Clarification: Cell separation techniques. PDF

Clarification 생물분리정제 세포배양공정 Provided by Clarification Clarification이란? 정제여과 1. 정의 Clarification은 바이오의약품 생산 공정(Downstream Process)에서 세 포 배양 후 얻은 배양액에서 세포,∅ 찌꺼기, 입자성 불순물 등을 제거하 여 맑은 단백질 용액(clarifie...

Clarification 생물분리정제 세포배양공정 Provided by Clarification Clarification이란? 정제여과 1. 정의 Clarification은 바이오의약품 생산 공정(Downstream Process)에서 세 포 배양 후 얻은 배양액에서 세포,∅ 찌꺼기, 입자성 불순물 등을 제거하 여 맑은 단백질 용액(clarified harvest)을 얻는 초기 정제 단계 으로 뭉침 * aggregation (응집 불순물이 ) 많으면 단백질들이 hydrophobic interaction = 용해도 저하 기능 사라지거나 변성됨 2. 주요 목적 물리적 불순물 제거: 세포, 세포, 세포 잔해(cell debris), inclusion body 제거 → 동물세포가 아닌 세포에서 단백질이 과발현되어 aggregafion됨. 후속 장비 보호: 크로마토그래피 컬럼 막힘 방지 정제 효율 향상: UF, Sterile filter 막힘 방지 제품 품질 확보: 불순물 제거로 단백질 안정성 증가 = 단백질 aggregation 방지 3. 주요 공정 및 방법 O세포잔해 (찌 " 나 큰 inclusion body Centrifugation Clarification: 원심력을 이용해 큰 입자 제거(주로 세포) Depth filtration: 입체 구조 필터로 세포 잔해 제거 (다공성 섬유층) ↓ ( 다층구조 필터 ) Microfiltration: 0.1~0.45 μm 막 필터로 미세입자 제거 (작은 기공 크기 ) ㅅ 충간크기북목이 세포잔해 ㆁ 미세한 세포 잔해 , 미생물 마지막 polishing , 4. 공정 흐름 단계  원심력 회전하는 물체가 밖으로 튕겨 나가려는 원심분리란? [ , 것처럼 느껴지는 가상의 힘 구심력 : 어떤 물체가 원운동을 할 때 그 , 물체를 원의 중심으로 잡아당기는 힘 원심력 이나 구심력을 이용하여 물질을 분리하는 방법. 분리 대상의 크기와 밀도에 따라 기체+기체, 액체+고체, 액체+액체, 등 혼합물의 분리가 가능하다. 원심분리란?  원심력, 구심력 반지름(r) 각속도(ω) 원심분리기의 성능은 중력에 대하여 몇 배의 원심력이 생기는 가에 따라 결정되며 이를 원심효과라 한다 2 원심력의 크기는 질량(m) x 반지름(r) x 각속도제곱(ω) 이므로 원심효과는 원심분리기의 반지름과 회전속도에 의해 결정된다  RCF, xg, rpm 2 원심력 = 질량 * 반지름 * 각속도 원심분리기의 반지름과 원심분리 할 material의 질량은 이미 정해져 있기 때문에 원심력의 조절을 위해서 각속도(rpm)를 조절한다. 각 원심분리기 마다 반지름의 크기가 다르기 때문에 각속도만으로는 원심력의 조절이 어렵기 때문에 상대원심력 RCF(xg)를 사용한다. g는 중력가속도로 원심력이 중력의 몇 배 작용하는가를 의미한다. 원심분리기의 종류나 반지름에 무관하게 원심력이 가해지는 정도를 알 수 있다  원심분리기 분류 -원심분리방법에 따른 분류 입자크기와 밀도 차이에 따라 분리함 편차원심분리(differential centrifugation) ⇒ 단계적으로 분리 가능 - 일반적인 원심분리 방법으로 물질의 침강속도의 차이를 이용한 방법.가장 큰 입자가 먼저 침전되고 질량과 밀도가 같을 때는 구형에 가까운 입자가 먼저 침전된다. 짧은 시간 낮은속도에선 무거운입자만 침전되다 , 마찰이적기때문에먼저침전. 점점 빠르고 오래돌리면 더 작은 입자도 침전됨  원심분리기 분류 -원심분리방법 분해물질 loading 매질과 같은 밀도의 ↓ 입자가 분리됨. 80% 60% 70% 40% or 30% 20% 10% Sucrose 고르게 분산 밀도기울기원심분리(differential centrifugation) -밀도 차를 가지는 매질을 이용한다. 튜브에 매질을 밀도 차를 두어 채우고 시료를 매질의 가장 윗부분에 주입하거나 매질전체에 고르게 분산시킨 후 원심분리 하면 각 매질의 밀도와 같은 물질들이 분리되어 위치하게 된다  원심분리기 분류 -원심분리기 성능에 따른 분류 분류 rpm xg 용도 ㆁ 저속원심분리기 ~6,000 ~6,000 세포, 핵 등 (low-speed centrifuge) 비교적 쉽게 침전되는 시료 ㆁ 고속원심분리기 ~25,000 ~60,000 밀도기울기원심분리에 이용가능, 세포, 핵, (high speed centrifuge) 세포 내 소기관 분류 주로 밀도기울기 원심분리에 이용. 세포, 핵, ㅇ 초원심분리기 ~80,000 ~600,000 세포 내 소기관, 세포막 구성성분, 라이보좀, 폴리좀, (ultracentrifuge) 거대분자 분리가능 원심분리기 로터에 따른 분류 1. 수평 로터 (Swinging-Bucket Rotor) 회전 시 튜브가 수평 위치로 이동 정지 수직 회전 수평 : , : 분리 층이 수평으로 생겨 깔끔한 계면 형성 밀도 구배 원심분리, 혈장/혈청 분리에 적합 단점 회전 안정성이 떨어져 최대 속도 낮음 회전 정지 ,. 때 진동 ex: Ficoll gradient, 혈액 성분 분리 1 바닥에 수평으로 가라앉음 입자가 튜브 마주보는 튜브 수평 ( 경계가 평평하게 형성되어 고순도 분리 가능 ] 맞아야됨 2. 고정각 로터 (Fixed-Angle Rotor) 튜브가 경사진 채 고정 (25~45°) 입자는 튜브 벽을 따라 빠르게 침전 빠른 속도, 짧은 시간, 높은 효율 단점 경계 흐려짐 약간의 시료손실 가능 : , ex: 세포 수확, DNA/단백질 침전 입자가 튜브 벽을 따라 비스듬히 가라앉음 ( = 침전물이 측면에 삼각형처럼 쌓임 ) 3. 수직 로터 (Vertical Rotor) ( 평행한 방향 ) 튜브가 회전축에 수직 방향으로 고정 밀도 구배가 얇게 형성되어 분리 시간 짧음 층 분리가 매우 뚜렷하고 빠름 → 분리 속도 가장 빠름 단점 분리 후 시료채취 어려움 완벽한 층분리 어려움 : , ex: 바이러스, 플라스미드, DNA 밴드 분리 (CsCl gradient) 입자가 튜브 측면으로 매우 짧은 거리만 이동 ( = 아주 빠른 분리 가능 ) 연속 흐름 로터 (Continuous-Flow Rotor; Zonal rotor) 시료를 연속적으로 주입하여 분리 대량 생산에 적합 (예: CHO cell 배양액 처리) 단점 분리 경계가 명확하지 않고 장비가 복잡함 … ex: 산업용 세포 수확, 백신 생산 시 원료 정제 2. Centrifugation 1. 원심분리(Centrifugation) 회전하는 basket 안에 사료를 넣고 원심력을 이용해 고체와 액체 분리 내부에 바스켓 모양 드럼 이 있고 바스켓 벽에는 , 있음 필터 역할의 미세한 구멍이. ⇒ 시료를 넣고 회전시키면 고체는 filter에 붙고 액체는 구멍을 통해 밖으로 빠져나감. 2. Centrifugation 201000 -G 000 orpm ) 액체 액체 분리 원통 튜브가 고속회전하면서 액체 - 고체 - 매우 긴 아 2. Centrifugation : 회전하는 원통형 bow) 과 나선형회전자( 스크류 ) 가 같이 돌아가면서 액체고체 혼합물을 연속적으로 분리. ⇒ 연속적 Soltd liquid - 분리 가능 안에는 회전하는 원통형볼과 그 안에서 독립적으로회전하는 스크류 ( Screw Conveyor ) 가 있음. 시료(슬러리 )를 넣으면 원심력에 의해 고체는 바깥벽으로 밀리고 스크류가 고체를 완전히 한 쪽 , 끝으로 밀어냄 액체는 반대쪽 끝에서 빠져나감. 2. Centrifugation 내부에 얇은 디스크들이 수십장 겹쳐져 있음 → 시료가 디스크 사이를 통과하면서 원심력과 디스크 사이 표면력으로 solid - liquid 가 효율적으로 분리 ⇒ 안에 수십 수백개의 - 원형 Plate ( cone) 가 기울어진 상태로 겹쳐져 있음 디스크 사이얇은 공간을 통해 시료가 흘러들어감 회전시 ,고형입자는바깥쪽으로 밀려나 디스크 표연에 붙고 액체는 중심방향으로 흘러나감.  산업용 디스크형 원심분리기 제원 제조사 : GEA ( Westfalia Seperator AG) 모델명 : CSE 80 – 06 – 477 (Steam - Sterilizable Separator) 설치장소 : Harvest room (M111) 특징 : Hydraulic system을 채용한 연속식 centrifuge 10  제원 컨트롤박스(PLC) 기계 전체 자동 제어 시스템 전원스위치 기기 on/off 제어 챔버 시료 투입 속도센서 모터 회전 속도 측정장치 PLC와 연동되어 정확한 속도 고속 회전 동력원 유지+안전 제어 가능 동력전달부 모터에서 생성된 회전 에너지 챔버로 전달 브레이크 분리 후 고속으로도는 로터 회전 정지시키는 장치 11  구조 IN ( 시료주입구 ) : Clarification 대상 시료가 들어감 OUT ( 정제된 상등액출구 ) : 고형물제거된 단백질용액이 나감 CELL ( 고형물 참전물 ) ( : 무거운 세포찌까기 등이 챔버 외곽으로 밀려남 Bowl내부 12  구조 - chamber 배양액이 중앙축으로유입. in o 애t 상부 – in/out 고속회전후 정제된 상등액이 중심으로 다시 모여 중앙 배출관 통해 탈출. 하부 – separation 고속회전 + 디스코 스택을 디스크 통해 물리적 분리 스택 13  구조 - chamber : 시료가 투입되는 공간이며, 내부에 디스크들이 겹겹이 쌓여있음. 고속회전하면서 세포 찌꺼기 같은 고형물은 디스크 외곽으로 밀려나고, 액체는 중심으로 배출됨. 겹겹이 서쌓인 디스크 14  Operation- Feed flow IN OUT 15  Operation- Feed flow OUT 침전물= CELL 16  Operation- Feed flow = 시료 유입 흐름 원심력 ⚫ Disk Bowl - 내부에 disk가 적층된 형태 ⚫ 회전으로 인한 원심력이 수평방향으로 걸려 Bowl의 rpm이 높을수록 disk의 반지름이 클수록 분리가 잘 되는 구조 이다 ⚫ ‘Feed가 얼마만큼 원심력에 노출되는 가’ Bowl과 disk의 크기는 미리 정해지기 때문에 Settling distance 이것이 분리효율에 가장큰 영향을 미친다 ⚫ Disk를 많이 쌓을수록 배양액의 접촉면적이 늘어 나 분리에 유리하다. 또한 disk사이가 가까우면 settling distance가 형성되어 세포의 침전에 유리해 진다 Cell : 바깥쪽 벽에 부착 [ liquid : 안쪽을 통해 다시 상부로 모여 배출 반지름 17  Hydraulic system ( 유압 시스템 ) - operation water를 이용하는 operation 방식. Feed, 분리, 배출, product 의 송출에 추가적인 장비 없이 operation water와 disk의 회전력만을 이용하는 구조. 밀폐구조가 가능하여 외부오염 방지에 유리하다 ⇒ 자동 배출 ( ejection )을 위한 압력 제어 시스템 Partial/total ejection Centripetal pump Flow rate / Back pressure Sliding ring water chamber에 물 공급 유압 발생 이 유압이 슬라이딩 볼트를 밀어 올리거나 내리면서 배출 포트를 개폐. 압력에 따라 내부 구조가 움직이기 때문에, 기계 정지 없이도 슬러지 제거 가능 = 연속 운전 가능 18  ➡ 「 Hydraulic system - Ejection : 고형물 자동 배출 고형물이 일정량 이상 쌓이면, PLC나 수동 제어에 따라 유압을 가함, 슬라이딩 볼트가 내려가면서 챔버 바닥에 슬라이딩 피스톤이 열림 원심력에 의해 벽에 붙어있던 고형물들 한순간에 챔버 외부로 튀어나감 Ejection : 원심분리 중 분리된 cell을 방출하는 step. Sliding piston과 operation water를 이용하여 수행한다 Partial ejection : Feed의 공급을 멈추지 않은 채 cell의 일부를 방출 유압제어량 에 = Total ejection : Feed의 공급을 중단하고 cell 전체를 방출 = 유압 세게 Sliding piston 19 Microfiltration(미세여과)이란? 1. 정의 membrane filter = 기공 크기 0.1 ~ 1.0 μm의 필터를 사용하여 세균, 세포 잔해, 큰 입자 등을 제거하는 공정 일반적으로 세포 제거, cell harvest 후의 clarification, 또는 inclusion body 제거 등에 사용됨 + 압력차를 이용해 액체를 여과악으로 통과시키면서 큰 입자는 막에 걸리고 , 작은 분자는 통과하게 함 2. 주요 목적 세포 또는 세포 잔사 제거 Suspension clarification (불용성 고형물 제거) 3. Ex) CHO 세포 또는 박테리아 배양액에서 세포 제거 inclusion body 회수 전, 세포 잔사 제거 바이러스 정제 전 large debris 제거 Depth filter란? Depth filter는 주로 세포 수확(clarification) 단계의 microfiltration에서 사용. 배양된 세포 배양액을 수확할 때, 세포와 세포 잔해물을 효과적으로 제 거하여 후속 정제 공정의 효율성을 높임. 이 단계에서 depth filter는 원심분리기와 함께 사용되거나 단독으로 사 용 원심분리 후 남은 미세한 입자나 콜로이드를 제거하는 데에도 활용 Depth filter의 원리 Depth filter는 다공성 필터 매질의 두께를 활용하여 입자를 포획하는 방식으로 작동 액체가 필터를 통과할 때, 입자들은 필터 매질의 복잡한 경로를 따라 이동하며 다 양한 메커니즘(직접 차단, 관성 충돌, 전기적 흡착 등)에 의해 포획 이러한 구조로 인해 표면 필터와 달리 더 많은 입자를 포획할 수 있으며, 높은 탁 도와 입자 부하를 가진 액체의 정제에 적합 Depth filter의 이용 배양액 특성에 적절한 filfer선택( 2 개) 등급의 1. 필터 선택: 처리하려는 배양액의 특성(예: 세포 밀도, 입자 크기 분포)에 따라 적절한 등급의 depth filter를 선택. 일반적으로 두 단계의 필터링이 사 용되며, 첫 번째 단계에서는 큰 입자를 제거하고, 두 번째 단계에서는 더 작 은 입자를 제거 2. 설치: 선택한 depth filter를 필터 하우징에 올바르게 장착하고, 시스템이 밀폐되어 누출이 없도록 확인 필터까우는 케이스 ( 지지 압력에 견디게 도움 ). 3. 플러싱: 필터를 사용하기 전에 적절한 세척 용액으로 플러싱하여 제조 과 정에서 남아 있을 수 있는 보존제나 미립자를 제거 설비 내부 불순물 세척 시 유체 흘려보냄 4. 여과: 배양액을 일정한 유속으로 필터에 통과시켜 세포와 잔해물을 제거 합니다. 이때 압력 강하를 모니터링하여 필터의 포화 상태를 확인 5. 교체: 압력 강하가 허용 범위를 초과하거나 여과 효율이 감소하면 필터를 교체  TM Zeta Plus a. Cellulose (셀룰로오스) – 구조적 뼈대 천연 섬유질 소재로 depth filter의 기본 매트릭스 역할 다공성 구조를 제공해 물리적 입자 포획을 가능하게 함 다층 구조로 입자가 매체 깊숙이 침투하면서 점진적으로 걸러짐 b. Filter Aid (여과 보조제) – 다공성 증진 및 입자 포획력 향상 보통 diatomaceous earth (규조토) 또는 perlite (펄라이트) 등이 사용됨 기능: 여과 매체의 표면적 확대 → 더 많은 입자 포획 필터의 유량(Flow rate) 유지 막힘(Binding)을 최소화하여 longer service life 제공 c. Binding Resin (결합 수지) – 전하 기반의 선택적 제거 기능 부여 강한 양이온성 또는 음이온성 기능기를 가진 수지를 사용하여, 필터 표면에 전 기적 정전기력(electrostatic attraction)을 부여 기능: 단백질, DNA, HCP, 바이러스 등 전하를 띤 용해 물질 제거 기계적 여과 + 정전기 결합의 이중 메커니즘으로 효율 향상 예시: 양전하 기능기를 부여하여 음전하를 띠는 오염물질 제거에 적합  유체속도 저하 (입자들이 중력 /침강에 의해 입자가 필터 내부에 떨어짐 ] 흡착되어 걸러짐 [ 기계적 질림 + 정전기 | 표면 상호작용 ) 구불구불 경로를 가져 더 많은 ( 물리적으로 매질 속에서 걸림 ) 입자들이 내부에서 포집  1 분리 성능 1. Filter Grade / Retention Rating 일반적으로 depth filter는 정량적인 pore size(micrometer 단위)보다 Nominal Retention Rating 또는 Grade (ex. 10ZA, 60SP 등)로 표시됨 Grade가 낮을수록 큰 입자 제거, Grade가 높을수록 미세 입자 제거 ex: 10ZA → gross clarification 큰 입자제거 90ZB → fine clarification or bioburden reduction 미세입자 아 미생물부하 감소 「 부하량 「 탁도 2. Challenge Load (Particle/Biomass Load), turbidity 세포 수, 점도, 탁도 등 부하량이 높은 경우, 더 coarse한 (Grade 낮은) 필터를 1 차로 사용하고, finer grade 필터를 2차로 사용하는 스테이지 필터링 필요 High turbidity → coarse prefilter → fine depth filter 조잡 여과용 prefilter 정밀 depth fitter ( Grade 낮음 ) ( Grade 높음 ]  가 처리량 ㆍ여과용량 3. Throughput 및 Filtration Capacity 단위 필터 면적당 처리할 수 있는 부피 (L/m² 등)를 고려 적절한 필터 등급을 사용하지 않으면 막힘(fouling)이 빨라짐 예상 처리량 계산에 따라 필터 수량 또는 모듈 크기 결정 4. Process Compatibility 공정 적합성 pH, 온도, 용매, 바이오버든 등에 대해 필터가 안정적인가? 단백질 흡착, 추출물질(extractables/leachables) 여부 확인 필요 Single-use 시스템 또는 CIP/SIP 대응 가능성 L 추출물 / 용출물 cleaningl sterilization 5. Zeta Potential / Surface Charge Zeta Plus와 같은 필터는 양전하(+) 또는 음전하(-) 부여 가능 용액 중 존재하는 DNA, HCP, 세포내 물질 등 음전하를 띠는 물질을 포획하려면 양전하 필터 사용 필요에 따라 전하 상호작용 조절 ⇒ 정전기적 결합 효율① 6. Regulatory & Validation Requirements Extractables/Leachables 보고서, 바이오버든 감소 검증, 필터 무독성 인증 (TSE/BSE Free) 등 필요 멸균 조건(SIP 가능 여부), 벤치마킹 데이터 등도 중요  전기 이중층 전기이중층은 전하를 띤 고체 표면(예: 세포막, 필터 표면 등)과 그 주변의 이온을 포함한 액체 사이에서 형성되는 이중 전하 분포 구조 ( 수용액 ) ⇒ 고체 표면이 전하를 띠면, 이 전하를 중화하려고 주변 액체에서 반대 전하를 가진 이온(counterions)이 몰려오게 되는데, 이때 두 개의 층이 생겨서 이걸 전기이중층(electrical double layer)이라고 부름. 대부분의 고체 표면(예: 세포, 나노입자, 필터 media)은 표면 전하를 띰 ex: 세포막 → 음전하 필터 매트릭스 → 양전하 이 표면 전하는 주변의 액체(수용액)에서 반대 전하의 이온(counterion)을 끌어들 여 전하 중화를 유도 이때 생기는 두 개의 층이 전기이중층을 구성함 Depth filter 의 양 전 하 표 면 은 음 전 하 를 띤 단 백 질 , DNA, 세 포 막 등 을 electrokinetic double layer 내에서 끌어당겨 흡착 제거 aize excluaion -물리적 ion exchange - 화학적 ( 정전기적 ) 1. Stern Layer (고정층) 표면에 가까이 밀착되어 있는 _ counterion(반대전하)들의 층 전기적 인력에 의해 고정되어 거 의 움직이지 않음 > 전기적으로 고정됨 2. Diffuse Layer (확산층) Stern layer 바깥쪽에 존재하며, 이온이 자유롭게 이동 가능 느슨하게배치됨, 받지만 표면으로부터 멀어질수록 전위 전기적 영향을 자유롭게 움직일 수 있음 감소 → zeta potential이 측정되. 는 위치 3. Zeta Potential (제타 전위) stern t diffuse ayer 보통 단위는 mV (밀리볼트) 입자나 표면이 얼마나 강하게 전하를 띠고 있는지, 그리고 그 전하가 액체 중에서 얼마나 멀리까지 영향을 미치는지를 나타냄.  정전기적 흡착에 의한 불순물제거 전하× 전하이 Electrokinetic absorption은 depth filter 내부의 구성물질(예: 양전하를 가진 수지 또는 기능기) 이 전하를 띤 용해성 불순물(단백질, DNA, 바이 러스, 세포 내물질 등) 을 ** 정전기적 인력 (electrostatic attraction)으로 포획하여 여과하 큰 입자는 필터 기공을 통해 체 걸림으로 제거됨 작은 입자는 전하로 인해 흡착(adsorption) 되어 제거됨 는 비입자성 불순물 제거 메커니즘 그래서 미세 불순물 제거에는 전하 부여된 depth filter가 필수  발효 후 세포/세포 잔여물 제거 및 정제 크로마토그래피 전처리용 정제 크로마토그래피 후 잔류물 제거 고농도 단백질 정제 DNA,바이러스, 숙주세포단백질 제거HCP) (바이오버든 제거)  무균여과 : 살아있는 미생물까지 걸러서 최종적으로 “무균 상태”를 만드는 단계. 멤브레인 필터로 걸러냄 Tangential flow filtration : Tangential = “비스듬하게”, 즉 필터 표면을 따라 평행하게 흐름이 지나가는 방식 고체 입자나 큰 분자가 필터 표면에 누적되지 않도록 해서 막힘(fouling)을 줄이고, 지속적으로 효율적인 여과가 가능.  단일클론 항체 정제 과정에서 Depth Filter의 흡착 특성을 활용한 HCP 제거 Protein A 크로마토그래피 기반의 정제 공정에 중점 단일클론 항체가 용출될 때 함께 따라 나오는 HCP 및 응집체 문제를 다룸 오염된 HCP/응집체를 줄이는 방법을 탐구함 Protein A chromatography는 항체 Fc 부분과 결합하여 항체를 정제하는 강력한 방법이지만, HCP(Host Cell Protein)나 단백질 응집체가 항체와 함께 같이 나오는 (co-elution) 문제가 있음. 이 때, Depth filter의 표면 전하를 활용해 이런 불순물들을 **선택적으로 흡착(adsorption)**시키는 방식이 매우 유용. 특히 Zeta potential을 조절해서 음전하를 띠는 HCP, DNA, 바이러스 등을 끌어당길 수 있음. 흡광도 컬럼 통과한 용액 부피 ' < 단백질과 함께 HCP나 응집체도 나옴  ⇒ 전처리를 하지 않으면 Protein A 컬럼에 불순물(HCP, 응집체, 색소 등) 이 함께 흡 착되어 나중에 문제를 일으킴. 2. **depth filter(Millistak, Cuno)**를 쓰면 탁도는 줄지만, 3. 이온교환 컬럼 (Anion Exchange) 사용 시 불순물 제거 효과 최상! 색소성 물질은 410 nm 에서 빛흡수 = 여기서 peak 높으면 탁도아 오염수준 높음. Protein A 크로마토그래피에 앞서 셀 배양 수확물을 전처리한 효과. Protein A 크로마토그램의 용출 구간에서 410 nm에서 측정한 흡광도 곡선을 중첩하여 나타냈다. 셀 배양 수확물 샘플은 Protein A 컬럼에 로딩하기 전에 다음과 같은 방법으로 전처리되었다: 1. 대조군(Control): 전처리 없음 2. Millistak A1HC depth filter를 사용하여 150 L/m² 로딩, 50 LMH 유속으로 전처리 3. Cuno 90ZA depth filter를 사용하여 동일한 조건(150 L/m² 로딩, 50 LMH 유속)으로 전처리 4. Fractogel TMAE 컬럼에서 50 mg/mL 로딩 조건으로 anion-exchange flowthrough 방식으로 전처리 (약 50 mL 수확물을 1 mL 컬럼 부피에 해당하는 조건으로 적용)  ⇒ 단일 깊이 필터(): 체적 부하가 증가함에 따라 Protein A 컬럼에서 breakthrough되는 불순물(HCP/ aggregate)의 양이 급격히 증가합니다. 즉, 필터가 포화되면 불순물이 더 많이 통과합니다. 이중 깊이 필터(◆): 같은 조건에서 breakthrough되는 불순물의 양이 훨씬 적습니다. 필터가 포화되 어도 breakthrough가 크게 증가하지 않습니다. Protein A 용출 peak 면적 ⇒ 여과 후 ProteinA 컬럼에서 용출된 불순물 " 필러면적 당 처리한 생플총부피 ( HcPor 집합체 ) 의 양. 깊이 여과(depth filtration)는 Protein A 컬럼의 용출액에서 HCP(숙주 세포 단백질) 및 단백질 응집체(aggregates) 오염을 감소시킨다. 깊이 여과 필터에 과량 로딩하면 HCP 및 응집체가 여과를 뚫고 나오는 breakthrough가 발생한다. 여과 필터를 연속(중복, redundant)으로 사용하면 Protein A 컬럼에 로딩되는 시료 내 HCP/응집체 오염을 크게 줄일 수 있다. HCP 및 응집체의 제거는 정전기적 상호작용(electrostatic interaction)과 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 메커니즘에 의해 이루어진다.