduse souris fluorescentes Série 5 Question 1 Di-deoxy nucléotides Direction de l’electrophorese Produits le plus petit matrice (un brin de DNA à séquencer) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’ dATP dCTP amorce de DNA DNA polymérase dGTP (‘primer’) dTTP ddGTP 5’-CTTAAG-3’ matrice (un brin de DNA à séquencer) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’ dATP dCTP amorce de DNA DNA polymérase dGTP (‘primer’) dTTP ddGTP 5’-CTTAAG-3’ 5’-CTTAAXXXXXXG-3’ matrice (un brin de DNA à séquencer) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’ dATP dCTP amorce de DNA DNA polymérase dGTP (‘primer’) dTTP ddGTP 5’-CTTAAG-3’ 5’-CTTAAXXXXXXG-3’ 5’-CTTAAGXXXXXGXGXXXGGGXXXXG-3’ matrice (un brin de DNA à séquencer) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-5’ dATP dCTP amorce de DNA DNA polymérase dGTP (‘primer’) dTTP ddGTP 5’-CTTAAG-3’ 5’-CTTAAXXXXXXG-3’ 3’-GAATTCXXXXXCXCXXXCCCXXXXC-5’ 5’-CTTAAGXXXXXGXGXXXGGGXXXXG-3’ Série 5 Question 2 5’-XXXXXXXXXX-3’ GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC Série 5 Question 3 Série 5 Question 4 Cours Biochimie I Leçon 7: Exploration de l'Évolution Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Leçon 7 Evolution - Charles Darwin - Evidence d’évolution - Mécanisme d’évolution Evolution moléculaire - Evolution des protéines - Arbres phylogénétiques - Comparer DNA et protéines Evolution moléculaire dans une éprouvette Prix Nobel Le Nobel de chimie en 2018 pour des travaux sur l’évolution en éprouvette Frances H. Arnold, George P. Smith et Gregory P. Winter sont récompensés pour leurs travaux permettant d’accélérer la sélection de molécules et de médicaments inédits. Evolution 1831: Tour du monde de 5 ans Observation des espèces vivantes HMS Beagle Charles Darwin Observations de Charles Darwin Quelques espèces (p.ex. oiseaux) ont des qualités supérieures 1838: Théorie sur la séléction naturelle 1859: Origine des espèces (livre) I have called this principle, by which each slight variation, if useful, is preserved, by the term Natural Selection. Charles Darwin from "The Origin of Species“ 1859 Variation et sélection Variation Selection Variation et sélection ancêtre descedants Variation Selection Variation et sélection Variation Selection Variation et sélection Variation Selection Variation et sélection Variation Selection Variation et sélection Variation Selection Variation et sélection Variation Selection Variation et sélection Plusieurs espèces se sont développées d’un seul ancêtre Arbre phylogénétique seul ancêtre Dessin de Charles Darwin aile la fourrure Evolution divergente pattes os Evolution convergente nouvelle qualité 1 nouvelle qualité 1 aile la fourrure Evolution divergente pattes os Est-ce que vous connaissez une qualité qui a developpée 2 fois? Evolution convergente pattes une chauve-souris un oiseau Evolution convergente une chauve-souris un oiseau Quelques espèces Les pattes de ont développé devant se sont des qualités transformées (p.ex. une aile) en ailes. indépendantes L’évolution aujourd’hui Est-ce que l‘évolution continue aujourd‘hui? Est-ce que vous connaissez des exemples? L’évolution continue … Application d’insecticide Mutations du DNA des insectes  expression de Mutations par hasard! protéines mutantes Insectes avec une protéine mutante qui donne une Insectes résistance à l’insecticide survivants La population des insectes avec la résistance va grandir  l’insecticide ne fonctionne plus Leçon 7 Evolution - Charles Darwin - Evidence d’évolution - Mécanisme d’évolution Evolution moléculaire - Evolution des protéines - Arbres phylogénétiques - Comparer DNA et protéines Evolution moléculaire dans une éprouvette Evolution des protéines protéine (= phénotype) Evolution des protéines DNA (= génotype) protéine (= phénotype) Evolution des protéines mutation 1 variation Evolution des protéines mutation 1 sélection Evolution des protéines mutation 1 variation mutation 2 Evolution des protéines mutation 1 mutation 2 sélection Evolution des protéines mutation 1 Comment est-ce que les mutations sont introduites dans le mutation 2 DNA? Mutation pendant la réplication du DNA 5’ 3’ Mutation pendant la réplication du DNA brin à synthétiser 5’ 3’ 1er brin (matrice) Mutation pendant la réplication du DNA brin à synthétiser DNA polymérase 5’ 3’ dATP 1er brin (matrice) Mutation pendant la réplication du DNA brin à synthétiser DNA polymérase C3’-O-H dCTP 5’ 3’ dATP dGTP 1er brin (matrice) dTTP Autres causes de mutations Transformation chimique (p.ex. par un agent alkylant) 5’ Transformation physique (p.ex. rayon X) 3’ Autres causes de mutations brin à synthétiser DNA polymérase dATP dGTP 1er brin (matrice) dCTP dTTP Leçon 7 Evolution - Charles Darwin - Evidence d’évolution - Mécanisme d’évolution Evolution moléculaire - Evolution des protéines - Arbres phylogénétiques - Comparer DNA et protéines Evolution moléculaire dans une éprouvette Arbre phylogénétique Arbre phylogénétique: basé sur la morphologie Chimpanzé Homo sapiens néanderthalien comparaison du phénotype (= morphologie, développement, singe comportement) Homo de neanderthal Arbre phylogénétique: basé sur les séquences de DNA 95-99% similitude 99.5% similitude Chimpanzé disparu Homo sapiens comparaison des séquences protéines et DNA Informations beaucoup plus exactes! Homo de neanderthal Exemple: Le néanderthalien n’était pas un intermédiaire entre les chimpanzés et les homo sapiens Prix Nobel 2022 (Le prix Nobel de médecine et de physiologie) Svante Pääbo Svante Pääbo Svante Pääbo Svante Pääbo Des arbre phylogénétiques exacts peuvent être construits à partir des informations de séquences Leçon 7 Evolution - Charles Darwin - Evidence d’évolution - Mécanisme d’évolution Evolution moléculaire - Evolution des protéines - Arbres phylogénétiques - Comparer DNA et protéines Evolution moléculaire dans une éprouvette Nomenclature: protéines homologues Les protéines homologues descendent d’un ancêtre commun Nomenclature: protéines orthologues Les protéines orthologues ont souvent des fonctions semblables Nomenclature: protéines paralogues Les protéines paralogues ont souvent des fonctions différentes Homologues, orthologues et paralogues Quelles protéines sontLes des homologues? protéines homologues descendent d’un ancêtre commun la grenouille la poule la souris très tôt dans l’évolution Homologues, orthologues et paralogues Les protéines homologues descendent d’un ancêtre commun la grenouille la poule la souris très tôt dans l’évolution Homologues, orthologues et paralogues Les protéines homologues descendent d’un ancêtre Quelles protéines sont des orthologues? commun la grenouille la poule la souris très tôt dans l’évolution Homologues, orthologues et paralogues Les protéines homologues descendent d’un ancêtre commun la grenouille la poule la souris très tôt dans l’évolution Homologues, orthologues et paralogues Quelles protéines sont des paralogues? Les protéines homologues descendent d’un ancêtre commun la grenouille la poule la souris très tôt dans l’évolution Homologues, orthologues et paralogues Les protéines homologues descendent d’un ancêtre commun la grenouille la poule la souris très tôt dans l’évolution Comparaisons de protéines Motivation: Etudier l’évolution (dessiner des arbres phylogénétiques) Etudier les fonctions des protéines - Prévoir les fonctions des protéines inconnues - Prévoir la structure tridimensionnelle Exemple 1: comparaison de l’hémoglobine avec la myoglobine myoglobine hémoglobine Est-ce que l’hémoglobine et la myoglobine sont des homologues? Séquences d’aminoacides de l'hémoglobine et de la myoglobine Comment peut-on comparer les séquences de l’hémoglobine et de la myoglobine? Méthodes d'alignement de séquences  Détecter les aminoacides identiques Méthodes d'alignement de séquences  Detecter les aminoacides identiques Méthodes d'alignement de séquences Il y a plusieurs aminoacides identiques au bout de la séquence Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? Comment pouvons-nous décider de l'endroit où aligner les deux séquences? Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? 141 aminoacides 147 aminoacides Nombre Glisserd'indentités une séquence par rapport à l'autre et compter les aminoacides identiques  288 possibilités Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? Nombre d'indentités 288 possibilités Deux alignements de séquences possibles; lequel est le bon? Nombre d'indentités 288 possibilités L’introduction des « gaps » améliore souvent les alignements L’introductions d’un « gap » résulte en 38 identités par rapport à 23 sans « gap » L’introduction des « gaps » améliore souvent les alignements L’introductions d’un « gap » résulte en 38 identités par rapport à 23 sans « gap » Comment peut-on trouver les gaps? Scores Scores: Points pour chaque identité: + 10 points « sequence identity » Pénalités: - 25 points pour chaque « gap »  38 x 10 - 1 x 25 = 355 Scores Scores: Points pour chaque identité: + 10 points « sequence identity » Pénalités: - 25 points pour chaque « gap »  38 x 10 - 1 x 25 = 355 355 % d'acide aminé identiques Pourcentage de séquence identique: Exemple: l'hémoglobine et la myoglobine 38 aminoacides identiques sur une longueur de 147 résidus  25.9 % Exemple 2: Comparaison entre la myoglobine et la leghémoglobine Alignement de séquences de myolgobine et leghemoglobine: Leghémoglobine = hémoprotéine d’une plante alignement correct Comparaison entre la myoglobine et la leghémoglobine: Similitudes des aminoacides Est-ce que les deux aminoacides sont similaires? Comparaison entre la myoglobine et la leghémoglobine: Similitudes des aminoacides = substitution conservatrice isoleucine (I) leucine (L) Comparaison entre la myoglobine et la leghémoglobine: Similitudes des aminoacides = substitution conservatrice isoleucine (I) leucine (L) Quelles sont les substitutions conservatrices? Substitutions conservatrices Valeur zéro ou positive: substitution conservatrice Substitutions conservatrices Valeur zéro ou positive: substitution conservatrice Substitutions conservatrices de l'alanine alanine (A) Substitutions conservatrices de l'alanine 0 1 alanine (A) 0 valine (V) 0 serine (S) cysteine (C) threonine (T) Comparaison entre la myoglobine et la leghemoglobine: Substitutions conservatrices substitutions conservatrices en jaune Comparaison entre la myoglobine et la leghemoglobine: Scores: Scores: - Points pour chaque identité - Pointes pour chaque identité - Pénalités (gaps) - Pénalités (gaps) - Pointes pour chaque similitude alignement correct alignement correct Comparaison entre la myoglobine et la leghemoglobine: Scores: Scores: - Points pour chaque identité - Points pour chaque identité - Pénalités (gaps) - Pénalités (gaps) - Points pour chaque similitude alignement correct alignement correct Constructions d’arbres évolutionnaires basés sur les séquences des protéines Exemple 3: Comparaison entre actin et Hsp-70 protéine du Heat shock protein 70 cytosquelette (chaperone = aide à plier les protéines) 15.6% d'identité entre les séquences Est-ce que ces deux protéines sont des homologues? Comparaison entre actin et Hsp-70 15.6% d'identité entre les séquences Exemple 4: Comparaison entre la chymotrypsine et la subtilisine La chymotrypsine et la subtilisine sont des protéases chymotrypsin subtilisin Les deux protéases peuvent catalyser l' hydrolyse des liaisons polypeptidiques Comparaison entre la chymotrypsine et la subtilisine Les deux protéases ont les mêmes aminoacides dans leur site actif: Ser, His, Asp Est-ce que les deux protéases sont des homologues? Comparaison entre la chymotrypsine et la subtilisine  évolution convergente: solutions communes pour des problèmes biochimiques Evolution convergente une chauve-souris un oiseau Quelques espèces Les pattes de ont développé devant se sont des qualités transformées en ailes. (p.ex. une aile) indépendantes Alignement de séquences de motifs répétitifs dans une seule protéine Alignement de séquences de motifs répétitifs dans une seule protéine TATA-box-binding protein Comment deux régions aussi similaires ont-elles pu se développer dans l’évolution? Leçon 7 Evolution - Charles Darwin - Evidence d’évolution - Mécanisme d’évolution Evolution moléculaire - Evolution des protéines - Arbres phylogénétiques - Comparer DNA et protéines Evolution moléculaire dans une éprouvette L’évolution moléculaire dans une éprouvette Méthode pour générer des protéines ou du DNA avec des qualités désirables L’évolution moléculaire dans une éprouvette Méthode pour générer des protéines ou du DNA avec des qualités désirables Exemple: enzymes utilisés dans la lessive L’évolution moléculaire: trois étapes 1. Génération de la diversité gène d’une protéine à évoluer gènes avec mutations Variation L’évolution moléculaire: trois étapes 1. Génération de la diversité gène d’une protéine à évoluer gènes avec protéines avec mutations mutations Variation L’évolution moléculaire: trois étapes 1. Génération de la diversité gène d’une protéine à évoluer gènes avec protéines avec mutations mutations 2. Sélection de certains membres avec des qualités désirables Selection L’évolution moléculaire: trois étapes 1. Génération de la diversité Variation gènes avec protéines avec mutations mutations 2. Sélection de certains membres avec des qualités désirables L’évolution moléculaire: trois étapes 1. Génération de la diversité gènes avec protéines avec mutations mutations 2. Sélection de certains membres avec des qualités désirables Selection Prix Nobel Le Nobel de chimie en 2018 pour des travaux sur l’évolution en éprouvette Frances H. Arnold, George P. Smith et Gregory P. Winter sont récompensés pour leurs travaux permettant d’accélérer la sélection de molécules et de médicaments inédits. L’évolution moléculaire: deux exemples Exemple 1 Exemple 2 Peptide cyclique pouvant RNA pouvant fixer de l'ATP bloquer une protéase (exemple tiré du livre Stryer) (exemple tiré du labo) L’évolution d’un RNA pouvant fixer de l'ATP 1. Génération de la diversité Des polymères de RNA sont synthétisés par chimie combinatoire: mélange équimolaire de ATP, GTP, CTP, UTP 3 amorces de RNA (en réalité 1012) L’évolution d’un RNA pouvant fixer de l'ATP 1. Génération de la diversité Des polymères de RNA sont synthétisés par chimie combinatoire: mélange équimolaire de ATP, GTP, CTP, UTP 3 amorces de RNA (en réalité 1012) L’évolution d’un RNA pouvant fixer de l'ATP 1. Génération de la diversité Des polymères de RNA sont synthétisés par chimie combinatoire: séquences de 120 nucléotides aléatoires L’évolution d’un RNA pouvant fixer de l'ATP 2. Sélection de certains membres avec des qualités désirables Chromatographie par affinité (de l'ATP est immobilisé) L’évolution d’un RNA pouvant fixer de l'ATP L’évolution d’un RNA pouvant fixer de l'ATP 3. Reproduction afin d'enrichir la population avec les bonnes qualités Reproduction par PCR Une structure secondaire conservée a été détectée dans les clones sélectionnés L’évolution moléculaire: deux exemples Exemple 1 Exemple 2 Peptide cyclique pouvant RNA pouvant fixer de l'ATP bloquer une protéase (exemple tiré du livre Stryer) (exemple tiré du labo) Développement de molécules thérapeutiques par évolution moléculaire une tumeur migration des cellules cancéreuses formation de métastases Développement de molécules thérapeutiques par évolution moléculaire une tumeur migration des cellules cancéreuses formation de Urokinase métastases (= protéase) L'urokinase peut dégrader la structure autour des cellules et faciliter ainsi la migration des cellules cancéreuses. Développement de molécules thérapeutiques par évolution moléculaire Urokinase (= protéase) Il n’existe pas encore d'inhibiteur spécifique pour l'urokinase. Peptides bi-cycliques 114 Synthèse de peptides bi-cycliques Synthèse de peptides bi-cycliques cys cys cys Synthèse de peptides bi-cycliques 1. Génération de la diversité 3 peptides bi-cycliques (en réalité 4x109) Sélection de peptides bi-cycliques 2. Sélection de certains membres avec des qualités désirables 4x109 peptides bi-cycliques différents Sequences de peptides bi-cycliques activité: IC50 (nM) Leçon 7 Evolution - Charles Darwin - Evidence d’évolution - Mécanisme d’évolution Evolution moléculaire - Evolution des protéines - Arbres phylogénétiques - Comparer DNA et protéines Evolution moléculaire dans une éprouvette Série 6 Question 1 Brins de DNA Brin matrice de DNA mRNA Brin codant de DNA mRNA (=messanger RNA) Brin matrice de DNA Brin codant de DNA La transcription commence près des sites promoteurs position relative au 5’ terminus du mRNA - 35 - 10 1 premier nucléotide Brin matrice de DNA Brin codant de DNA site promoteur RNA polymérase ence La transcription commence près des sites promoteurs Brin codant de DNA 5’ 3’ région de -35 Pribnow box TTGACA TATAAT Séquence de sites de terminaison épingle à cheveux (dans la séquence de mRNA) Traduction traduction Séquence de Shine-Dalgarno Premier aminoacide chez les procaryotes: fMet Signal d’initiation: région avec plusieurs bases de purine (Shine-Dalgarno) Série 6 Question 2 Reading frame: 3 possibilités Reading frame: 3 possibilités Phe – Ser – Asp – Leu - Glu - … Ser – Arg – Thr – Trp – Arg - … Leu – Gly – Pro – Gly - Asp - … Reading frames ATGGACGTATAGATGACAGGTAGATGTTTC AGGGGGATTTATCGATAG http://www.expasy.ch/tools/dna.html Reading frames ATGGACGTATAGATGACAGGTAGATGTTTC AGGGGGATTTATCGATAG http://www.expasy.ch/tools/dna.html Reading frames ATGGACGTATAGATGACAGGTAGATGTTTC AGGGGGATTTATCGATAG http://www.expasy.ch/tools/dna.html Série 6 Question 3 Structure chimique de RNA Le ribose C3’ C5’ Les bases de DNA et RNA RNA peut être décomposé et est moins stable que DNA Structure de RNA Série 6 Question 4 Cours Biochimie I Leçon 8: Fonction des protéines: hémoglobine et anticorps Christian Heinis [email protected], BCH 5305 Leçon 8 Hémoglobine (et myoglobine) - Structure - Fixation d’oxygène et interactions coopératives - Mécanismes moléculaires pour la régulation de hémoglobine - Mutations dans l'hémoglobine Anticorps - Fixation d’antigène - Structure - Régions variables Hémoglobine et myoglobine L'hémoglobine et la myoglobine sont des protéines qui fixent l’oxygène L'oxygène est nécessaire pour la production d’énergie (la dégradation du glucose produit 15-fois plus d’énergie en présence d'oxygène) Hémoglobine (transport de O2) Myoglobine (stockage de O2) Structure de l'hémoglobine et de la myoglobine L'hémoglobine (beta subunit) et la myoglobine ont la même structure Une seule chaîne polypeptidique, formant des hélices alpha La myoglobine est la première protéine où la structure tridimensionelle a été déterminée (John Kendrew, 1950) Le hème (groupement prosthétique) Composant organique: protoporphyrine (4 cycles pyrroliques formant un noyau tétrapyrrolique) Atome de fer au centre lié aux quatre atomes d’azote (l’état d’oxydation du fer: 2+) L'hémoglobine est trouvée dans les globules rouges L'hème donne au sang (globule rouge) sa couleur rouge. Pourquoi est-ce que le groupe hème est nécessaire? L’atome de fer peut former deux liaisons supplémentaires L’atome de fer peut former deux liaisons supplémentaires Histidine proximale La sixième position est disponible pour la fixation de l’oxygène Vue latérale Pourquoi est-ce que l'hémoglobine ne peut pas fixer directement l'oxygène (sans le hème)? Fixation d'oxygène Fixation d'oxygène Aucun des 20 aminoacides ne peut lier des molécules d'oxygène  La protéine a besoin d'un groupement prosthétique Groupements prosthétiques = molécule non-peptidique qui est liée au protéine et est nécessaire pour la fonction de la protéine Nitroreductase avec le groupe Photolyase avec le groupe prosthétique prosthétique ‘flavin-adenin- ‘riboflavin’ dinucleotide’ La liaison fer-oxygène peut être vue comme une structure de résonance (Fe2+ - dioxygène et Fe3+ - superoxyde) ion superoxyde Le ion superoxyde et une espèce réactive qui peut endommager beaucoup de matériaux biologiques La liaison fer-oxygène peut être vue comme une structure de résonance (Fe2+ - dioxygène et Fe3+ - superoxyde) ion superoxyde Comment est-ce que l' Le ion superoxyde et une hémoglobine peut empêcher espèce réactive qui peut endommager beaucoup la libération de matériaux biologiques des ions superoxydes? La structure de la myoglobine empêche la libération d’espèces réactives avec l’oxygène Une histidine supplémentaire aide à stabiliser l’oxyhémoglobine (par une H-liaison) hème L'oxygène en état 'superoxyde' ne peut pas se dissocier

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