Chimica Analitica III (Completa) PDF

DIPARTIMENTO DI SCIENZE CHIMICHE CORSO DI LAUREA TRIENNALE IN CHIMICA CHIMICA ANALITICA III Lingenti Gabriele CAPITOLO 1: STADI DI UNA ANALISI CHIMICA......................................... 1 1.1. SCALE DI ANALISI................................................

DIPARTIMENTO DI SCIENZE CHIMICHE CORSO DI LAUREA TRIENNALE IN CHIMICA CHIMICA ANALITICA III Lingenti Gabriele CAPITOLO 1: STADI DI UNA ANALISI CHIMICA......................................... 1 1.1. SCALE DI ANALISI................................................................................................ 1 1.2. SCELTA DEL METODO ANALITICO............................................................................. 2 1.3. CAMPIONAMENTO............................................................................................... 3 1.3.1. Tipi di campionamento..................................................................................4 1.4. FASE PRE-ANALITICA............................................................................................ 5 1.4.1. Caratteristiche di una metodica analitica.......................................................5 1.4.2. Moda e Mediana............................................................................................6 1.4.3. Precisione.....................................................................................................6 1.4.4. Accuratezza..................................................................................................6 1.4.4.1. Errore assoluto................................................................................................ 7 1.4.4.2. Errore relativo.................................................................................................. 7 1.4.5. Sensibilità e Detection limit............................................................................8 1.4.6. Intervallo dinamico lineare........................................................................... 10 1.5. CONTROLLO QUALITÀ DEI RISULTATI ANALITICI.......................................................... 11 1.5.1. Validita’....................................................................................................... 13 1.5.2. Robustezza................................................................................................. 14 1.5.3. Selettivita’................................................................................................... 14 1.5.4. Reporting del risultato analitico.................................................................... 16 CAPITOLO 2: CROMATOGRAFIA............................................................ 17 2.1. CLASSIFICAZIONE DEI METODI CROMATOGRAFICI....................................................... 17 2.2. ELUIZIONE COLONNA CROMATOGRAFICA................................................................. 18 2.2.1. Cromatogramma......................................................................................... 19 2.3. TASSI DI MIGRAZIONE DEI SOLUTI........................................................................... 19 2.3.1. Costanti di distribuzione.............................................................................. 20 2.3.2. Tempo di ritenzione..................................................................................... 20 2.3.3. Tassi di migrazione e costanti di distribuzione............................................... 22 2.3.4. Fattore di ritenzione "𝑘"............................................................................... 23 2.3.5. Fattore di Selettività..................................................................................... 24 2.4. ALLARGAMENTO DI BANDA ED EFFICIENZA DELLA COLONNA.......................................... 25 I TITOLO DEL CAPITOLO 2.4.1. Descrizione quantitativa dell’efficienza della colonna................................... 28 2.4.2. Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna...................................... 29 2.5. TEORIA DELL’ALLARGAMENTO DI BANDA.................................................................. 30 2.6. RISOLUZIONE DELLA COLONNA............................................................................. 36 2.7. INTERAZIONI SOLUTO-FASI.................................................................................. 37 CAPITOLO 3: SPETTROSCOPIA ATOMICA.............................................. 38 3.1. SPETTRO DI EMISSIONE....................................................................................... 39 3.2. SPETTRO DI ASSORBIMENTO................................................................................. 40 3.3. LARGHEZZA DELLE LINEE SPETTRALI ATOMICHE.......................................................... 41 3.3.1. Allargamento naturale................................................................................. 41 3.3.2. Allargamento Collisionale............................................................................ 41 3.3.3. Allargamento doppler.................................................................................. 42 3.4. PRODUZIONE DI ATOMI E DI IONI............................................................................ 42 3.4.1. Sistemi di introduzione dei campioni............................................................ 42 3.4.2. Sorgenti di plasma....................................................................................... 44 3.4.2.1. Plasmi accoppiati induttivamente (ICP)........................................................... 45 3.4.2.2. Introduzione campione ICP............................................................................ 47 3.4.2.3. Aspetto e spettri del plasma........................................................................... 47 3.4.2.4. Atomizzazione e ionizzazione dell’analita........................................................ 48 3.4.3. Plasma a microonde.................................................................................... 49 3.5. ATOMIZZATORI A FIAMMA.................................................................................... 50 3.5.1. Effetti della temperatura della fiamma.......................................................... 51 3.5.2. Spettri di assorbimento ed emissione in fiamme........................................... 52 3.6. ATOMIZZATORI ELETTROTERMICI............................................................................ 52 3.6.1. Forni........................................................................................................... 53 3.6.2. Modificatori di matrici per forni..................................................................... 54 3.7. SPETTROMETRIA DI EMISSIONE ATOMICA.................................................................. 55 3.7.1. Strumentazione spettrometria di emissione atomica..................................... 55 3.7.2. Isolamento della lunghezza d’onda.............................................................. 56 3.7.3. Interferenze nel plasma e nella fiamma atomica nella spettroscopia di emissione................................................................................................................. 58 3.7.3.1. Interferenze del bianco................................................................................... 58 II  3.7.3.2. Interferenza dell’analita................................................................................. 59 3.8. SPETTROMETRIA DI ASSORBIMENTO ATOMICA............................................................ 60 3.8.1. Strumentazioni............................................................................................ 61 3.8.1.1. Lampada a catodo cavo................................................................................. 61 3.8.1.2. Lampada a scarica senza elettrodi.................................................................. 62 3.8.2. Modulazione della sorgente......................................................................... 62 3.8.3. Correzione del fondo................................................................................... 64 3.9. ASSORBIMENTO ATOMICO DELLA FIAMMA................................................................ 65 CAPITOLO 4: HPLC............................................................................... 66 4.1. PROCESSO CROMATOGRAFICO............................................................................. 66 4.1.1. Le particelle piccole offrono un’elevata precisione ma richiedono un’alta pressione.................................................................................................................. 67 4.1.2. La colonna.................................................................................................. 70 4.1.3. Fase stazionaria.......................................................................................... 73 4.1.4. Processo di eluizione................................................................................... 76 4.1.5. Eluzione isocratica e gradiente..................................................................... 77 4.2. INIEZIONE E RILEVAMENTO IN HPLC...................................................................... 78 4.2.1. Pompe e valvole di iniezione......................................................................... 78 4.2.2. Rivelatori spettrofotometrici........................................................................ 79 4.2.2.1. Rivelatore ultravioletto................................................................................... 79 4.2.2.2. Rilevatore a diffusione della luce evaporativa.................................................. 80 4.2.2.3. Rivelatore carico di aeresol............................................................................ 82 4.2.3. Rivelatori elettrochimici............................................................................... 84 4.2.4. Rivelatori indice di rifrazione........................................................................ 85 4.3. METODI DI SVILUPPO PER SEPARAZIONI IN FASE INVERSA.............................................. 86 4.3.1. Fasi iniziali dello sviluppo del metodo........................................................... 86 4.3.2. Attributi desiderati di un nuovo metodo cromatografico................................ 87 CAPITOLO 5: ELETTROFORESI CAPILLARE............................................. 88 5.1. PRINCIPI DI ELETTROFORESI CAPILLARE................................................................... 88 5.1.1. Elettroforesi................................................................................................ 91 5.1.2. Elettrosmosi................................................................................................ 92 III TITOLO DEL CAPITOLO 5.1.3. Mobilita’...................................................................................................... 95 5.1.4. Piatti teorici e risoluzione............................................................................. 97 5.2. CONDUZIONE CAPILLARE ELETTROFORETICA............................................................ 100 5.3. INIEZIONE E COMPOSIZIONE DEL CAMPIONE............................................................ 103 5.3.1. L’idrodinamica.......................................................................................... 103 5.3.2. L’elettrocinetica........................................................................................ 103 5.4. RIVELATORI.................................................................................................... 105 5.4.1. Rivelatori ultravioletti................................................................................. 105 5.4.2. Rivelatori a fluorescenza............................................................................ 105 5.4.3. Rivelatore amperometrico.......................................................................... 105 5.4.4. Rivelatore della conducibilità..................................................................... 106 5.4.5. Spettrometria di massa elettrospray........................................................... 106 5.4.6. Rivelazione indiretta.................................................................................. 106 5.5. CROMATOGRAFIA ELETTROCINETICA CAPILLARE....................................................... 107 5.6. CROMATOGRAFIA ELETTROCINETICA MICELLARE (MECK)........................................... 108 5.7. ISOTACOFORESI CAPILLARE................................................................................ 109 5.8. ISOELETTRIC FOCUSING..................................................................................... 110 5.9. ELETTROCROMATOGRAFIA CAPILLARE.................................................................... 110 5.10. ELETTROFORESI CAPILLARE SU GEL.................................................................... 111 5.11. SVILUPPO DEL METODO.................................................................................. 112 CAPITOLO 6: GAS CROMATOGRAFIA................................................... 113 6.1. COLONNE TUBOLARI APERTE............................................................................... 114 6.2. CARRIER GAS................................................................................................. 118 6.3. COLONNE DI PROTEZIONE E GAP DI RITENZIONE........................................................ 120 6.3.1. Colonna di protezione................................................................................ 120 6.3.2. Gap di ritenzione....................................................................................... 121 6.4. INIEZIONE DEL CAMPIONE.................................................................................. 122 6.4.1. Iniezione split............................................................................................ 123 6.4.2. Iniezione splitless...................................................................................... 124 6.4.3. Iniezione su colonna.................................................................................. 126 6.5. RIVELATORI.................................................................................................... 127 6.5.1. Rivelatore di conducibilità termica............................................................. 127 IV  6.5.2. Rivelatore ionizzazione a fiamma................................................................ 128 6.5.3. Rivelatore a cattura di elettroni................................................................... 129 6.5.4. Rivelatore azoto-fosforo............................................................................. 130 6.5.5. Rivelatore fotomerico a fiamma.................................................................. 130 6.6. ANALISI QUANTITATIVA E QUALITATIVA.................................................................... 131 6.6.1. Analisi qualitativa...................................................................................... 131 6.6.2. Analisi quantitativa.................................................................................... 133 6.6.2.1. Confronto diretto dell’area dei picchi.............................................................133 6.6.2.2. Normalizzazione interna................................................................................134 CAPITOLO 7: CROMATOGRAFIA SCAMBIO IONICO-IONICA.................. 135 7.1. CROMATOGRAFIA SCAMBIO-IONICO...................................................................... 135 7.1.1. Scambiatori di ioni..................................................................................... 135 7.1.2. Selettività scambio ionico.......................................................................... 136 7.1.3. Equilibrio di Donnan.................................................................................. 138 7.2. CROMATOGRAFIA IONICA................................................................................... 140 7.2.1. Cromatografia con anionica, con ioni soppressi.......................................... 140 7.2.2. Cromatografia cationica con ioni soppressi................................................ 141 7.2.3. Sistemi automatizzati................................................................................ 142 7.2.3.1. Sistema con 𝐾2𝐻𝑃𝑂4 e generazione di 𝐾𝑂𝐻..................................................142 7.2.3.2. Dionex (autorigenerante elettrochimico)........................................................144 CAPITOLO 8: SPETTROSCOPIA DI LUMINOSCENZA.............................. 146 8.1. TEORIA FLUORESCENZA MOLECOLARE................................................................... 146 8.1.1. Processi di rilassamento............................................................................ 147 8.1.1.1. Metodi di rilassamento non radiativo..............................................................148 8.1.1.2. Fluorescenza................................................................................................148 8.1.1.3. Relazione tra spettri di eccitazione e spettri di fluorescenza............................149 8.1.2. Specie fluorescenti.................................................................................... 150 8.1.2.1. Fluorescenza e struttura...............................................................................151 8.1.2.2. Effetto rigidità strutturale...............................................................................151 8.1.2.3. Effetti temperatura e solvente........................................................................152 8.2. EFFETTI DELLA CONCENTRAZIONE SULL’INTENSITÀ DI FLUORESCENZA............................. 153 8.3. STRUMENTI DI FLUORESCENZA............................................................................ 155 V TITOLO DEL CAPITOLO 8.4. APPLICAZIONE DEI METODI DI FLUORESCENZA.......................................................... 156 VI  TITOLO DEL CAPITOLO CAPITOLO 1: STADI DI UNA ANALISI CHIMICA Definizione del problema Campionamento Preparazione del campione Solubilizzazione del campione Separazione di sostanze potenzialmente interferente Esecuzione dell’analisi e presentazione dei risultati. Sono tutte azioni essenziali. Definire il problema è fondamentale per capire cosa ci aspetta e preparare il processo di qualità. Questo lo capisco capendo quali sono gli analiti da determinare e in che quantità. Si effettua un piano di campionamento, svolto in maniera rigorosa. La preparazione del campione e la solubilizzazione di questo sono processi che mi permettono di poter lavorare correttamente, facendo attenzione all’analita da determinare. Nella fase di solubilizzazione, in soluzione dev’esserci il nostro analita di interesse (o i nostri analiti) Data la presenza di tante sostanze, devo separare il nostro analita da tutto. Eseguire le analisi per poter trattare quanto richiesto. Corpo del testo. Nuovo paragrafo. 1.1. Scale di analisi Macroanalisi (0.1-1g) Semimicro analisi(0.01-0.1g) Micro analisi(0.001-0.01g) Submisco analisi(0.0001-0.001g) La precisione e l’accuratezza “accettabili” di un’analisi dipendono anche dalla frazione di analita nel campione. Per analiti in TRACCE ed ULTRA-TRACCE sono tollerate accuratezze e precisioni molto minori rispetto a quelle accettate per i costituenti principali di un campione. 1 TITOLO DEL CAPITOLO Questo perché determinare un analita in ultra-tracce, seppur siamo bassi in grandezze, si alza l’errore relativo alla misura, ma ci possiamo permettere questo perché sennò non lo vedremo. Le varie tecniche analitiche sono: Gravimetria Volumetria Potenziometria Elettrogravimetria Voltammetria Spettroscopia Uv-Vis Fluorimetria Spettroscopia Atomica Cromatografia Spettrometria di massa Da VOLTMETRIA a CROMATOGRAFIA, scendono sino all’ordine di 10!"# 1.2. Scelta del metodo analitico Il successo o il fallimento di una analisi può dipendere in modo critico dalla corretta scelta del metodo da applicare. Una metodica può essere preferita rispetto ad un’altra a causa dei seguenti motivi: -Concentrazione del componente da determinare Quantità di campione disponibile per l’esecuzione dell’analisi Composizione del campione (campionamento) Disponibilità della strumentazione Rapidità Convenienza Accuratezza Numero di analisi La scelta del metodo è data da un COMPROMESSO tra accuratezza ed economia. La definizione del problema comprende l’esame della letteratura 2  TITOLO DEL CAPITOLO Tipo di analisi richiesta: - Qualitativa - Elementare - Quantitativa Con l’analisi qualitativa ho bisogno di una strumentale semplice, che mi da facilmente un risultato con termine di paragone (condizione sempre necessaria, dunque avere sempre un riferimento) L’analisi quantitativa ha uno step in più, in quanto quello standard, mi funge per una retta di calibrazione, così da ottenere la quantità incognita. 1.3. Campionamento Prima di poter effettuare un’analisi chimica significativa bisogna ottenere un campione rappresentativo più piccolo, la cui composizione rispecchi quella del lotto di partenza. Questo processo è chiamato CAMPIONAMENTO. Il campione rappresentativo è poi convertito in un campione da laboratorio omogeneo, dal quale si prelevano piccole porzioni chiamate ALIQUOTE, per effettuare analisi chimiche ripetute. Questo allo scopo di ottenere una stima dell’incertezza del risultato. LOTTO → CAMPIONE RAPPRESENTATIVO COMPOSITO → CAMPIONE OMOGENO DA LABORATORIO → ALIQUOTA. Un LOTTO rappresenta l'intera quantità di materiale o sostanza che deve essere analizzata. Il CAMPIONE RAPPRESENTATIVO COMPOSITO è una porzione più piccola prelevata dal lotto, ma deve riflettere esattamente la composizione complessiva del lotto. Se il lotto è costituito da diverse matrici o componenti, il campione rappresentativo deve includere tutte queste matrici per essere una rappresentazione fedele. Col termine “composito” si indica che il campione rappresentativo può essere ottenuto combinando campioni prelevati da diverse parti del lotto. Il CAMPIONE OMOGENO DA LABORATORIO si tratta del campione rappresentativo composito, ulteriormente lavorato. Questo passaggio è importante perché, spesso, il campione rappresentativo potrebbe non essere completamente omogeneo, soprattutto in lotti con materiali di diversa natura o distribuzione Per ALIQUOTA intendiamo una piccola porzione prelevata dal campione omogeneo per eseguire l'analisi chimica. Il campione omogeno viene suddiviso in diverse aliquote (non meno di 3 da portare in laboratorio), per effettuare analisi ripetute o riservare porzioni per altri fini. 3 TITOLO DEL CAPITOLO In particolare, diremo che: 1) Porzione, conservata in archivio 2) Porzione analizzata 3) Porzione consegnata ad un ente di garanzia La preparazione del campione è riferita alla conversione del campione rappresentativo eterogeneo nel campione da laboratorio omogeno. Questo significa che diverse parti del campione potrebbero avere concentrazioni variabili dell'analita o delle altre sostanze presenti. La preparazione del campione si riferisce anche ai processi in cui un campione molto diluito viene concentrato, (in quanto il campione originale può contenere una concentrazione troppo bassa dell’analita da analizzare), oppure nei quali vengono eliminate specie che interferiscono con l’analisi dell’analita che interessa. Si ha UN’INTERFERENZA quando una specie diversa dall’analita (detta INTERFERENTE) provoca un aumento o una diminuzione della risposta del metodo analitico, facendo apparire che ci sia più o meno analita di quello fatto presente. Con il termine MASCHERAMENTO, si indica la trasformazione di una specie che interferisce in una specie che non è rilevata dal metodo analitico. Si tratta di trasformare una specie interferente in una forma che non reagisce o non è rilevata dal metodo analitico. 1.3.1. Tipi di campionamento Eseguire un campionamento in una discarica, è il processo più complesso a causa dell’eterogeneità dei materiali presenti. Dunque, come faccio ad eseguire un metodo di campionamento rigoroso? Stabilisco i PUNTI DI CAMPIONAMENTO, pertanto capire quanti punti di prelievo debbo scegliere. Il numero di punti di campionamento dipende dalle dimensioni della discarica e dalla sua variabilità. Più è ETEROGENEA la discarica, più punti di campionamento sono necessari per ottenere un campione rappresentativo. Da ogni punto stabilito, si preleva una certa quantità di campione. Questi campioni prelevati da diversi punti possono essere uniti insieme per formare un CAMPIONE COMPOSITO. Solitamente questo campione composito è di dimensioni troppo grandi per essere portato in laboratorio o analizzato direttamente, quindi va RIDOTTO. 4  TITOLO DEL CAPITOLO Il processo di riduzione prende il nome di METODO DELLA QUARTATUTA. Ecco come funziona: 1) Prima di iniziare la quartatura, il campione viene rimescolato accuratamente al fine di renderlo omogeno. 2) Il campione viene poi sparso su una superficie piana e uno volta disteso, viene suddiviso in 4 parti uguali tagliando il campione con linee perpendicolari in una forma a croce. 3) Si scartano due delle quattro parti in diagonale tra loro (sia ad esempio la 1 e la 3), mentre le altre vengono conservate. 4) Le due parti rimanenti (in questo caso 2 e 4) vengono nuovamente rimescolate e si ripete il processo di quartatura sino ad ottenere la quantità di campione desiderata. Ricordiamo che il campione, dev’essere si omogeno quanto più possibile, ma dev’essere RAPPRESENTATIVO. Faccio questo quando ottengo almeno 3 campioni da 1kg che vanno poi aliquotati. Il 1kg di laboratorio verrà suddiviso in piccole porzioni per eseguire la serie di analisi. In laboratorio inizia la FASE PRE-ANALITICA 1.4. Fase pre-analitica Possiamo fare uso di metodi ottici, metodi elettrochimici, metodi cromatografici. Vi sono svantaggi e vantaggi: Vantaggi: elevata velocità di esecuzione e altissima sensibilità e specificità Svantaggi: elevato costo di acquisto e manutenzione, trattamenti preliminari sul campione, necessità di standard puri per la taratura dello strumento. 1.4.1. Caratteristiche di una metodica analitica Accuratezza Precisione Specificità/selettività Intervallo di linearità LOD LOQ Robustezza 5 TITOLO DEL CAPITOLO Solidità 1.4.2. Moda e Mediana Uno dei metodi più utilizzati per ricavare un “valore centrale” è il calcolo della MEDIA anche chiamata MEDIA ARITMETICA, la quale consiste nel sommare tutti i valori ottenuti e dividere suddetto risultato per il numero di volte che è stata effettuata la misura. Matematicamente scrivo: ∑% $&$ 𝑥$ 𝑥̅ = 𝑁 𝑥$ =termine che rappresenta i valori individuali delle singole misure 𝑁 =termine che indica il numero di misure replicate La MEDIANA è il risultato intermedio ottenuto quando, si dispongono i dati ottenuti in ordine crescente o decrescente. Tale parametro è utilizzato quando per un set di dati, si contano dei risultati che si discostano significativamente dal set stesso di dati, influenzando altre misure come la media, prima citata. 1.4.3. Precisione La precisione descrive la RIPRODUCIBILITA’ delle misure, in altre parole la vicinanza dei risultati ottenuti, replicati da operatori e laboratori differenti. Facciamo riferimento a 3 grandezze, che descrivono la precisione di un set di dati: Deviazione standard Varianza Coefficiente di variazione Queste 3 sono delle funzioni che dimostrano come un singolo valore differisce dalla media, chiamata DEVIAZIONE DALLA MEDIA: 𝑑$ = |𝑥$ − 𝑥̅ | 1.4.4. Accuratezza L’accuratezza indica la vicinanza della misurazione al valore vero o al valore accettato, espressa tramite L’ERRORE. 6  TITOLO DEL CAPITOLO La figura in allegato illustra la differenza tra ACCURATEZZA e PRECISIONE. L’accuratezza è spesso più difficile da determinare in quanto il valore vero o quello accettato, è un parametro incognito. L’accuratezza viene espressa in termini di errore relativo o assoluto. 1.4.4.1. Errore assoluto L’errore ASSOLUTO effettuato nelle misurazioni è la differenza tra il valore vero e il valore ottenuto. L’errore assoluto "E" nella misurazione di una quantità "𝑥$ " è dato dalla relazione: 𝐸 = 𝑥$ − 𝑥' 𝑥' =è il valore vero o accettato. 𝑥$ =valore ottenuto A seconda del segno di "E" che ottengo, posso effettuare delle deduzioni in quanto: 𝐸 > 0, mi aspetto che il valore misurato è MAGGIORE di quello reale ottenendo dunque un errore positivo. 𝐸 < 0, mi aspetto che il valore misurato è MINORE di quello reale, ottenendo dunque un errore negativo. 𝐸 = 0, mi aspetto che il valore misurato è esattamente UGUALE al valore reale. 1.4.4.2. Errore relativo L’errore RELATIVO effettuato nelle misurazioni è il rapporto tra l’errore assoluto e il valor vero e può essere espresso in percenturale, in ppm, e ctc L’errore relativo "𝐸( " è molto spesso una quantità più utile rispetto all’errore assoluto. L’errore relativo percentuale, è data dalla relazione: 𝑥$ − 𝑥' 𝐸( = ∗ 100 𝑥' Tuttavia, quando parliamo di ACCURATEZZA, dobbiamo tenere in considerazione un altro parametro chiamato RECUPERO. Il recupero è definito come la percentuale di un analita che viene effettivamente misurata rispetto alla quantità nota aggiunta o presente nel campione. Si tratta di una misura dell’efficacia del metodo analitico nel recuperare l’analita dall’intera matrice de campione. Scrivo tale parametro come 7 TITOLO DEL CAPITOLO 𝑥$ 𝑅= ∗ 100 𝑥' Un buon recupero indica che il metodo analitico è capace di misurare con precisione la quantità di analita presente. Ci permette di verificare se durante il processo ci sono state perdite significative. I parametri di RIPRODUCIBILITA’ e RIPETIBILITA’ sono di fondamentale importanza, in quanto attraverso di questi si può verificare di lavoro di un laboratorio, al fine di capire se questo è buono o meno. 1.4.5. Sensibilità e Detection limit Il termine SENSIBILITA’ è spesso usato per descrivere un metodo analitico. Tuttavia, spesso viene impiegato in modo indiscriminato e scorretto. La definizione di sensibilità più comunemente utilizzata è la SENSIBILITA’ DI CALIBRAZIONE. Definiamo dunque la SENSIBILITA’ DI CALIBRAZIONE. Come la pendenza della curva che rappresenta la relazione tra la concentrazione dell’analita e la risposta strumentale (sia ad esempio l’assorbanza). Se la curva di calibrazione è LINEARE, significa che per ogni variazione nella concentrazione dell’analita, il segnale dello strumento varia proporzionalmente. La sensibilità rimane costante e indipendente dalla concentrazione. Se la sensibilità NON è lineare, la sensibilità varia con la concentrazione. La sensibilità di calibrazione non dice nulla riguardo alla capacità del metodo di rilevare differenze tra le concentrazioni La dispersione nella risposta viene spesso chiamata RUMORE, cioè variazioni casuali o imprecisioni nel segnale, che devono essere prese in considerazione in quanto possono influenzare la capacità di rilevare differenze nelle concentrazioni. Questo è il motivo principale per il quale si usa la SENSIBILITA’ ANALITICA, ovvero il rapporto tra la pendenza della curva di calibrazione e la deviazione standard del segnale dell’analita ad una data concentrazione. La SENSIBILITA’ ANALITICA, dipende fortemente dalla concentrazione Quando parliamo di DETECTION LIMIT "DL" intendiamo la più bassa concentrazione dell’analita corrispondente al minimo segnale significativo , cioè al segnale vicino a quello del 8  TITOLO DEL CAPITOLO bianco, che viene riportata con un certo intervallo di confidenza. Tutte le tecniche analitiche hanno un detection limit. 9 TITOLO DEL CAPITOLO Per tutti i metodi che richiedono la costruzione di una curva di calibrazione, il detection limit viene espresso attraverso la relazione: 𝑘𝑠) 𝐷𝐿 = 𝑚 𝑘=termine che indica il fattore di confidenza 𝑠) =deviazione standard del bianco 𝑚=sensibilità di calibrazione. Il detection limit è inversamente proporzionale alla sensibilità di calibrazione. Il fattore "k" può essere pari a due termini, che corrispondo a due intervalli di confidenza differenti, in particolare: k=2, intervallo di confidenza del 92.1% k=3, intervallo di confidenza del 98.3% 1.4.6. Intervallo dinamico lineare L’intervallo dinamico lineare di un metodo analitico è un concetto che si riferisce al range di concentrazioni in cui un analita può essere misurato con precisione e accuratezza, attraverso una curva di calibrazione lineare, come quella in figura qui allegata. L’estremità INFERIORE dell’intervallo è generalmente considerata come detection limit. L’estremità SUPERIORE è il punto massimo della concentrazione in cui il sistema continua a fornire risultati coerenti e proporzionali alla concentrazione dell’analita. (in questo caso faremo riferimento alla concentrazione alla quale il segnale inizia a deviare dalla linearità). Generalmente, una deviazione del 5% dalla linearità è una soglia utilizzata per indicare se il campione segue un andamento lineare o meno. In altre parole, se la risposta dello strumento si discosta del 5% rispetto alla risposta prevista dalla curva di calibrazione, vuol dire che non è più in relazione lineare. Una curva di calibrazione LINEARE è preferita per la sua semplicità matematica, rendendo semplice la rilevazione di una risposta anomala. Facendo uso di curve di calibrazioni lineari è possibile far uso di molti meno standard per costruire la curva in quanto la relazione è pressoché semplice, minimizzando le fonti di errore. 10  TITOLO DEL CAPITOLO 1.5. Controllo qualità dei risultati analitici Le più importanti attività da considera per il “quality assurance” sono: Controllo qualità. Validità del risultato. Analisi del risultato CONTROL CHART (diagramma di controllo) Un diagramma di controllo è uno strumento grafico molto importante utilizzato per monitorare la qualità di un processo, così da verificare che le misurazioni o le caratteristiche di un processo siano accettabili. Ad esempio, consideriamo la performance di una bilancia analitica. I parametri di precisione e di accuratezza di una bilancia possono essere monitorati periodicamente determinando il peso di uno standard. Questo viene eseguito giorno dopo giorno, per un periodo di tempo. Per capire se la bilancia funziona correttamente, è possibile tracciare le misurazioni effettuare su un diagramma di controllo, considerando i LIMITI inerenti alla massa dello standard. Questi limiti sono: Upper control Limit (ULC), definito come: 3𝜎 𝑈𝐶𝐿 = 𝜇 + √𝑁 Lower control Limit (LCL), definito come: 3𝜎 𝐿𝐶𝐿 = 𝜇 − √𝑁 In ambo i casi il termine "𝜇" indica la popolazione delle misure della massa. 𝜎 =indica la deviazione standard della popolazione. 𝑁 =numero di misure effettuate 11 TITOLO DEL CAPITOLO La popolazione media e la deviazione standard della massa, posso essere stimati da studi preliminari. I limiti di controllo UCL e LCL, sono “3 deviazioni standard” sopra e sotto la media, dunque si sta considerando un intervallo molto ampio che include quasi tutte le possibili variazioni dei dati. Graficamente si mostra, un tipico diagramma di controllo per una bilancia analitica. Sull’asse delle "x" si ha il tempo impiegato nell’acquisizione dei dati, in questo specifico caso 24 giorni, per 20.000g di massa standard certificata da un ente autorizzato. Si stima che la media della popolazione e la deviazione standard sono pari ad: 𝜇 = 20.000𝑔. 𝜎 = 0.00012𝑔. Per 5 misurazioni effettuate, ricavo una media pari ad: 0.00012 3∗ = 0.00016 √5 Dunque diremo che 𝑈𝐶𝐿 = 20.00016𝑔 𝐿𝐶𝐿 = 19.99974𝑔 Conoscendo questi valori posso costruire un grafico come quello allegato sopra. Sino a quando la massa media, rimane compresa tra UCL e LCL allora diremo che la massa è SOTTO CONTROLLO. Nel momento in cui si supera la soglia dei limiti di controllo, diremo che il processo non è più sotto controllo. 12  TITOLO DEL CAPITOLO 1.5.1. Validita’ Il processo di VALIDAZIONE determina l’idoneità di un’analisi, nel fornire risultati e informazioni desiderati. Questo viene eseguito sia da un’analista, sia da enti privati o governativi come la FDA o NIST. La validità dei campioni è spesso usata per accettare i campioni della popolazione studiata, per le misurazioni effettuate e per stabilire l’autenticità del campione in esame. Nei processi di validità ci sono diverse ragioni per un campione può essere RIFIUTATO: Dubbi sull’identità del campione Problemi nella gestione del campione Metodo di campionamento inappropriato, sia ad esempio la contaminazione di campioni di sangue durante un’indagine forense. Si differenziano vari approcci per validare i metodi analitici, ciascuno dei quali permette di garantire che i risultati ottenuti siano accurati e affidabili. Tra questi differenziamo: Analisi di materiale di riferimento standard Analisi mediante un metodo analitico diverso Analisi di campioni “SPIKED”, ovvero campioni a cui è stata aggiunta una quantità nota di analita. Analisi di campioni sintetici, ovvero campioni sintetizzati in laboratorio con una composizione chimica simile a quella del campione da analizzare. I laboratori e gli analisti sono in dovere di dimostrare che i metodi e le tecniche utilizzate sono valide. 13 TITOLO DEL CAPITOLO La validazione del dato è lo STEP FINALE, prima di rilasciare definitivamente i risultati ottenuti. Questo processo inizia con la validazione dei campioni e dei metodi utilizzati. Successivamente i dati vengono riportati con i limiti di incertezza validi, dopo che è stata effettuata una verifica approfondita per assicurarsi che tutto sia stato eseguito correttamente, eliminando ad esempio: Eventuali errori di campionamento Errori nell’esecuzione dell’analisi Errori nell’identificazione dei campioni Errori nei calcoli 1.5.2. Robustezza La ROBUSTEZZA è la misura della capacità di una procedura analitica di non essere alterata da piccole (deliberate) variazioni dei fattori (delle variabili) che possono prevedibilmente influenzarne i risultati. Conviene focalizzare l’attenzione sui fattori più influenti (critici), ordinandoli in base alla loro influenza sulle prestazioni del metodo, e stabilire procedure di controllo di qualità per mantenerli sotto controllo. La procedura per valutare la robustezza implica il confronto sistematico degli effetti delle variazioni dei fattori d’influenza sul risultato dell’analisi. Nel caso di un numero limitato di fattori (al massimo tre) si può valutare la robustezza confrontando i risultati medi ottenuti prima e dopo una loro variazione arbitraria. 1.5.3. Selettivita’ La selettività (per metodi che forniscono risposte che possono essere più o meno distinte per un certo numero di sostanze chimiche, ad esempio appartenenti alla stessa classe) o la specificità (per metodi che producono una risposta per un solo analita) è la capacità di un metodo di determinare in modo univoco e specifico l’analita, anche in presenza di interferenze derivanti da altre specie chimiche. La mancanza di specificità o selettività in una singola procedura analitica può essere compensata da altre procedure analitiche di supporto TEST DI PUREZZA: serve a garantire che tutte le procedure analitiche eseguite consentano una valutazione accurata del contenuto di impurezze, cioè test per le sostanze correlate, metalli pesanti, contenuto di solventi residui, ecc. ANALISI (CONTENUTO O POTENZA): fornire un risultato esatto che consenta una quantificazione accurata sul contenuto o la potenza dell'analita in un campione. 14 TITOLO DEL CAPITOLO 15 TITOLO DEL CAPITOLO 1.5.4. Reporting del risultato analitico Generalmente i risultati analitici vengono riportati con il valor medio e la deviazione standard. A volte viene riportata la deviazione standard anziché quella del set di dati. Ambo le due metodiche sono accettate, a patto che venga specificato quale deviazione standard viene riportata. E’ bene dire che il risultato dev’essere portato anche con un intervallo di confidenza (un buon compromesso è il 95%). Devono essere riportati anche i risultati ottenuti dai vari test-statistici, come ad esempio le regioni di rifiuto. 16  TITOLO DEL CAPITOLO CAPITOLO 2: CROMATOGRAFIA La CROMATOGRAFIA è una tecnica di separazione, identificazione e determinazione di componenti chimici all’interno di una miscela. Nessun’altra tecnica di separazione è così forte ed efficiente come la cromatografia. Definire rigorosamente il termine CROMATOGRAFIA è molto difficile, in quanto esso fa riferimento a tecniche e sistemi differenti tra loro. Tuttavia, tutte le tecniche cromatografiche hanno in comune l’uso di una FASE STAZIONARIA e una FASE MOBILE. La fase mobile può essere di vario stato fisico, come: Gas (da cui deriverà la cromatografia a gas) Liquido Fluido supercritico Concettualmente i costituenti di una miscela vengono trasportati attraverso la fase stazionaria, dal flusso di una fase mobile. Le separazioni dei componenti sono basate sulla differenza dei tassi di migrazione, ovvero sia sull’affinità da parte dei costituenti della miscela nei riguardi della fase stazionaria. È importante sapere che la FASE STAZIONARIA è fissata all’interno di una colonna o su una superficie piana. 2.1. Classificazione dei metodi cromatografici Le tecniche cromatografiche le possiamo classificare in due modi: CROMATOGRAFIA SU COLONNA: La fase stazionaria è inserita all’interno di un tubo e la fase mobile viene fatta passare attraverso la colonna, per mezzo della gravità o della pressione. CROMATOGRAFIA PLANARE: La fase stazionaria è posizionata su una superficie piana, come una lastra di vetro. La fase mobile si muove attraverso la fase stazionaria per mezzo dell’azione capillare, ma in alcuni casi può muoversi per effetto della gravità. Analizziamo nel dettaglio la CROMATOGRAFIA SU COLONNA 17 TITOLO DEL CAPITOLO Come possiamo vedere nella 1° COLONNA in tabella, esistono varie tecniche che riguardano la cromatografia su colonna, differenziate a seconda della natura della fase mobile. La 2° COLONNA in tabella evidenzia come si differenziano: 5 tipi, di cromatografia liquida 2 tipi, di cromatografia a gas (gas-solid/gas-liquid) La differenza tra questi tipi di cromatografia, si basa sulla natura della fase stazionaria e per il tipo di equilibrio che si instaura tra le fasi. 2.2. Eluizione colonna cromatografica In figura rappresentiamo due componenti "A" e "B" di un campione che si muovono lungo la colonna mediante il processo di ELUIZIONE. La colonna è un tubo cilindrico stretto, impaccato con un solido inerte finemente diviso che trattiene la FASE STAZIONARIA sulla sua superficie. La FASE MOBILE occupa gli spazi aperti tra le particelle dell’impaccamento. Inizialmente una soluzione del campione contenente una miscela di "A" e "B" nella fase mobile viene introdotta alla testa della colonna, al tempo "𝑡# " I due componenti si distribuiscono tra la fase mobile e stazionaria. Il processo di ELUIZIONE consiste nello spingere i componenti da separare attraverso la colonna cromatografica per mezzo di una fase mobile. La fase mobile trascina i soluti lungo la colonna, dove interagiscono con la fase stazionaria. 18  TITOLO DEL CAPITOLO Con l’introduzione della prima fase mobile, L’ELUENTE (la porzione del campione contenuta nella fase mobile) si sposta lungo la colonna, dove si verifica una nuova partizione tra fase mobile e stazionaria, al tempo "𝑡" ". (il termine PARTIZIONE si riferisce al processo in cui il soluto (dunque il campione) si distribuisce tra fase mobile e la fase stazionaria) Ulteriori aggiunte di ELUENTE (solvente) trasportano le molecole di soluto lungo la colonna in una serie continua di trasferimenti tra frase mobile e stazionaria. Poiché il movimento del soluto può avvenire solo nella fase mobile, la VELOCITÀ MEDIA con cui un soluto migra dipende dalla frazione di tempo che trascorre in quella fase. Se il soluto ha una BASSA AFFINITÀ per la fase stazionaria (dunque passa maggior tempo nella fase mobile) migrerà molto rapidamente. Se il soluto ha UN’ALTA AFFINITÀ per la fase stazionaria (dunque passa poco tempo nella fase mobile) migrerà molto lentamente. Idealmente le differenze di velocità risultanti fanno si che i componenti di una miscela si separino in BANDE o ZONE 2.2.1. Cromatogramma Se un rivelatore che risponde alla concentrazione di SOLUTO viene posizionato all'estremità della colonna durante l'eluizione, dove il suo segnale viene tracciato in funzione del tempo (o del volume della fase mobile aggiunta), si ottiene una serie di picchi come mostrato qui in figura. Tale grafico prende il nome di CROMATOGRAMMA utile per analisi quantitative/qualitative. In particolare, la posizione del PICCO MASSIMO conferisce informazioni riguardo ai componenti del campione. L’AREA DEL PICCO fornisce una misura quantitativa delle specie. 2.3. Tassi di migrazione dei soluti L'efficacia di una colonna cromatografica nella separazione di due soluti dipende in parte dalla velocità relativa con cui le due specie vengono eluite. In altre parole, i due soluti NON si muovono alla stessa velocità, perché interagiscono in modo diverso con la fase stazionaria. Questi tassi, a loro volta, sono determinati dai rapporti delle concentrazioni di soluti in ciascuna delle due fasi. 19 TITOLO DEL CAPITOLO 2.3.1. Costanti di distribuzione Tutte le separazioni cromatografiche si basano su differenze nella misura in cui i soluti sono distribuiti tra la fase mobile e quella stazionaria. In cromatografia ogni soluto, sia ad esempio quello della specie "A" si trova in equilibrio tra due fasi. (mobile e stazionaria). L’equilibrio è descritto dalla reazione: 𝐴(𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑒) ⇄ 𝐴(𝑠𝑡𝑎𝑧𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎) Questa reazione implica che la specie "A" può essere trattenuta nella fase stazionaria o disciolta nella fase mobile. La costante di Equilibrio "𝐾* " per questa reazione è chiamata COSTANTE DI DISTRIBUZIONE ed è definita come: (𝑎+ ), 𝐾* = (𝑎+ )- (𝑎+ ), =attività del soluto "A" nella fase stazionaria (𝑎+ )- =attività del soluto "A" nella fase mobile Se 𝐾* è ALTO, allora la maggior parte del soluto si troverà nella fase stazionaria migrando lentamente lungo la colonna. Se 𝐾* è BASSO, allora la maggior parte del soluto si troverà nella fase mobile migrando più velocemente lungo la colonna. L’equazione che descrive la COSTANTE DI DISTRIBUZIONE può essere riscritta anche in funzione delle concentrazioni: 𝑐, 𝐾* = 𝑐- In un sistema IDEALE la costante di distribuzione è costante su un ampio intervallo di concentrazioni di soluti. Ciò significa che il rapporto tra le concentrazioni di un soluto nella fase stazionaria e nella fase mobile rimane costante, anche variando la quantità totale del soluto. 2.3.2. Tempo di ritenzione In figura si rappresenta un semplice cromatogramma di una miscela a due componenti. Il piccolo picco a sinistra fa riferimento per una specie che NON viene trattenuta dalla fase stazionaria. Il tempo "𝑡- " dopo l’aggiunta del campione per la comparsa del picco è chiamato TEMPO MORTO. 20  TITOLO DEL CAPITOLO Il TEMPO MORTO fornisce una misura del tasso medio di migrazione della fase mobile ed è un parametro importante nell'identificazione dei picchi dell'analita. Questo tempo è rilevato dal primo picco nel cromatogramma, che non è dovuto all'analita (sostanza d’interesse), ma solo al solvente o a sostanze che non interagiscono con la fase stazionaria. In altre parole, il tempo morto misura quanto tempo impiega una molecola che non interagisce con la fase stazionaria a percorrere la colonna. Si tratta di una grandezza che è direttamente legata alla velocità con cui la fase mobile (solvente) si muove attraverso la colonna, infatti diremo che: Se il picco compare immediatamente, allora il tempo morto del solvente sarà breve Se il picco compare più tardi, allora il tempo morto del solvente sarà maggiore. Il picco più grande a destra in figura è quello di una specie di analita. Il TEMPO DI RITENZIONE "𝑡. "rappresenta il tempo necessario affinché un analita, trattenuto dalla fase stazionaria, ATTRAVERSI L'INTERA COLONNA CROMATOGRAFICA e venga rilevato dal detector dopo l'iniezione del campione. Il tempo di ritenzione è dato da: 𝑡- = 𝑡, + 𝑡- Il tasso di migrazione medio dei soluti lineare è dato da: 𝐿 𝑣̅ = 𝑡. Dunque, parliamo di quanto velocemente, in media un soluto attraversa la colonna cromatografica. Essa è chiamata “media” in quanto il soluto per certi tratti può muoversi più velocemente ma in altri più lentamente. 21 TITOLO DEL CAPITOLO 2.3.3. Tassi di migrazione e costanti di distribuzione Per mettere in relazione la velocità di migrazione di un soluto con la sua costante di distribuzione, esprimiamo il tasso di migrazione come frazione della velocità della fase mobile: 𝑣̅ = 𝑢 𝑋 𝑓𝑟𝑎𝑧𝑖𝑜𝑛𝑒 𝑑𝑖 𝑡𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑠𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑛𝑒𝑙𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑒. Questa frazione, tuttavia è uguale al numero medio di moli del soluto nella fase mobile in ogni istante, diviso per il numero totale di moli di soluto nella colonna, cosi da ottenere: 𝑛𝑢𝑚. 𝑚𝑜𝑙𝑖 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑒 𝑣̅ = 𝑢 𝑋 𝑛𝑢𝑚. 𝑚𝑜𝑙𝑖 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 Il numero totale di moli di soluto nella fase mobile è uguale alla concentrazione "𝑐- " del soluto in quella fase, moltiplicata per il suo volume. Allo stesso modo diremo che il numero totale di moli di soluto è pari alla concentrazione "𝑐, " del soluto della fase stazionaria, viene moltiplicato per il suo volume, così da ottenere: 𝑐- ∗ 𝑉- 𝑣̅ = 𝑢 𝑋 𝑐- 𝑉- + 𝑐, 𝑉, Riscrivo e ottengo: 1 𝑣̅ = 𝑢 𝑋 𝑐 𝑉 1 + 𝑐 , 𝑉, - - Sostituendo l’equazione della costante di distribuzione in funzione delle concentrazioni: 𝑐, 𝐾* = 𝑐- Nella relazione sopra scritta, ottengo un’espressione per la velocità di migrazione del soluto in funzione della sua costante di distribuzione e dei volumi delle fasi stazionaria e mobile: 1 𝑣̅ = 𝑢 𝑋 𝐾/ 𝑉, 1+ 𝑉 - 22  TITOLO DEL CAPITOLO 2.3.4. Fattore di ritenzione "𝑘" Il FATTORE DI RITENZIONE è un importante parametro sperimentale ampiamente utilizzato per confrontare i tassi di migrazione dei soluti nella colonna. Fornisce informazioni sulla velocità relativa con cui i diversi soluti vengono eluiti attraverso la colonna. Per il soluto "A" il fattore di ritenzione "𝑘+ " è definito come: 𝐾+ 𝑉, 𝑘+ = 𝑉- 𝐾+ =costante di distribuzione del soluto "A". Sostituendo questa relazione di "𝑘+ " nell’equazione riguardante la velocità di migrazione del soluto, ottengo: 1 𝑣̅ = 𝑢 𝑋 1 + 𝐾+ Vedremo come il termine "𝐾+ " può essere calcolata dal cromatogramma, ottenendo attraverso dei passaggi matematici, una relazione ben precisa, ovvero: 𝑡. − 𝑡- 𝑡, 𝑘+ = = 𝑡- 𝑡- Questa relazione implica il calcolo del FATTORE DI RITENZIONE per il soluto "A", parametro che fornisce informazioni su quanto tempo l’analita trascorre nella fase stazionaria rispetto alla fase mobile. Se 𝑘+ è GRANDE significa che l’analita trascorre molto tempo nella fase stazionaria rispetto alla fase mobile, da cui possiamo dedurre che l’analita ha forti interazioni con la fase stazionaria, venendo trattenuto di più. Un elevato fattore di ritenzione potrebbe essere indice di una buona separazione Se 𝑘+ è PICCOLO significa che l’analita trascorre tutto il tempo nella fase mobile e non nella fase stazionaria. Questo implica deboli interazioni tra analita e fase stazionaria e inoltre potrebbe essere indice di una separazione insufficiente. Idealmente, le separazioni vengono eseguite in condizioni in cui i fattori di ritenzione per i soluti di interesse in una miscela si trovano nell'intervallo compreso tra 1 e 5, in modo da ottenere una buona separazione. 23 TITOLO DEL CAPITOLO Vedremo successivamente come: Nella GASCROMATOGRAFIA, i fattori di ritenzione possono essere variati modificando la temperatura e l'impacchettamento della colonna Nella CROMATOGRAFIA LIQUIDA, i fattori di ritenzione possono spesso essere manipolati per fornire separazioni migliori variando la composizione della fase mobile e della fase stazionaria, 2.3.5. Fattore di Selettività Il FATTORE DI SELETTIVITÀ, "α" di una colonna per i due soluti "A" e "B" è definito come: 𝐾0 𝛼= 𝐾+ Si tratta di un parametro che misura l’abilità di una colonna di separare due soluti diversi. 𝐾0 =costante di distribuzione del soluto "B", ovvero il soluto che è maggiormente trattenuto nella fase stazionaria, il che vuol dire che migra molto più lentamente. 𝐾+ =costante di distribuzione del soluto "A", ovvero il soluto che è poco trattenuto nella fase stazionaria, il che vuol dire che migra molto più velocemente. In accordo con questa definizione diremo che 𝛼 > 1 sempre. Sostituendo le equazioni dei FATTORI DI RITENZIONE: 𝐾+ 𝑉, 𝑘+ = 𝑉- 𝐾0 𝑉, 𝑘0 = 𝑉- Nella relazione del FATTORE DI SELETTIVITÀ, si ottiene: 𝑘0 𝛼= 𝑘+ Si tratta di un’equazione che mette in relazione il fattore di selettività con i fattori di ritenzione dei due soluti. 24  TITOLO DEL CAPITOLO A questo punto sostituendo le equazioni: 𝑡. − 𝑡- 𝑡, 𝑘+ = = 𝑡- 𝑡- 𝑡. − 𝑡- 𝑡, 𝑘0 = = 𝑡- 𝑡- Otteniamo la seguente definizione di fattore di selettività: (𝑡. )0 − 𝑡- 𝛼= (𝑡. )+ − 𝑡- Questa relazione mostra come i fattori di ritenzione e la selettività influenzino la risoluzione della colonna. 2.4. Allargamento di banda ed efficienza della colonna La quantità di allargamento della banda che si verifica quando un soluto passa attraverso una colonna cromatografica influisce fortemente sull'efficienza della colonna. Prima di definire l'efficienza delle colonne in termini quantitativi, esaminiamo i motivi per cui le bande diventano più ampie man mano che si spostano verso il basso di una colonna. La TEORIA DELLA VELOCITÀ descrive il movimento delle molecole di soluto attraverso una colonna cromatografica come un processo di CAMMINATA CASUALE. Questo significa che le molecole non si muovono in modo lineare o uniforme, ma piuttosto subiscono variazioni casuali nel loro percorso. Adesso forniamo un quadro generale del perché le bande si allargano e quali sono le variabili che migliorano l’efficienza della colonna. Se si esaminano i cromatogrammi mostrati sino ad ora, si vedrà che i picchi riguardo eluizione assomigliano molto alle CURVE GAUSSIANE. La tipica FORMA GAUSSIANA di una banda cromatografica può essere attribuita alla combinazione additiva dei movimenti casuali delle varie molecole mentre si muovono attraverso la colonna. Per definizione sappiamo che la ZONA DI INIEZIONE è l’area in cui il campione viene introdotto nella colonna. Quando il campione viene iniettato, si forma una banda di soluto. Questa banda ha una larghezza definita, che dipende da diversi fattori, tra cui il volume del campione iniettato e le condizioni operative. Affermando che la larghezza di iniezione non è il fattore limitante nella larghezza della banda di eluizione, si vuole dire che l’iniezione è stata eseguita in modo ottimale quindi la dispersione 25 TITOLO DEL CAPITOLO iniziale del campione è controllata, da cui ne consegue una LARGHEZZA DI BANDA molto stretta. Questo implica che l’iniezione è stata ottimizzata in modo da minimizzare l’allargamento iniziale (ma non si elimina l’allargamento che di verifica durante la separazione), dunque, per ottenere una buona separazione, bisogna tenere sotto controllo ulteriori fattori. Si consideri una singola molecola di soluto che subisce molte migliaia di trasferimenti tra la FASE STAZIONARIA e FASE MOBILE durante l'eluizione. Il tempo di permanenza in entrambe le fasi è altamente irregolare. Il trasferimento da una fase all'altra richiede energia e la molecola deve acquisire questa energia dall'ambiente circostante. Pertanto, il tempo di permanenza in una determinata fase può essere molto breve dopo alcuni trasferimenti e relativamente lungo dopo altri. Ricordiamo che il movimento attraverso la colonna può avvenire solo mentre la molecola è in fase mobile e non nella fase stazionaria. Di conseguenza, alcune molecole possono viaggiare rapidamente perché passano la maggior parte del tempo nella fase mobile, mentre altre possono rimanere bloccate nella fase stazionaria più a lungo, causando un ritardo. Il risultato di questi processi casuali è una DISTRIBUZIONE SIMMETRICA DELLE VELOCITÀ delle molecole. Anche se alcune molecole possono muoversi più rapidamente e altre più lentamente, in media, si crea una distribuzione attorno a un valore medio di velocità. Tuttavia, come si mostra in figura, alcuni picchi non sono ideali e presentano il fenomeno di TAILING o FRONTING. Tailing, il picco presenta una coda allungata verso destra, mentre la parte anteriore del picco è ripida. Fronting, il picco presenta un aumento ripido sulla parte anteriore per poi decrescere lentamente. 26 TITOLO DEL CAPITOLO 27 TITOLO DEL CAPITOLO 2.4.1. Descrizione quantitativa dell’efficienza della colonna Come detto in precedenza l’efficienza della colonna è un concetto fondamentale per valutare quanto bene una colonna separa i componenti di un campione. Due misure quantitative dell’efficienza della colonna sono: L’ALTEZZA DELLA PIASTRA "H" IL NUMERO DI PIATTI TEORICI "N". Questi sono relazionati attraverso l’equazione: 𝐿 𝑁= 𝐻 L'efficienza delle colonne cromatografiche aumenta con l'aumentare del numero di piatti "N" e con la riduzione dell'altezza della lastra "H" Il numero di piatti teorici (N) rappresenta il numero di fasi di equilibrio che un soluto attraversa nella colonna. Un valore elevato di (N) indica che ci sono molte opportunità per il soluto di interagire con la fase stazionaria, facilitando una migliore separazione. A seconda del tipo di colonna che si utilizza, si riscontrano notevoli differenze di efficienza. In particolare, possiamo dire che l’efficienza in termini di piatti può variare da poche centinaia a diverse migliaia, mentre le altezze delle lastre vanno da pochi decimi ad un millesimo di centimetro. Sappiamo che l’ampiezza di una curva gaussiana è descritta dalla deviazione standard "𝜎" e dalla varianza "𝜎 1 ". Poiché le bande cromatografiche sono spesso gaussiane e dato che l'efficienza di una colonna si riflette nell'ampiezza dei picchi cromatografici "𝐻", possiamo affermare la varianza per unità di lunghezza della colonna viene utilizzata dai cromatografi come misura dell'efficienza della colonna. Cioè l’efficienza della colonna "𝐻" è definita come: 𝜎1 𝐻= 𝐿 Quanto detto lo possiamo vedere qui in figura. La curva è di tipo gaussiana e si veda come le posizioni di 𝐿 + 1𝜎 e 𝐿 − 1𝜎, sono indicate da linee verticali tratteggiate. Dunque, "H" rappresenta una distanza lineare data dalla relazione sopra scritta. 28  TITOLO DEL CAPITOLO 2.4.2. Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna L'allargamento della banda riflette una perdita di efficienza della colonna. Per TRASFERIMENTO DI MASSA, intendiamo il processo attraverso il quale il soluto si distribuisce tra la fase mobile e la fase stazionaria. La velocità con cui avvengono questi trasferimenti ha un impatto diretto sulla larghezza della banda: Trasferimenti LENTI, le molecole trascorreranno più tempo nella fase stazionaria, che comporta un’inefficienza e un allargamento di banda. Trasferimenti VELOCI, le molecole trascorreranno meno tempo nella fase stazionaria, che comporta una riduzione dell’allargamento, migliorando l’efficienza. Alcune delle variabili che influenzano la velocità di trasferimento di massa sono controllabili e possono essere sfruttare per migliorarne le separazioni. In tabella si vedano le variabili più importanti da considerare. Generalmente, i cromatogrammi liquidi si ottengono a velocità di flusso lineari inferiori rispetto ai gascromatogrammi. Inoltre, come mostrato nelle figure le altezze delle piastre per le colonne cromatografiche liquide sono di un ordine di grandezza più piccole di quelle riscontrate con le colonne gascromatografiche. I diagrammi in questione prendono il nome di CURVE DI VAN DEEMTER E’ possibile affermare ciò in quanto i LIQUIDI hanno una viscosità e una diffusività più bassa rispetto ai gas, di conseguenza i soluti si diffondono molto più lentamente nelle fasi mobile dei liquidi rispetto a quelle gassose. Questo si traduce nell’ottenimento di piatti teorici più piccoli. 29 TITOLO DEL CAPITOLO Viceversa, i GAS hanno una viscosità e diffusività molto più alta rispetto ai liquidi, il che facilita un rapido trasferimento di massa tra la fase mobile e la fase stazionaria. Quest’elevata diffusività contribuisce anche ad una dispersione di rapida del soluto nella fase mobile, il che si traduce in una maggiore altezza delle piastre teoriche. 2.5. Teoria dell’allargamento di banda I ricercatori hanno dedicato un'enorme quantità di sforzi teorici e sperimentali allo sviluppo di relazioni quantitative che descrivano gli effetti delle variabili sperimentali elencate nella TABELLA sopra allegata sulle altezze delle piastre per vari tipi di colonne. Nessun modello è stato del tutto adeguato a spiegare le complesse interazioni fisiche e gli effetti che portano all'allargamento della zona e quindi ad una minore efficienza della colonna. Alcune delle equazioni, anche se imperfette, sono state molto utili, tuttavia, per indicare la strada verso un miglioramento delle prestazioni delle colonne. Una di queste la rappresenteremo qui. L'efficienza delle colonne cromatografiche capillari e delle colonne cromatografiche impaccate A BASSE VELOCITÀ DI FLUSSO può essere approssimata dall'espressione 𝐵 𝐻= + 𝐶, 𝑢 + 𝐶- 𝑢 𝑢 Equazione di VAN DEEMTER 𝐻=altezza del piatto 𝑢=velocità lineare della fase mobile. 𝐵=coefficiente di diffusione longitudinale 𝐶, e 𝐶- =coefficienti di trasferimenti di massa per la fase mobile e stazionaria. L’Equazione scritta in questa forma, vale per BASSE VELOCITÀ DI FLUSSO, sta ad implicare che le molecole di soluto hanno molto più tempo per diffondersi nella colonna. Ciò comporta ad una DISPERSIONE DEL PICCO, riducendole l’efficienza A ELEVATE VELOCITÀ DI FLUSSO in colonne impaccate dove gli effetti del flusso dominano la diffusione, l’efficienza può essere approssimata da: 𝐵 𝐻 =𝐴+ + 𝐶, 𝑢 𝑢 Equazione semplificata di VAN DEEMTER Oggi, consideriamo l'equazione di van Deemter appropriata solo per colonne impaccate ad alte velocità di flusso. Analizzeremo i termini presente nell’equazione sopra scritta. 30 TITOLO DEL CAPITOLO 31 TITOLO DEL CAPITOLO 𝑩 TERMINE DI DIFFUSIONE LONGITUDINALE " 𝒖 ” La diffusione è un processo in cui le specie migrano da una parte più concentrata di un mezzo a una regione più diluita. Il tasso di migrazione è direttamente proporzionale alla differenza di concentrazione tra le regioni (concentrata/diluita) e il coefficiente di diffusione "𝐷- ". Maggiore sarà la differenza di concentrazione tra le due regioni, maggiore sarà la velocità alla quale le molecole si muovono dalla regione ad alta concentrazione a quella di bassa concentrazione. Il termine "𝐷- " è una misura della MOBILITÀ di una sostanza in un dato mezzo. Si tratta di una costante per una data specie ed è legato alla velocità di migrazione in quel mezzo. In altre parole, misura quanto velocemente una specie può spostarsi sotto un gradiente di concentrazione. (il gradiente di concentrazione è la differenza di concentrazione tra le due zone) LA DIFFUSIONE LONGITUDINALE è uno dei principali fenomeni che influenzano l’efficienza della separazione del soluto lungo la colonna. Sappiamo che inizialmente le molecole di soluto all’interno della colonna, si distribuiscono in una banda relativamente concentrata in una zona specifica della colonna. Tuttavia, il soluto non rimane confinato in una stretta banda concentrata, in quanto le molecole tenderanno a diffondersi. La diffusione longitudinale è una fonte comune di allargamento della banda nella GASCROMATOGRAFIA, dove la velocità di diffusione delle molecole è elevata. Il fenomeno è di scarsa importanza nella CROMATOGRAFIA LIQUIDA, dove le velocità di diffusione sono inferiori. Come visto nella seguente equazione 𝐵 𝐻= + 𝐶, 𝑢 + 𝐶- 𝑢 𝑢 Il contributo della diffusione longitudinale all’altezza del piatto è INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla velocità lineare dell’eluente. 32  TITOLO DEL CAPITOLO - Velocità di flusso BASSA, il tempo di permanenza del soluto in colonna è maggiore dando più tempo per la diffusione longitudinale a dispiegarsi. La banda del soluto si allarga più rapidamente lungo la colonna, aumentandone il valore di "H" - Velocità di flusso ALTA, il soluto trascorre meno tempo nella colonna, riducendo il tempo a disposizione per la diffusione longitudinale, che avrò meno effetto sulla dispersione del soluto. Prendendo in considerazione i suddetti grafici, le diminuzioni iniziali di "H" sono un risultato diretto della diffusione longitudinale. La notevole differenza nelle altezze delle piastre mostrata dalle due curve può anche essere spiegata considerando i coefficienti di diffusione. In particolare, diremo che i mezzi gassosi hanno ordini di grandezza maggiori rispetto ai liquidi. Pertanto, l'allargamento della banda si verifica in misura molto maggiore nella gascromatografia rispetto alla cromatografia liquida TERMINE DI TRASFERIMENTO DI MASSA, DELLA FASE STAZIONARIA 𝑪𝑺 𝒖 Quando la fase stazionaria è un liquido immobilizzato, il coefficiente di trasferimento di massa del soluto "𝐶, 𝑢" tra la fase mobile e stazionaria è direttamente proporzionale al quadrato dello spessore del film sulle particelle di supporto "𝑑51 " ed inversamente proporzionale al coefficiente di diffusione "𝐷6 " del soluto nel film. Il fatto che "𝐶, 𝑢" sia direttamente proporzionale ad 𝑑51 , significa che se lo spessore del film aumenta, il trasferimento di massa diventa più lento. Per quanto riguarda la condizione in cui "𝐶, 𝑢" sia inversamente proporzionale ad "𝐷, " implica che un basso coefficiente di diffusione riduce la velocità di trasferimento di massa tra le due fasi, aumentandone quindi l’altezza del piatto teorico, RIDUCENDONE L’EFFICIENZA DELLA COLONNA 33 TITOLO DEL CAPITOLO TERMINE DI TRASFERIMENTO DI MASSA, DELLA FASE MOBILE "𝑪𝑴 𝒖" I processi di trasferimento di massa che avvengono nella fase mobile sono sufficientemente complessi da non avere ancora una descrizione quantitativa completa. D’altra parte, abbiamo una buona comprensione qualitativa delle variabili che influenza l’allargamento della banda, portando a grande miglioramento in tutti i tipi di colonne cromatografiche. "𝐶- " è inversamente proporzionale al coefficiente di diffusione dell’analita nella fase mobile "𝐷- ". Un coefficiente di diffusione maggiore migliora l’efficienza del trasferimento di massa nella fase mobile, riducendo il valore di "𝐻". Per COLONNE IMPACCATE intendiamo colonne cui il materiale di riempimento è costituito da particelle solide attraverso le quali scorre la fase mobile. Diremo che "𝐶- " è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle del materiale utilizzato per l’impaccamento "𝑑81 ". Diminuendo il diametro delle particelle dell’impaccamento, si riduce il contributo di "𝐶- " migliorando l’efficienza della colonna e riducendo l’altezza del piatto teorico "𝐻". Per COLONNE CAPILLARI intendiamo colonne cui non sono presenti particelle di impaccamento. La fase stazionaria è distribuita come un film sottile lungo la superficie interna della colonna e la fase mobile scorrerà attraverso lo spazio vuoto centrale. Diremo che "𝐶- " è direttamente proporzionale al quadrato del diametro della colonna "𝑑*1 "ed è una funzione della portata. Colonne capillari con diametro stretto, riducono il valore di "𝐶- " migliorandone l’efficienza. Il contributo "𝐶- 𝑢" all'altezza della piastra è il prodotto del coefficiente di trasferimento di massa "𝐶- " (funzione della velocità del solvente) e della velocità del solvente stesso. Pertanto, il contributo netto all'altezza della piastra non è lineare in "u" ma ha una dipendenza complessa dalla velocità del solvente. Quanto detto lo rappresentiamo in figura. LINEA VERDE 34  TITOLO DEL CAPITOLO L'allargamento della zona nella fase mobile è dovuto in parte alla moltitudine di percorsi attraverso i quali una molecola (o uno ione) si fa strada attraverso una colonna impaccata. Le lunghezze di questi percorsi possono differire in modo significativo. Questa differenza significa che i tempi di permanenza nella colonna per molecole della stessa specie variano. Questo effetto di percorso multiplo chiamato DIFFUSIONE PARASSITA. Tale fenomeno è in parte indipendente dalla velocità del solvente se non fosse compensato dalla diffusione ordinaria (ovvero al movimento casuale delle molecole in risposta ad un gradiente di concentrazione). La diffusione ordinaria tende a uniformare le concentrazioni, riducendo quindi l’impatto dell’allargamento del picco dovuto ai percorsi multipli. In altre parole, alcune molecole che potrebbero impiegare più tempo a causa di un percorso tortuoso possono essere compensate da molecole che si muovono più rapidamente lungo percorsi più diretti. Sovrapposto all'effetto di diffusione parassita è quello che deriva da POZZE STAGNANTI della fase mobile trattenute nella fase stazionaria. Quando un solido funge da fase stazionaria, i suoi pori sono riempiti con volumi statici di fase mobile. Le molecole di soluto devono quindi diffondersi attraverso questi pozzi stagnanti prima che possa avvenire il trasferimento tra la fase mobile in movimento e la fase stazionaria. Questo introduce un ulteriore TEMPO DI PERMANENZA per le molecole, poiché non possono semplicemente muoversi direttamente dalla fase mobile alla fase stazionaria. Devono prima attraversare le aree di volume statico. Questa situazione si applica non solo alle fasi stazionarie solide, ma anche alle fasi stazionarie liquide. Nelle fasi liquide immobilizzate, le molecole di solvente non riempiono completamente i pori, causando un ritardo nella separazione in quanto le molecole di soluto devono passare attraverso il liquido immobilizzato e raggiungere la superficie della fase stazionaria. EFFETTO DELLA VELOCITA' DI FASE MOBILI SUI TERMINI DELL'EQUAZIONE DI VAN DEEMTER. In figura rappresentiamo la variazione dei tre termini dell'equazione di VAN DEEMTER in funzione della velocità della fase mobile. La curva superiore è la somma dei vari effetti. LINEA ARANCIONE 35 TITOLO DEL CAPITOLO RIASSUNTO DEI METODI PER RIDURRE L’ALLARGAMENTO DELLA BANDA Per le colonne impaccate, una variabile che influisce sull'efficienza della colonna è il diametro delle particelle che compongono l'impaccamento. In questo caso l’allargamento della banda è ridotto al minimo grazie ai piccoli diametri delle particelle. Per le colonne capillari, il diametro della colonna stessa è una variabile importante. In questo caso i diametri delle colonne più piccoli riducono l’allargamento della banda. L’effetto del diametro delle particelle è mostrato qui in figura per la gascromatografia. Con le fasi mobili gassose, la velocità di diffusione longitudinale può essere ridotta sensibilmente abbassando la temperatura e quindi il coefficiente di diffusione. Il risultato è un'altezza delle lastre SIGNIFICATIVAMENTE PIÙ PICCOLA a temperature più basse. Questo effetto di solito non è evidente nella cromatografia liquida perché la diffusione è abbastanza lenta che il termine di diffusione longitudinale ha scarso effetto sull'altezza complessiva della piastra. 2.6. Risoluzione della colonna La risoluzione, "𝑅, " di una colonna indica quanto siano distanti due bande rispetto alle loro larghezze. La risoluzione fornisce una misura quantitativa della capacità della colonna di separare due analiti. L'importanza di questo termine è illustrata in figura, che consiste in cromatogrammi per le specie A e B su tre colonne con diversi poteri risolutivi. La risoluzione di una colonna è data da: Δ𝑍 Δ𝑍 2[(𝑡. )0 − (𝑡. )+ ] 𝑅, = = = 𝑊+ 𝑊0 𝑊+ + 𝑊0 𝑊+ + 𝑊0 + 2 2 𝛥𝑍 =distanza tra i picchi delle due bande (analita A e B) 𝑊+ , 𝑊0 =larghezze dei picchi A e B (𝑡. )0 ; (𝑡. )+ =tempi di ritenzione 36  TITOLO DEL CAPITOLO 2.7. Interazioni soluto-fasi Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti INTERAZIONI: legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waals formazione di composti di interazione attrazione coulombiana Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico 37 TITOLO DEL CAPITOLO CAPITOLO 3: SPETTROSCOPIA ATOMICA I metodi spettroscopici atomici sono utilizzati per la determinazione qualitativa e quantitativa di oltre 70 elementi. In genere, questi metodi possono rilevare parti per milione, parti per miliardi e in alcuni casi, concentrazioni anche più piccole. I metodi spettroscopici atomici sono anche rapidi, convenienti e di solito di alta selettività. Questi metodi possono essere suddivisi in due gruppi: - SPETTROMETRIA ATOMICA OTTICA - SPETTROMETRIA DI MASSA ATOMICA Il primo passo in tutte le procedure spettroscopiche atomiche è L’ATOMIZZAZIONE, un processo in cui un campione viene volatilizzato e decomposto in modo tale da produrre atomi e ioni in fase gassosa. L'efficienza e la riproducibilità della fase di atomizzazione possono avere una grande influenza sulla sensibilità, la precisione e l'accuratezza del metodo. In breve, l'atomizzazione è un PASSAGGIO CRITICO nella spettroscopia atomica. In tabella evidenziamo diversi metodi utilizzati per atomizzare i campioni per la spettroscopia atomica Una volta che il campione è stato convertito in atomi o ioni gassosi, è possibile eseguire vari tipi di spettroscopia. Consideriamo qui solo i METODI SPETTROMETRICI OTTICI. Con gli atomi o gli ioni in fase gassosa, NON ci sono stati di energia vibrazionale o rotazionale. Questa assenza significa che si verificano solo TRANSIZIONI ELETTRONICHE. Pertanto, gli spettri di emissione atomica, assorbimento e fluorescenza sono costituiti da un numero limitato di LINEE SPETTRALI STRETTE. 38  TITOLO DEL CAPITOLO 3.1. Spettro di emissione Nella SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE ATOMICA, per eccitare gli atomi dell'analita è necessario fornire energia sufficiente (calore o energia elettrica) a promuovere gli elettroni dagli stati fondamentali a stati energetici maggiori. L'energia è tipicamente fornita da un plasma, una fiamma, una scarica a bassa pressione o da un laser ad alta potenza. In figura rappresentiamo un diagramma del livello di energia parziale per il sodio atomico che mostra la sorgente di tre delle linee di emissione più importanti. Prima che venga applicata la fonte di energia esterna, gli atomi di sodio sono solitamente nel loro stato di energia più bassa o anche detto FONDAMENTALE. L'energia applicata fa sì che gli atomi si trovino momentaneamente in uno stato di energia più elevata o anche detto ECCITATO. Una transizione che avviene da o verso lo stato fondamentale di un atomo è definita TRANSIZIONE DI RISONANZA. La linea spettrale corrispondente a questa transizione è nota come LINEA DI RISONANZA. In figura rappresentiamo una serie di spettri di emissione, inerenti a degli elementi specifici. In soldoni uno spettro di emissione è del tutto nero, con delle linee colorate che indicano l’emissione di quel determinato elemento ad un certo valore di lunghezza d’onda. 39 TITOLO DEL CAPITOLO 3.2. Spettro di assorbimento Nella SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO ATOMICO, una sorgente esterna di radiazioni colpisce il vapore dell'analita (ovvero l’elemento da analizzare in forma gassosa). Se la radiazione sorgente è della frequenza (lunghezza d'onda) appropriata, può essere assorbita dagli atomi dell'analita e promuoverli a stati eccitati. La figura mostra tre delle diverse linee di assorbimento per i vapori di sodio. La sorgente di queste righe spettrali è indicata nel diagramma di energia parziale mostrato in Figura. Dopo alcuni nanosecondi, gli atomi eccitati si rilassano al loro stato fondamentale trasferendo la loro energia in eccesso ad altri atomi o molecole nel mezzo. In figura rappresentiamo uno SPETTRO DI ASSORBIMENTO. In soldoni uno spettro di assorbimento è colorato, con delle linee scure che indicano l’assorbimento di quel determinato elemento ad un certo valore di lunghezza d’onda. 40  TITOLO DEL CAPITOLO 3.3. Larghezza delle linee spettrali atomiche Le LINEE SPETTRALI ATOMICHE hanno larghezze finite. Con gli spettrometri ordinari, come quello usato per acquisire lo spettro in figura, la larghezza delle linee osservate è principalmente influenzata dalle caratteristiche dello strumento e non dalle proprietà intrinseche del sistema atomico Con spettrometri ad altissima risoluzione o con interferometri, è possibile misurare le larghezze effettive delle linee spettrali, cioè quelle dovute a proprietà fisiche reali degli atomi. Diversi fattori contribuiscono alla larghezza delle linee spettrali atomiche tra cui: -ALLARGAMENTO NATURALE ALLARGAMENTO COLLISIONALE ALLARGAMENTO DOPPLER 3.3.1. Allargamento naturale L'ampiezza naturale di una linea spettrale atomica è determinata dalla durata dello stato eccitato e dal principio di indeterminazione di Heisenberg. A causa del PRINCIPIO DI INDETERMINAZIONE, più breve è il tempo di vita dello stato eccitato, maggiore sarà l'indeterminazione sull'energia, e quindi più ampia sarà la linea spettrale. La durata radiativa tipica degli atomi è dell'ordine di 10!9 𝑠, portando a larghezza naturali dell’ordine di 10!: 𝑛𝑚 3.3.2. Allargamento Collisionale Le collisioni tra atomi e molecole in fase gassosa causano la disattivazione dello stato eccitato, portando a un allargamento della linea spettrale. Questo fenomeno, noto come ALLARGAMENTO COLLISIONALE, aumenta all'aumentare della concentrazione dei gas, ovvero con l'aumento delle PRESSIONI PARZIALI dei partner di collisione. Per questo motivo, l'allargamento collisionale è spesso chiamato ALLARGAMENTO DI PRESSIONE. Inoltre, l'allargamento dovuto alla pressione cresce con l'aumento della TEMPERATURA in quanto la cinetica delle particelle aumenta, causando urti più frequenti. L'allargamento collisionale dipende fortemente dal mezzo gassoso. 41 TITOLO DEL CAPITOLO 3.3.3. Allargamento doppler L'ALLARGAMENTO DOPPLER è il risultato del rapido movimento degli atomi che emettono o assorbono radiazioni. Gli atomi che si muovono verso il rivelatore emettono lunghezze d'onda leggermente più corte delle lunghezze d'onda emesse dagli atomi che si muovono perpendicolarmente rispetto al rivelatore, in quanto non avviene uno spostamento effettivo rispetto al detector. Questa differenza è una manifestazione del noto EFFETTO DOPPLER. Vi è un effetto inverso nel caso in cui gli atomi si allontanano dal rilevatore. L’EFFETTO DOPPLER provoca anche l'allargamento delle linee di assorbimento. Questo tipo di allargamento diventa più pronunciato all'aumentare della temperatura della fiamma a causa dell'aumento della velocità degli atomi. 3.4. Produzione di atomi e di ioni In tutte le tecniche spettroscopiche atomiche, il campione deve essere atomizzato, convertendolo in atomi e ioni in fase gassosa. I campioni di solito entrano nell'atomizzatore in soluzione, anche se a volte introduciamo gas e solidi. Il dispositivo deve convertire l’analita d’interesse da: soluzione −−>gas/vapore−−>atomi e/o ioni. 3.4.1. Sistemi di introduzione dei campioni I dispositivi di atomizzazione si dividono in due classi: ATOMIZZATORI CONTINUI Con gli atomizzatori continui, come plasma e fiamme, i campioni vengono introdotti in un flusso costante e continuo. Il fatto che sia continuo, s’intende che l’atomizzatore sottopone costantemente il campione a condizioni di elevate temperature sufficienti per avviare l’atomizzazione. ATOMIZZATORI DISCRETI. Con gli atomizzatori discreti, i singoli campioni vengono iniettati per mezzo di una siringa o di un autocampionatore. L'atomizzatore discreto più comune è L’ATOMIZZATORE ELETTROTERMICO. 42 TITOLO DEL CAPITOLO 43 TITOLO DEL CAPITOLO Illustreremo graficamente i metodi di introduzione dei campioni in soluzione, nel plasma e nelle fiamme. Tra questi la NEBULIZZAZIONE DIRETTA è il metodo più comunemente utilizzato. In questo processo, il NEBULIZZATORE introduce in modo continuo il campione sotto forma di un sottile spruzzo di goccioline, chiamato AEROSOL. (stiamo dunque parlando di un atomizzatore continuo) Quando un campione viene introdotto continuamente in una fiamma o in un plasma, si raggiunge uno stato di equilibrio in cui si stabilisce una popolazione costante di atomi, molecole e ioni. Quando si utilizza L'INIEZIONE A FLUSSO o la CROMATOGRAFIA LIQUIDA, il campione viene introdotto con una concentrazione che varia nel tempo. A differenza della nebulizzazione diretta, il campione non viene immediatamente nebulizzato in un aerosol. Questo processo genera una popolazione di vapore che cambia in funzione della concentrazione del campione che può portare a una popolazione di atomi, molecole e ioni non costante.Per ottenere atomi liberi o ioni elementari, devono avvenire una serie di complessi processi di atomizzazione e ionizzazione. I campioni solidi possono essere introdotti nei plasmi vaporizzandoli con una scintilla elettrica o con un raggio laser. La volatilizzazione laser, spesso chiamata ABLATION LASER è diventata un metodo popolare per l'introduzione di campioni in plasmi accoppiati induttivamente. 3.4.2. Sorgenti di plasma Gli atomizzatori al plasma offrono diversi vantaggi per la spettroscopia atomica analitica. Un PLASMA è una miscela gassosa conduttrice, contenente concentrazioni relativamente elevate di ioni ed elettroni. Nel plasma di argon utilizzato per la spettroscopia atomica, gli ioni argon e gli elettroni sono le principali specie conduttrici, sebbene contribuiscano anche i cationi del campione. Una volta che gli ioni argon si sono generati nel plasma, sono in grado di assorbire energia. Questa energia è sufficiente a mantenere la temperatura del plasma a livelli elevati, che possono raggiungere fino a 10.000K. A queste temperature, gli ioni di argon possono subire un ulteriore IONIZZAZIONE mantenendo il plasma in uno stato attivo per un tempo indeterminato. In altre parole, il plasma può continuare