바이오 의약품 명확화 공정

명확화 (Clarification)

• 명확화는 바이오 의약품 생산의 다운스트림 공정에서 세포 배양 후 배양액의 세포 파편과 입자 불순물을 제거하여 정제된 단백질 용액을 얻는 초기 정제 단계
• 응집은 불순물이 많으면 단백질이 소수성 상호 작용에 의해 응집되는 현상이며, 이는 용해도 감소, 기능 손실 또는 변성을 초래할 수 있음

주요 목표

• 물리적 불순물 제거: 세포, 세포 파편, inclusion체를 제거
• 후속 장비 보호: 크로마토그래피 컬럼의 막힘 방지
• 정제 효율 향상: UF, 멸균 필터 막힘 방지
• 제품 품질 보장: 불순물을 제거하여 단백질 안정성을 높이고 단백질 응집을 방지

주요 공정 및 방법

• 원심분리: 주로 세포인 큰 입자를 제거하기 위해 원심력을 사용
• 심층 여과(Depth filtration): 3차원 구조 필터를 사용하여 세포 잔해를 제거
• 미세 여과(Microfiltration): 0.1~0.45µm 기공 크기의 멤브레인 필터를 사용하여 작은 크기의 입자를 제거

공정 흐름

• 처음에는 세포 배양액(Cell Culture Broth)을 얻음
• 1단계: 원심분리 또는 심층 여과를 수행
• 2단계: 심층 여과 또는 미세 여과를 수행
• 최종 결과: 명확화된 수확물(정제된 단백질 함유 용액)

원심분리(Centrifuge)

• 원심분리는 회전하는 물체를 바깥쪽으로 밀어내는 가상의 힘인 원심력 또는 구심력을 이용하여 물질을 분리하는 방법
• 분리 대상의 크기와 밀도에 따라 기체-기체, 액체-고체, 액체-액체 등 혼합물을 분리하는 데 사용할 수 있음
• 밀도 차이를 이용하여 액체-액체 또는 액체-고체 혼합물을 분리하는 데 사용

원심 효과 및 결정 요인

• 원심분리기의 성능은 중력 대비 원심력의 정도에 따라 결정되며 이를 원심 효과라고 함
• 원심력의 크기는 질량(m) x 반경(r) x 각속도 제곱(ω^2)이므로 원심분리기의 반경과 속도가 원심 효과를 결정
• 동일한 원심력을 가하기 위해 각 원심분리기마다 반경이 다르므로 각속도로 원심력을 조절하기는 어렵다
• g는 중력 가속도로서 원심력이 중력의 몇 배로 작용하는지를 나타내므로 다양한 원심분리기의 원심력을 비교하는 데 유용

원심 분리 기술유형

• 차등 원심분리: 침강 속도 차이를 이용하여 물질을 분리하는 방법으로, 가장 큰 입자가 먼저 침전되고 질량과 밀도가 비슷하면 구형 입자가 먼저 침전됨
• 밀도 구배 원심분리: 튜브에 밀도가 다른 매질을 채우고 원심분리하여 입자를 분리

원심 분리 성능

• 저속 원심분리기(~6,000rpm)는 세포나 핵과 같이 쉽게 침전되는 시료에 적합
• 고속 원심분리기(~25,000rpm)는 밀도 구배 원심분리에 적합하며 세포 및 세포 소기관을 분리하는 데에도 사용
• 초원심분리기(~80,000rpm)는 밀도 구배 원심분리에 주로 사용하며 세포 소기관, 세포막 성분, 리보솜, 폴리솜, 거대분자를 분리

로터 유형

• 스윙 버킷 로터: 수평 위치에서 회전할 때 튜브가 이동하여 경계가 명확한 분리 층을 생성하므로 밀도 구배 원심분리, 혈장/혈청 분리에 적합
• 고정각 로터: 튜브가 경사진 채 유지되어 입자가 튜브 벽을 따라 빠르게 침전되므로 속도가 빠르고 침전 효율이 높지만 경계가 흐려짐
• 수직 로터: 분리 시간이 짧고 분리 속도가 가장 빠르지만 분리 후 시료를 쉽게 채취할 수 없기 때문에 바이러스, 플라스미드, DNA 밴드를 분리하는 데 적합
• 연속 흐름 로터: 시료를 지속적으로 공급하여 대량 생산에 적합하지만 분리 경계가 명확하지 않고 장비가 복잡

원심분리기 유형

• 바스켓 원심분리기는 구체 내에서 원심력을 사용하여 고체와 액체를 분리
• Tubular Bowl 원심분리기는 고속 회전을 사용하여 고체 입자를 분리하고 액체를 이동
• 디캔터 원심분리기는 회전하는 볼과 스크류 컨베이어를 사용하여 연속적으로 고체-액체 혼합물을 분리
• 디스크 스택 원심분리기는 플레이트를 쌓아 원심분리 효율을 높여 고체와 액체를 분리
• GEA의 산업용 디스크형 원심분리기 CEN-1500은 유압 시스템을 사용하여 작동이 연속적

미세 여과

• 미세 여과는 기공 크기가 0.1~1.0µm인 멤브레인 필터를 사용하여 세균, 세포 파편 및 큰 입자를 제거
• 압력차를 이용하여 액체를 유도하여 필터 막으로 통과시키므로 큰 입자는 필터에 갇히고 작은 입자는 통과
• 이는 일반적으로 세포 제거, 세포 수거 후 명확화 또는 포함체 제거에 사용

깊이(Depth) 필터

• 심층 필터는 일반적으로 세포 수확(명확화) 단계에서 미세 여과와 함께 사용 가능
• Depth 필터는 배양된 세포 배양액을 수확할 때 세포와 세포 파편을 효과적으로 제거하고 후속 정제 프로세스의 효율성을 높입니다
• 심층 필터는 원심분리 후 남은 작은 입자 또는 콜로이드에 효과적
• 심층 필터는 입자를 포획하기 위해 두께가 얇은 다공성 필터 매질을 사용
• 유체는 필터를 통과할 때 입자가 필터 매질의 복잡한 경로를 따르면서 갇히는 경우도 있음
• 이러한 구조는 입자 부하가 더 많고 탁도도 높습니다

Depth 필터 사용시 주의사항

• 여과할 배양액에 따라 적절한 깊이 필터 등급을 선택(예를 들어 세포 밀도, 입자 크기 분포)
• 필터 하우징에 적절한 깊이 필터를 설치하여 밀폐되었는지 확인합니다
• 필터를 사용하기 전에 필터를 세척하여 남아 있는 미립자 또는 첨가제를 제거합니다