Partie 2: Techniques chromatographiques Cours AMQ7-1 PDF

Partie 2: Techniques chromatographiques Partie 2: Techniques chromatographiques 1- Principes de Base et Théorie 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG) 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC) 2  1- Principes de Base et Théorie...

Partie 2: Techniques chromatographiques Partie 2: Techniques chromatographiques 1- Principes de Base et Théorie 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG) 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC) 2  1- Principes de Base et Théorie  Définition La chromatographie est une méthode de séparation et d'analyse des composants d'un mélange, basée sur leur distribution différentielle entre une phase stationnaire (solide ou liquide fixe) et une phase mobile (liquide ou gaz). Chromatographie sur colonne 3  1- Principes de Base et Théorie  Chromatographie sur colonne La chromatographie, dans ses débuts, utilisait des colonnes en verre où un échantillon était d'abord placé dans une colonne en verre (exemple: séparation des pigments végétaux), suivie de l'ajout d'un éluant (la phase mobile) qui traversait une phase stationnaire solide ou en gel (silice, alumine, gel de silice) dans la colonne. La séparation des constituants de l'échantillon se produisait grâce à leurs interactions variées avec la phase stationnaire, sous l'influence de la gravité. Chromatographie sur colonne 4  1- Principes de Base et Théorie  Chromatographie haute pression Pour améliorer l'efficacité et le débit de séparation, des méthodes utilisant une pression plus élevée ont été introduites, aboutissant à la Chromatographie Liquide PC pour l'acquisition Haute Performance (HPLC), caractérisée par l'emploi de de données colonnes plus petites et l'application de hautes pressions, Colonne HPLC permettant une séparation plus rapide et plus précise. Injecteur Solvant Pompe Détecteur Déchets Colonnes HPLC 5 1- Principes de Base et Théorie  Historique Début de la Chromatographie (1903): Mikhail Tsvet a initié la chromatographie sur colonne pour séparer les pigments végétaux. Développement de la Chromatographie de Partage (Milieu du 20e siècle): Martin et Synge ont développé cette technique, base de l'HPLC et de la GC. Invention de la Chromatographie Gazeuse: Par Anthony T. James et Archer J.P. Martin, utilisant la chromatographie de partage. Premier Chromatographe en Phase Gazeuse (1947): Développé par Erika Cremer et Fritz Prior, utilisant un gaz porteur et une colonne de gel de silice. Évolution des Colonnes de GC: Passage de colonnes remplies à des colonnes capillaires pour une meilleure résolution. Amélioration Continue: Les techniques et matériaux des colonnes ont constamment évolué, des premières colonnes en verre aux colonnes capillaires modernes. 6  1- Principes de Base et Théorie La bande d'échantillon  Terminologie injecté (apparaît comme "Noir") (mélange du Bleu, Rouge et Jaune) Phase Stationnaire (PS) : Matériau solide ou liquide sur lequel les composants du mélange sont adsorbés ou retenus. Temps zéro Phase mobile Phase Mobile (PM) : Liquide ou gaz qui traverse la phase stationnaire Bandes d'analytes séparés et entraîne les composants du mélange. Temps +10 minutes Phase mobile Colonne Chromatographique : Tube contenant la phase stationnaire, à travers lequel passe la phase mobile. Élution : Processus de passage de la phase mobile à travers la colonne, entraînant avec elle les composants séparés. Éluant : Solvant ou mélange de solvants composant la phase mobile. 7  1- Principes de Base et Théorie  Terminologie Chromatogramme : Graphique représentant la concentration des composants élués en fonction du temps ou du volume de phase mobile passée à travers la colonne. Pic Chromatographique : Représentation graphique de la détection d'un composé lorsqu'il est élué de la colonne (la variation de la concentration en sortie de colonne en fonction du temps). 8  1- Principes de Base et Théorie  Terminologie Temps de Rétention (tR) : Temps écoulé entre l'injection de l'échantillon et l'apparition d'un pic sur le chromatogramme. Temps mort (tM) : Temps pris par la phase mobile pour traverser la colonne. Un constituant non retenu sort de la colonne au temps tM. Facteur de capacité ou de Rétention (k') : Utilisé pour décrire le taux de migration de l'analyte dans une colonne. Le facteur de rétention pour l'analyte A est défini comme : k'A = tR - tM / tM k' 1 → Elution est si rapide qu'une détermination précise du temps de rétention est très difficile k' élevés (supérieurs à 20) → Elution prend beaucoup de temps 1  k ' 10 → L’idéal Facteur de sélectivité α: Décrit la séparation de deux espèces (A et B) sur la colonne (Capacité de la phase stationnaire à préférer un composé par rapport à un autre) : α = k'B / k'A Lors du calcul du facteur de sélectivité, l'espèce A s'élue plus rapidement que l'espèce B. Le facteur de sélectivité est toujours supérieur à un. tM tR A tR B 9  1- Principes de Base et Théorie Wh  Terminologie Facteur de résolution: Permet de définir la qualité de la séparation Temps (min) Wb de deux pics consécutifs sur un chromatogramme. tM : temps mort tR : temps de rétention (d'élution) d'un composé Wb : largeur du pic à la base (ω) Wh : largeur du pic à mi-hauteur (δ) R doit être supérieur à 1,5 https://www.youtube.com/watch?v=o-GYFTD8F1M&list=PLmRpOX9aPBrLcKidp3cy4D29w5RTnkde4&index=5 10  1- Principes de Base et Théorie Molécules de soluté  Terminologie PS PM Efficacité de la Colonne : Déterminée par le nombre de plateaux théoriques (N) requis pour permettre l'élution totale de la quantité initiale de soluté. Cette efficacité est souvent exprimée en termes de Colonne Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique (H). Selon la théorie des plateaux, une colonne chromatographique est composée d'une série de couches horizontales appelées "plateaux théoriques". Détecteur Les molécules de soluté sont équilibrées entre la phase stationnaire N = L/H et la phase mobile à chacun de ces plateaux. N: nombre de plateaux théoriques: 100-106 On considère ensuite que la migration du soluté se fait par une série L: longueur de la colonne de transferts étape par étape d'un plateau au plateau H: Hauteur Equivalente à un Plateau immédiatement inférieur. Théorique (HEPT): 1cm - 10 µm 11  1- Principes de Base et Théorie  Terminologie Efficacité de la Colonne : Une colonne sera d’autant plus efficace que N est grand et H est petit. H = L/N Minimisation de H (Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique) : 1. Réduction du Diamètre des Particules du Support : En chromatographie, utiliser des particules de support plus petites peut effectivement réduire H, améliorant ainsi l'efficacité de la colonne. 2. Modification de la Température en CPG : En chromatographie en phase gazeuse, la température joue un rôle clé. Cependant, la relation entre la température et H n'est pas directe; l'effet de la température dépend des caractéristiques spécifiques de l'analyte et de la phase stationnaire. 3. Réduction de l’Épaisseur du Film Liquide en HPLC : En chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC), réduire l'épaisseur du film de la phase stationnaire liquide peut diminuer H et augmenter la résolution. 4. Optimisation de la Vitesse d'Écoulement de la Phase Mobile : Ajuster la vitesse d'écoulement de la phase mobile est une autre méthode pour optimiser la performance de la colonne chromatographique. Une vitesse trop rapide ou trop lente peut affecter la résolution et l'efficacité de la séparation. 12 https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=-O2C6B1ghIA  1- Principes de Base et Théorie  Terminologie Efficacité de la Colonne : N = L/H https://www.youtube.com/watch?v=_ZPgkLQPuKI https://www.youtube.com/watch?v=vFENzNj6Jq4&list=PLmRpOX9aPBrLc 13 Kidp3cy4D29w5RTnkde4&index=4  1- Principes de Base et Théorie  Classification des méthodes chromatographiques Classification selon la nature de la phase mobile (PM): 1- Chromatographie en phase liquide (CL) : Phase mobile est un LIQUIDE Chromatographie liquide-solide ou d’adsorption (CLS): La phase stationnaire est solide (poreuse avec de petites particules) tenue dans une colonne ou étalée sur une plaque. Chromatographie liquide-liquide ou de partage (CLL): La phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un support solide inerte : soit imprégnée dans un solide poreux (risques de lessivage), soit greffée sur le solide par des liaisons covalentes (la seule utilisée). 2- Chromatographie en phase gazeuse (CG) : Phase mobile est un GAZ Chromatographie gaz-solide ou d’adsorption (CGS): La phase stationnaire est formée de particules solides. Chromatographie gaz-liquide ou de partage (CGL): La phase stationnaire est un liquide maintenu comme une couche mince sur un support solide poreux. 14  1- Principes de Base et Théorie  Classification des méthodes chromatographiques Classification selon le mécanisme de séparation chromatographique (attachement à la PS): Chromatographie par adsorption: Chromatographie de partage: Séparation basée sur l'adsorption des Séparation basée sur le partage des produits chimiques à la surface d'un produits chimiques dans une couche support. de la phase stationnaire. Chromatographie d'échange d'ions: Chromatographie d'exclusion de taille: Séparation des ions basée sur leur Séparation des produits chimiques basée liaison aux charges fixes sur un sur leur taille et leur capacité à entrer support. dans un support poreux. 15  1- Principes de Base et Théorie  La chromatographie de partage La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon. En HPLC: - Le principe de la chromatographie de partage en HPLC implique l'équilibre de partage d'un soluté (analyte) entre la phase mobile et la phase stationnaire. La rétention du soluté est déterminée par son degré de passage entre ces deux phases. L'efficacité de la séparation est basée sur le coefficient de distribution ou de partage K des solutés entre la phase stationnaire et la phase mobile. 16  1- Principes de Base et Théorie  La chromatographie de partage La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon. En HPLC: - La phase stationnaire est un film liquide déposée sur la surface d’un support solide, généralement des particules de silice poreuses. Pour éviter la Soluté dissous dans la solubilité partielle de la phase stationnaire dans la phase liquide déposée phase mobile, elle est liée de manière covalente sur la surface du aux particules de silice (phase greffée). support solide On distingue deux types: phase normale et phase inverse 17  1- Principes de Base et Théorie  La chromatographie de partage La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon. Gel de silice greffée En HPLC: - La phase normale Cyanopropyl Gel de silice greffée: on utilise des phases stationnaires polaires : phases greffées (aminopropyl plus polaire que cyanopropyl) et des Phases phases mobiles apolaires pour séparer des composés polaires polaires et moyennement polaires. Aminopropyl normale 18  1- Principes de Base et Théorie  La chromatographie de partage La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon. En HPLC: - La phase normale On utilise en général un mélange de solvants: solvant apolaire (hexane, heptane…) + un solvant peu polaire (dichlorométhane, trichlorométhane …) appelé modificateur polaire (MP). Lorsque la polarité du mélange augmente, la force éluante augmente et le facteur de capacité (k’) diminue; Plus le soluté est polaire, plus son tR et son k’ sont élevés. Les solutés moins polaires sont élués en premier. Pouvoir d’élution de la phase mobile en HPLC 19  1- Principes de Base et Théorie  La chromatographie de partage La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon. En HPLC: Gel de silice greffée - La phase inverse La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et C18 Phase à nécessite donc un éluant polaire (acétonitrile: ACN, méthanol: MeOH, H2O). Dans ce cas, ce sont les polarité composés polaires qui seront élués en premier. inversée Les solutés plus polaires sont élués en premier. 20  1- Principes de Base et Théorie  La chromatographie de partage La chromatographie de partage est fondamentale tant en HPLC qu'en CG, avec des mécanismes spécifiques à chaque technique pour optimiser la séparation des composants d'un échantillon. En CG: - Dans la CG, la phase mobile est un gaz (comme l'hélium) et la phase stationnaire est un liquide à point d'ébullition élevé greffée sur un solide. La vitesse de déplacement d'un composé dépend de son temps passé dans la phase gazeuse par rapport à son temps attaché à la phase liquide. - Le processus de partage se produit lorsqu'une substance se répartit entre deux solvants non miscibles. Dans la CG, une molécule passe une partie de son temps dissoute dans la phase liquide et une autre partie transportée avec le gaz. - Le temps de rétention d'un composé dans la colonne jusqu'au détecteur varie selon son point d'ébullition, sa solubilité dans la phase liquide, et la température de la colonne. Les composés à point d'ébullition élevé et solubilité élevée dans la phase liquide ont des temps de rétention plus longs​​. 21  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Le principe de la chromatographie en phase gazeuse (CPG) implique la vaporisation de l'échantillon, qui est ensuite injecté au sommet de la colonne chromatographique. L'élution, ou séparation des composants de l'échantillon, est réalisée grâce à un courant de gaz inerte, connu sous le nom de gaz vecteur, qui constitue la phase mobile. Ce gaz permet le transport de l'échantillon à travers la colonne sans aucune interaction avec les analytes, facilitant ainsi une séparation basée sur la répartition différentielle des composants entre une phase stationnaire et la phase mobile gazeuse. 22  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Alimentation en Gaz Vecteur Utilisation de gaz inertes : Hélium (He), Azote (N₂), Hydrogène (H₂), Argon (Ar) Pureté du gaz : Exempt de H₂O et O₂, séchage par tamis moléculaire Régulation du débit : - Colonnes remplies : 25 à 100 mL/min - Colonnes capillaires : 0,5 à 5 mL/min 23  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation fuite de gaz à Injection de l'Échantillon septum travers le septum Microseringue : 1µL à 10µL insert gaz vecteur Injection à travers un septum dans une bloc chambre de vaporisation équipée d'un insert, insert chauffant située à l'extrémité de la colonne. fuite de gaz de split (division) Température de l'injecteur : doit être réglée pour permettre la vaporisation de l'échantillon sans le décomposer, idéalement environ 50°C ferrule pour colonne colonne au-dessus du point d'ébullition de son capillaire capillaire composant le moins volatil. Mélange gaz vecteur/échantillon 24  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation fuite de gaz à Injection de l'Échantillon septum travers le septum Insert d'Injecteur : insert gaz vecteur Un insert est un récipient fin en verre placé dans la chambre de vaporisation bloc de l'injecteur. insert chauffant Il sert à concentrer l'échantillon et à le fuite de gaz de guider avec précision dans la colonne. laine de split (division) Laine de Verre : verre Un petit morceau de laine de verre est souvent placé dans l'insert. ferrule pour Elle agit comme un filtre pour empêcher colonne colonne capillaire capillaire les particules solides de l'échantillon ou d'autres contaminants d'entrer dans la colonne chromatographique. Mélange gaz vecteur/échantillon 25  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation fuite de gaz à Injection de l'Échantillon septum travers le septum Spécificités de l'Injection selon le Type de gaz vecteur Colonne bloc Colonnes remplies (les plus anciennes): insert chauffant Injection directe de 0,1 à 0,5 µL de fuite de gaz de solution de l'échantillon dans un injecteur split (division) “classique”, à vaporisation directe ferrule pour colonne colonne capillaire capillaire Colonnes capillaires (faibles débits): Injecteur avec ou sans division Mélange gaz (split/splitless) vecteur/échantillon 26  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG) Ce flux contrôlé est conçu  Instrumentation pour maintenir la pression à l'intérieur de l'injecteur à des fuite de gaz à niveaux appropriés et pour Injection de l'Échantillon septum éviter toute surpression qui travers le septum Mode Split pourrait survenir lors de l'injection de l'échantillon. Utilisé pour les échantillons concentrés gaz vecteur Seule une fraction de l'échantillon est introduite dans la bloc colonne chauffant Évacuation d'une grande partie du mélange par la vanne insert de split fuite de gaz de Avantages : Empêche la surcharge de la colonne et split (division) améliore la séparation des composants Mode Splitless ferrule pour Utilisé pour les échantillons à faible concentration colonne colonne L'intégralité de l'échantillon est injectée dans la colonne capillaire capillaire Vanne de purge activée après une période définie pour éliminer les excès de solvant Mélange gaz Avantages: Augmente la sensibilité pour les composants à vecteur/échantillon faibles concentrations 27  Colonnes 2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG) capillaires  Instrumentation Colonne et four La colonne chromatographique est placée à l'intérieur d'une enceinte thermostatée (Four), capable de réguler la température entre 20 et 450 °C, avec une fonctionnalité permettant la programmation de la température. Colonnes capillaires Matériau et Construction: La majorité des colonnes modernes sont en silice fondue (très pure) souvent recouvertes d'une gaine extérieure en polyamide pour offrir une résistance thermique à haute température. Caractéristiques Physiques: Diamètre Intérieur: Varie de 0,1 à 0,35 mm, ce qui est très fin et permet une grande interaction entre l'échantillon et la phase stationnaire. Longueur: Peut varier de 10 à 100 mètres, mais 25 mètres est une longueur commune. La colonne est enroulée en spirales d'environ 15 cm de diamètre pour s'adapter à l'espace de l'instrument. Épaisseur du Film de Phase Stationnaire: Varie de 0,05 à 5 µm, ce qui influence la séparation des composants en fonction de leur solubilité dans la phase stationnaire. 28  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Colonne et four Colonnes capillaires La phase stationnaire: Polysiloxanes comme Phase Stationnaire - Structure de base: Chaîne de siloxane (R-Si-O) - Exemple commun (R = Me) : Polydiméthylsiloxane (apolaire) - Substitution pour augmenter la polarité: Groupes phényle à différents pourcentages (5%, 50%, etc.) Trifluoropropyle (C3H6CF3) Cyanopropyle (C3H6CN) Polyéthylène Glycol (PEG) pour Polarité Élevée - Structure chimique: Répétition de groupes d'éthylène glycol (HO-CH2-CH2-O) - Nom commercial: Carbowax® - Utilisation: Séparation des composés polaires 29  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Colonne et four Colonne utilisée pour l'analyse du limonène dans l'huile essentielle de citron Le 5% Phényl-polyméthylsiloxane est une phase stationnaire semi-polaire utilisée en chromatographie en phase gazeuse. Elle contient un groupe phényle qui lui confère des propriétés de sélectivité pour les composés polaires en raison de l'interaction π-π entre le groupe phényle de la phase stationnaire et les composés aromatiques ou les doubles liaisons conjuguées de l'échantillon. Cependant, puisqu'elle n'est pas entièrement faite de groupes phényl (seulement 5%), elle conserve une bonne part de caractère non polaire due au polyméthylsiloxane, ce qui lui permet de séparer également des composés non polaires. Cette combinaison permet à la phase de séparer un large éventail de composés avec différents degrés de polarité. C'est une phase couramment utilisée dans de nombreux laboratoires pour la CPG. 30 Le limonène est un hydrocarbure monocyclique avec la Solvant: formule C10H16. Principalement extrait des zestes hexane d'agrumes, ce composé est renommé pour son parfum caractéristique d'agrumes et est largement utilisé dans l'industrie des parfums, des produits de nettoyage, des cosmétiques et de l'alimentation. Il est également étudié pour ses propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires et thérapeutiques potentielles. Même temps de rétention Echantillon: l’huile Etalon: limonène Limonène essentielle dans l’huile de citron essentielle de citron 31  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Les facteurs influençant la séparation en chromatographie en phase gazeuse (CPG) : Température : Si les constituants du mélange à séparer ont des polarités voisines, les composés les plus volatils sont les plus rapidement entraînés. Une température trop basse ralentit les échanges entre la phase stationnaire et le gaz vecteur, conduisant à des pics déformés ou dissymétriques. Une température trop élevée empêche l'équilibre entre les phases, résultant en une élution simultanée des constituants. Une température variable (gradient de température) est souvent utilisée pour les mélanges avec de grands écarts de points d'ébullition. Débit du gaz vecteur : Ce débit doit permettre un équilibrage entre les phases mobile et stationnaire. Un débit trop rapide nuit à la séparation, tandis qu'un débit trop lent entraîne une perte de finesse des pics. Un débit optimisé, combiné à une température appropriée, améliore la finesse des pics. Longueur de la colonne : Une colonne plus longue améliore l'efficacité de la séparation mais peut réduire la finesse des pics et nécessite une pression de gaz vecteur plus élevée. Nature de la phase stationnaire : La phase stationnaire doit être chimiquement inerte et utilisée dans ses limites de température. Des phases stationnaires de différentes polarités sont choisies en fonction de la nature des composés à séparer. Des phases polaires retiennent mieux les substances polaires, et inversement pour les phases apolaires. La règle générale est que les structures de polarités similaires ont de meilleures affinités entre elles. 32  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Détecteur à ionisation de flamme (FID) Principe de Base : Le FID détecte les composés organiques en mesurant les ions produits lors de la combustion de ces composés dans une flamme. Ce détecteur est particulièrement sensible aux substances contenant des atomes de carbone (à l'exception du dioxyde de carbone). 33  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Détecteur à ionisation de flamme (FID) Processus de Détection : Échantillonnage : L'échantillon élué de la colonne de CPG est introduit dans la flamme du FID. Combustion : La flamme est généralement produite par un mélange d'hydrogène et d'air. Lorsque les composés organiques passent dans cette flamme, ils sont rapidement brûlés (oxydés). Ionisation : La combustion des composés organiques produit des ions et des électrons. Ces particules chargées sont ce que le FID détecte. La quantité d'ions générée est proportionnelle à la quantité de composé organique. Détection et Mesure : Un collecteur (généralement une tige métallique) placé près de la flamme capte les ions produits. Un courant électrique est généré en raison du mouvement des ions vers le collecteur. Ce courant est proportionnel à la quantité de composé organique brûlé. Le signal électrique est amplifié et enregistré. Le pic dans le chromatogramme correspond à la concentration du composé dans l'échantillon. 34 https://www.youtube.com/watch?v=PV4NYBUaUrQ  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Détecteur à ionisation de flamme (FID) Avantages : - Plage linéaire étendue : Convient pour une large gamme de concentrations (jusqu'à 7 ordres de grandeur). - Sensibilité aux composés organiques : Excellente détection des hydrocarbures et composés contenant du carbone. - Robustesse et fiabilité : Facile à utiliser, peu d'entretien nécessaire. - Insensibilité à l'eau et aux gaz inorganiques : Pas de perturbations dues à H₂O ou O₂. - Polyvalence : Utilisable pour presque tous les composés organiques. Inconvénients : - Non sélectif : Pas adapté pour des analyses ciblées (azote, halogènes, etc.). - Insensibilité aux composés non carbonés : Ne détecte pas les composés inorganiques ou non combustibles. 35  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Détecteur à capture d’électrons (ECD) Principe de Base : Il s’agit d’un détecteur considéré comme sélectif car il est beaucoup plus sensible aux dérivés halocarbonés. Un courant d’azote, ionisé par un flux d’électrons généré au moyen d’une source radioactive β− de faible énergie, circule entre deux électrodes soumises à une ddp d’une centaine de volts, de telle sorte qu’il s’établit, au repos, un courant de base I0 dû essentiellement aux électrons libres, très mobiles. Si des molécules M, contenant un halogène (F, Cl ou Br), traversent la zone entre les deux électrodes, elles captent une partie des électrons thermiques pour former des ions négatifs lourds, donc moins mobiles. Avantages : - Excellentes limites de détection : Meilleures que celles du détecteur à ionisation de flamme (FID). - Sélectivité : Très sélectif pour les composés halocarbonés. Inconvénients : - Plage linéaire limitée :La réponse du détecteur est linéaire seulement sur 2 ordres de grandeur (facteur 100). - Interférences possibles avec H₂O et O₂ :L'eau (H₂O) et l'oxygène (O₂) peuvent capturer des électrons, ce qui perturbe le signal. Les échantillons et les phases mobiles doivent donc être extrêmement purs pour éviter ces interférences. - Problèmes liés à l'utilisation de solvants chlorés lors de la préparation d'échantillons (extraction) : Les solvants chlorés, comme le dichlorométhane (CH₂Cl₂), peuvent interférer fortement avec la détection. Cela est dû à leur forte capacité à capturer des électrons, ce qui génère des signaux parasites. 36 https://www.youtube.com/watch?v=cqAPpiytGAg  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Détecteur thermoionique (NPD) Principe de Base : Ce détecteur est très sensible aux composés azotés (N) ou phosphorés (P). Il utilise une source d’ionisation chauffée, souvent un filament contenant un métal alcalin (généralement du rubidium ou du césium). Lorsqu'un composé contenant de l'azote ou du phosphore passe dans le détecteur, ces atomes interagissent avec la source d'ionisation. Cette interaction libère des électrons, qui sont capturés pour générer un signal électrique proportionnel à la concentration du composé. Avantages : - Spécificité : Très sensible aux composés contenant de l’azote et du phosphore. - Limite de détection faible : Peut détecter des concentrations très faibles. - Utilisation fréquente : Idéal pour les analyses de pesticides, de médicaments ou d'autres composés organiques spécifiques. Inconvénients : - Le NPD a un domaine de réponse linéaire plus étroit par rapport à d'autres détecteurs comme le FID. Cela peut compliquer l'analyse de composés dans des échantillons présentant des concentrations très différentes. - Entretien : La source d’ionisation nécessite un entretien régulier (remplacement du filament). 37 https://www.youtube.com/watch?v=ddyjZmBAO2c  2- Chromatographie en phase gazeuse (CPG ou CG)  Instrumentation Détecteurs Make-up gaz: Par nature, ces trois détecteurs (FID, NPD, ECD) doivent être alimentés avec un débit gazeux de 20 mL/min au minimum, bien supérieur au débit réel des colonnes capillaires, pour donner une réponse correcte et augmenter leur sensibilité. Ce débit est atteint en mélangeant en sortie de colonne un gaz d’appoint, identique ou différent (tel le diazote) de celui qui sert de phase mobile. Cette opération est désignée par le terme make-up. 38  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) est une méthode chromatographique qui utilise un liquide comme phase mobile. Elle est largement applicable dans de nombreux domaines, y compris ceux couverts par la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG), et est particulièrement utile pour l'analyse de composés qui sont soit thermosensibles, soit de grande masse moléculaire, y compris ceux qui sont polaires. Un des principaux avantages de la HPLC réside dans sa capacité à offrir une sélectivité très précise dans la séparation des composés. Cette sélectivité est obtenue grâce à la possibilité de choisir soigneusement la colonne chromatographique et la composition de l'éluant utilisé dans le processus. 39 https://www.youtube.com/watch?v=eCj0cRtJvJg 3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation 40  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Réservoirs de la phase mobile Les contenants de la phase mobile sont des réservoirs qui contiennent la phase mobile utilisée dans le processus chromatographique. Ces réservoirs sont généralement fabriqués en verre et ont une capacité variant de 200 à 1000 millilitres. 41  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Dégazeur L’objectif du dégazeur est d'éliminer les gaz dissous, tels que l'oxygène O2 et l'azote N2, de la phase mobile avant qu'elle n'entre dans la colonne chromatographique. En éliminant les gaz, le dégazeur contribue à maintenir un flux constant et sans interruption de la phase mobile, assurant ainsi une séparation plus précise et fiable des composés dans l'échantillon. 42  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Pompe Dans l’HPLC, la pompe joue un rôle essentiel en assurant un débit constant et précis de la phase mobile, tout en gérant les hautes pressions nécessaires pour son passage à travers la colonne remplie. Elle opère en deux modes principaux : le mode isocratique, où la composition de la phase mobile reste invariable, adapté pour des analytes nécessitant un solvant constant, et le mode gradient, où la composition de la phase mobile varie au cours de l'analyse, permettant une séparation optimale pour des échantillons plus complexes. Cette capacité de la pompe à fournir un débit précis et à gérer efficacement différents profils de solvants est cruciale pour la fiabilité et la précision des analyses en HPLC. 43  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Injecteur automatique L'injecteur automatique en HPLC, grâce à ses composants tels que l'aiguille et le piston de la seringue, le réservoir de lavage, la vanne d'injection et le passeur automatique, permet une injection précise et reproductible des échantillons, essentielle pour des analyses chromatographiques fiables et efficaces. 44  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Injecteur automatique  L'aiguille et le piston de la seringue Le piston de la seringue, en coordination avec l'aiguille, remplit deux fonctions clés dans l'injecteur automatique d'un système HPLC : il aspire d'abord l'échantillon en créant un vide, puis le pousse à travers l'aiguille pour l'injection. Ce processus d'aspiration et d'injection précis est crucial pour garantir la fiabilité et la précision des analyses chromatographiques en HPLC. piston Aiguille 45  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Injecteur automatique  Réservoir de Lavage de la Seringue : Ce compartiment est rempli d'un solvant spécifique (Eau ultra-pure + 10% méthanol) destiné au nettoyage de l'aiguille et du piston de la seringue après chaque injection. Cette étape de nettoyage est essentielle pour prévenir toute contamination entre différents échantillons. Réservoir de Lavage de la Seringue 46  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC) PM de la pompe  Instrumentation (position 1) Boucle Injecteur automatique (positions 2 et 5)  Vanne d'injection : La vanne d'injection, munie d'un levier, alterne entre les modes de chargement et 2 1 d'injection et intègre une boucle offrant un 3 large choix de volumes selon les exigences 6 analytiques. L'échantillon est chargé dans la 4 5 boucle en mode chargement, puis le levier est activé pour changer le sens de circulation vers le mode d'injection, dirigeant ainsi l'échantillon vers la colonne. La capacité de choisir parmi différents volumes de boucle, combinée à la précision de la vanne, garantit une manipulation précise et adaptable des Lié à la PM vers la échantillons, essentielle pour la qualité et la seringue colonne fiabilité des analyses en HPLC. (position 4) (position 6) Effluent ou poubelle Vanne 47 (position 3) PM: phase mobile d'injection  Boucle 20 μL Levier Dans la position chargement, où Dans la position injection, seule la communication entre pompe l’échantillon est inséré dans le flux de et colonne est assurée (16), phase mobile (1256) par rotation l’échantillon est introduit à pression de 60° d’un levier qui permet d’inverser atmosphérique (4523) à l’aide le sens de circulation dans la boucle. d’une seringue dans un petit volume tubulaire appelé boucle, dont il existe tout un choix de volumes. Boucles (différents volumes) 48  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Colonne thermostatée La colonne est généralement placée dans un four ou une chambre thermostatée qui permet de régler la température souhaitée. Dans certaines analyses, il peut être nécessaire de chauffer ou de refroidir la colonne par rapport à la température ambiante pour obtenir des conditions de séparation optimales. (Voir des exemples de colonnes utilisées en HPLC: diapos 15,16,17,18,19) 49  3- Chromatographie en phase liquide (HPLC)  Instrumentation Dérecteur En HPLC, les détecteurs d’absorption UV-Visible sont fréquemment employés. Ils se divisent en trois types principaux : Détecteurs à longueur d'onde fixe, souvent réglés à 254 nm. Détecteurs à longueurs d'ondes variables, avec une plage de 200 à 700 nm, permettant le choix d'une longueur d'onde spécifique. Détecteurs à barrette de diodes (DAD), capables d'analyser Détecteur à l'ensemble du spectre de manière simultanée.(voir le cours de barrette de spectroscopie UV-visible) diodes 50  Identification de l’acide caféique dans un extrait phénolique de margine (colonne utilisée C18, mode gradient (mélange acétonitrile/eau), détecteur à barrette de diodes. CAFEICACID-19-04 #6251 RT: 20.84 AV: 1 NL: 8.52E5 microAU RT: 0.00 - 60.00 20.80 NL: 323.00 550000 Acide caféique 5.54E5 nm=230.1- 100 231.1 95 500000 PDA CAFEICAC 90 ID-19-04 85 450000 400000 Spectre UV du 80 75 217.00 350000 composé qui sort à 70 65 Chromatogramme 20,8 min 60 238.00 Relative Absorbance 300000 55 de l’étalon: acide 250000 50 uAU 45 200000 caféique 40 150000 35 100000 (détecteur DAD) 30 25 20 50000 0.21 15 43.76 47.23 57.17 59.41 0 10 5 -50000 0 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 wavelength (nm) -100000 0 5 10 15 20 25 30 Time (min) 35 40 45 50 55 60 Même Même temps de RT: 0.00 - 60.00 testPHEN-23 #6222 RT: 20.74 AV: 1 NL: 1.12E5 microAU spectre 340000 rétention 11.17 NL: 3.42E5 Total Scan 100 323.00 320000 PDA 95 testPHEN- 23 90 300000 85 280000 260000 Spectre UV du 80 75 217.00 240000 220000 composé qui sort à 70 237.00 65 Chromatogramme 200000 20,8 min 60 Relative Absorbance 55 180000 de l’échantillon: uAU 160000 Acide caféique 50 140000 dans l’extrait 43.03 45 extrait phénolique 40 phénolique de 120000 15.81 margine (détecteur DAD) 35 100000 30 de margine 80000 12.14 13.88 39.07 25 20 60000 43.51 15 40000 27.98 35.33 20.75 29.21 10 0.23 4.71 34.80 38.21 20000 19.77 43.65 57.52 17.36 22.44 25.29 54.73 5 31.51 41.84 45.00 47.47 53.73 4.33 6.00 10.17 49.05 55.29 0 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 Time (min) wavelength (nm) 51