Βιοδιαχωρισμοί - Chapter 16 PDF

Βιοδιαχωρισμοί  Τι είναι βιοδιαχωρισμοί? Απομάκρυνση μίγματος αντίδρασης μετά από ζύμωση. Απομάκρυνση βιολογικού πολτού (broth) Χαρακτηριστικά Τα προϊόντα βρίσκονται σε μεγάλες αραιώσεις Τα προϊόντα είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία Υπάρχουν πολλές κατηγορίες ενώσεων προς...

Βιοδιαχωρισμοί  Τι είναι βιοδιαχωρισμοί? Απομάκρυνση μίγματος αντίδρασης μετά από ζύμωση. Απομάκρυνση βιολογικού πολτού (broth) Χαρακτηριστικά Τα προϊόντα βρίσκονται σε μεγάλες αραιώσεις Τα προϊόντα είναι ευαίσθητα στη θερμοκρασία Υπάρχουν πολλές κατηγορίες ενώσεων προς διαχωρισμό Τα προϊόντα μπορεί να είναι ενδοκυττάρια ή να βρίσκονται σε αδιάλυτα σώματα εγκλίσεως (inclusion bodies) Οι φυσικές ιδιότητες των προϊόντων είναι παρόμοιες με εκείνες των προσμίξεων Απαιτείται μεγάλη καθαρότητα και ομοιογένεια κυττάρων για την προστασία της υγείας του ανθρώπου Τα προϊόντα ζύμωσης μπορεί να είναι Τα ίδια τα κύτταρα (βιομάζα) Συστατικά του πολτού (εξωκυττάρια), π.χ. αλκοόλες, οργανικά οξέα, ένζυμα Ενδοκυττάρια συστατικά (πρωτεΐνες, DNA, RNA, κ.ά.) Μέθοδοι βιοδιαχώρισμού  Κατεργασία βιολογικού πολτού Ο πολτός παρουσιάζει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά (μεγάλο ιξώδες, ελάχιστα συμπιεστός, μη νευτωνικό υγρό, κ.ά.). Άρα, η απευθείας διήθηση δεν είναι εύκολη. Χρειάζεται προκαταρκτική επεξεργασία. Αυτή περιλαμβάνει: Θέρμανση για να μετουσιωθούν οι πρωτεΐνες Προσθήκη ηλεκτρολυτών για θρόμβωση ή κροκίδωση Προσθήκη μέσων για διευκόλυνση της διήθησης (γη διατόμων, περλίτης, που αυξάνουν το πορώδες και ελαττώνουν τη συμπιεστότητα) Η ξηρανθείσα γη διατόμων έχει τυπικά χημική σύσταση 80-90% πυριτία (SiO2), με 2- 4% αλουμίνα (Al2O3) (που οφείλεται σε μεταλλο-πηλούς) και 0.5-2% οξείδιο του σιδήρου (Fe2O3).  Γη διατόμων 80-90% SiO2 2-4 % alumina Al2O3 0.5-2% iron oxide Μεγάλοι πόροι  Διαχωρισμός υγρού-στερεού Downstream processing – διαχωρισμός αδιάλυτων σωμάτων Η επιλογή μεθόδου εξαρτάται από τις ιδιότητες του πολτού Τα στερεά μπορεί να είναι: Κυτταρική μάζα (πυκνότητα 0.5-1.1 μεγαλύτερη του πολτού) Το σχήμα των σωματιδίων – μικροοργανισμών (σφαίρες, ράβδοι, ελλείψεις, νήματα, κ.ά.) Το μέγεθος των βακτηρίων ποικίλει (0.5-40 μm) (0.5 μm βακτήρια; 40 μm φυτικά κύτταρα) Για το διαχωρισμό χρησιμοποιείται Διήθηση Φυγοκέντριση  Διήθηση Διήθηση είναι τεχνική απομάκρυνσης στερεών σωμάτων από το υγρό εξαναγκάζοντας το να περάσει μέσα από φίλτρα κατακράτησης. Χωρίζεται σε κατηγορίες Κλασική διήθηση Μικροδιήθηση Υπερδιήθηση Αντίστροφη ώσμωση Ανάλογα με το μέσο διήθησης το μέγεθος σωματιδίων τη διαφορά πίεσης λειτουργίας και το είδος προς διαχωρισμό  Διήθηση Στο πρώτο στάδιο απομακρύνονται στερεά σώματα μεγέθους >10 μm Η κλασική διήθηση περιλαμβάνει φιλτρόπρεσα και περιστρεφόμενα τύμπανα κενού Η φιλτρόπρεσα αποτελείται από σειρά φίλτρων που κρατούνται στη θέση τους με κατάλληλο σκελετό. Απομάκρυνση μικροοργανισμών και ιζημάτων πρωτεϊνών Μικρή δυναμικότητα κατακράτησης στερεών Διαχωρισμός μικρών ποσοτήτων (φάγοι, βακτήρια) Λειτουργεί με θετική πίεση Περιστρεφόμενα τύμπανα κενού Συνεχής λειτουργία Περισσότερο πολύπλοκα Λειτουργούν με αρνητική πίεση Το μίγμα ψεκάζεται από την κορυφή τυμπάνου και τα στερεά απομακρύνονται με τη βοήθειά του  Φυγοκέντριση Εναλλακτική λύση για διήθηση Μειονεκτήματα Κόστος Όχι διαχωρισμοί μεγάλης κλίμακας Τύποι α) σωληνοειδής (tubular) β) με δίσκους Στην πρώτη περίπτωση μέγεθος 2.5 in x 9.30 in και 15,000-50,000 rpm Στη δεύτερη περίπτωση μικρό μέγεθος με ύψος 8.20 in Κίνηση από κάτω προς τα πάνω  Φυγοκέντριση (α) Κυλινδρικός τύπος (β) Τύπος Bowl  Φυγοκέντριση Α Γ Διάγραμμα συνεχούς φυγοκέντρου Διάγραμμα υπερφυγοκέντρου Δ Α. Φυγόκεντρος Β. Ρότορας Β  Λύση κυττάρων Φυσικές μέθοδοι Ομογενοποίηση Άλεση Υπέρηχοι Α. Ομογενοποίηση Χρησιμοποιείται στα τρόφιμα Χρήση αντλίας θετικής εκτόπισης και ανάπτυξη διατμητικών τάσεων με τελική ρήξη της κυτταρικής μεμβράνης Η εξίσωση που περιγράφει την ομογενοποίηση δίνεται παρακάτω R𝑚 log( ) = kNPα 𝑅𝑚 −𝑅 Ν = αριθμός πειραμάτων P = λειτουργική πίεση Α = εκθετικός παράγων που εξαρτάται από το είδος του μικροοργανισμού R = η ποσότητα της πρωτεΐνης που απελευθερώνεται Rm = η μέγιστη ποσότητα πρωτεΐνης k = σταθερά ταχύτητας Ομογενοποιητής Manton-Gaulin Ο ομογενοποιητής Gaulin  Ομογενοποιητής Manton-Gaulin Ο ομογενοποιητής Manton-Gaulin 12 5 Ο ομογενοποιητής Manton-Gaulin TBS 450 GPH Homogenizer Manton Gaulin 325KL65RA SMD 325 GPH Homogenizer  Ομογενοποιητής Manton-Gaulin Β Α Ο ομογενοποιητής Gaulin αποτελείται από δύο τμήματα: 1. Την αντλία πιστονιού (Piston pump) (A,B) 2. Τη βαλβίδα ομογενοποίησης (Homogenizing valve) (Γ) Γ  Λύση κυττάρων Β. Άλεση Μύλος Ισχυρή ανάδευση με λειαντικά σωματίδια R𝑚 log( ) = kt 𝑅𝑚 −𝑅 όπου t= χρόνος παραμονής Εξάρτηση συγκέντρωσης είναι ασθενής με αυξανόμενη ταχύτητα ανάδευσης. Γενικά, η συγκέντρωση των κυττάρων στην είσοδο πρέπει να είναι καθορισμένη για τη συγκεκριμένη εφαρμογή (μειονέκτημα). Χρόνος παραμονής στο μύλο σημαντικός. Θετικά αποτελέσματα (εκτός από τη μετουσίωση) λόγω μακράς παραμονής και υψηλών θερμοκρασιών που αναπτύσσονται κατά τη διεργασία Η άλεση προτιμάται από την ομογενοποίηση σε περιπτώσεις νηματοειδών και πολύ ανθεκτικών μικροοργανισμών.  Λύση κυττάρων Γ. Υπέρηχοι Συσκευή – Ultrasonicator Συχνότητα 16 KHz Διακύμανση στην πίεση Φυσαλίδες προκαλούν λύση της μεμβράνης Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα Εφαρμογή σε όλα τα κύτταρα σε εργαστηριακή κλίμακα Όχι για μεγάλες ποσότητες λόγω κόστους  Χημικές μέθοδοι Χρησιμοποιούνται όταν δεν ενδείκνυνται φυσικές μέθοδοι Χρήση απορρυπαντικών – επιφανειοδραστικών, αλκαλίων οργανικών διαλυτών, ώσμωσης Προϋπόθεση ότι το προϊόν δεν ευαίσθητο Επιφανειοδραστικά (SDS, Triton X-100, Tween 12, ταυροχολικό νάτριο) Τα αλκάλια σαπωνοποιούν το κυτταρικό τοίχωμα. Φθηνή επιλογή και αποτελεσματική, αλλά μετουσίωση Οι οργανικοί διαλύτες κόβουν το κυτταρικό τοίχωμα με διόγκωση και ρήξη (π.χ. ερυθρά αιμοσφαίρια)  Χημικές μέθοδοι Triton X-100 Sodium Dodecyl Sulfate Taurocholic acid  Βιολογικές μέθοδοι Χρήση ενζύμων Εξωγενής με ειδικά ένζυμα Ενδογενής με απελευθέρωση της κυτταρικής λυσοζύμης (αυτόλυση) Η λυσοζύμη έχει αντιβακτηριακή δράση (παραγωγή τυριού). Σκοτώνει το μύκητα C. tyrobutyricus Ήπια διεργασία με χαμηλές διατμητικές τάσεις Πολύ εξειδικευμένη Μοντελοποίηση λαμβάνοντας υπόψη τη δομή της μεμβράνης. Εσωτερικό και εξωτερικό στρώμα. Το εσωτερικό περιλαμβάνει πολυσακχαρίτες και το εξωτερικό πρωτεΐνες Η καταλυτική δράση των ενζύμων ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten Η μοντελοποίηση συμβάλει στην ανάπτυξη αντιδραστήρων ενζυμικής κατεργασίας κυττάρων  Βιολογικές μέθοδοι Μοντελοποίηση λαμβάνοντας υπόψη τη δομή της μεμβράνης. dY k𝑟 𝐸 Υ−Υ∞ = 𝑘𝛼 Υ − Υ∞ − ) dt Υ−Υ∞ +K𝑚 Y = ζύμη, mg/L Υ𝑜, Υ∞ =αρχική και τελική συγκέντρωσης της ζύμης kr = σταθερά ταχύτητας της λύσης Εσωτερικό και εξωτερικό στρώμα. Το εσωτερικό περιλαμβάνει πολυσακχαρίτες και το εξωτερικό πρωτεΐνες Η καταλυτική δράση των ενζύμων ακολουθεί κινητική Michaelis-Menten Η μοντελοποίηση συμβάλει στην ανάπτυξη αντιδραστήρων ενζυμικής κατεργασίας κυττάρων  Παραλαβή προϊόντων Μετά το διαχωρισμό παραλαμβάνεται αραιό διάλυμα για περαιτέρω επεξεργασία 1. Συμπύκνωση 2. Καθαρισμός προϊόντων Μέθοδοι παραλαβής προϊόντος 1. Εκχύλιση 2. Προσρόφηση  Παραλαβή προϊόντων Εκχύλιση Περιλαμβάνει δύο είδη 1. Κλασική εκχύλιση με δύο φάσεις από δύο μη αναμίξιμα υγρά. Το ένα είναι το νερό και το άλλο ένας οργανικός διαλύτης (CHCl3, Et2O, CH3COOC2H5) 2. Υδατοδιαλυτά πολυμερή ή συστήματα πολυμερών με άλας. Δύο υδατικές φάσεις αναμίξιμες Πολυμερή 1. Πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) και δεξτράνη (DEX) σε διάφορες συγκεντρώσεις και μοριακή μάζα 2. PEG και άλας KH2PO4 Η κατανομή βιομορίων σε δύο φάσεις καθορίζεται από τις επιφανειακές ιδιότητες και τη σύνθεση του συστήματος φάσεων Χαρακτηρίζεται από το συντελεστή κατανομής Kp (λόγος της συγκέντρωσης βιομορίου στην πάνω και κάτω φάση) Σωματίδια (κύτταρα οργανίδια) συγκεντρώνονται στη διεπιφάνεια ή στη φάση με το μεγαλύτερο όγκο  Παραλαβή προϊόντων Εκχύλιση Συντελεστής κατανομής (Partition coefficient) Saq⇌Sorg KD=[Sorg]/[Saq] D=[Sorg]total/[Saq]total  Παραλαβή προϊόντων -Εκχύλιση Η σύσταση των φάσεων για την ανάκτηση των επιθυμητών προϊόντων είναι σημαντική (ειδικά για πρωτεΐνες) Η εκχύλιση ως μέθοδος είναι καλή για μικρές ποσότητες προϊόντων. Για μεγάλες ποσότητες δεν προσφέρεται, εκτός αν βρεθεί τρόπος ανακύκλωσης των πολυμερών που χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό των δύο φάσεων ή ανακαλυφθούν πολυμερή μικρότερου κόστους. Στην περίπτωση χρήσης πολυμερούς-άλατος για την ανάκτηση προϊόντων, παραμένει μαζί με το προϊόν και το πολυμερές που είναι δύσκολο να απομακρυνθεί.  Παραλαβή προϊόντων Η σύσταση των φάσεων είναι σημαντική (ειδικά για πρωτεΐνες) Η μέθοδος είναι καλή για μικρές ποσότητες καθαρών προϊόντων.  Παραλαβή προϊόντων Η βιοσυμβατότητα και η ταχύτητα κάνουν την εκχύλιση πιο ελκυστική από το υδατικό σύστημα δύο φάσεων. Παραδείγματα συστημάτων για την παραλαβή καθαρών προϊόντων φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Συστήματα πολυμερών στην απομόνωση ενζύμων  Προσρόφηση Η προσρόφηση είναι διαδικασία που αναφέρεται στην εκλεκτική πρόσδεση μιας ουσίας σε ορισμένα στερεά, ως αποτέλεσμα φυσικών ή χημικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ της προσροφούμενης ουσίας και του στερεού Κατηγορίες Κλασική προσρόφηση Προσρόφηση ιοντοανταλλαγής Προσρόφηση συγγένειας Κλασική προσρόφηση Αντιστρεπτή διεργασία, αποτέλεσμα ελκτικών δυνάμεων τύπου Van der Waals Κλασικά προσροφητικά υλικά οι ενεργοί άνθρακες στη βιομηχανία. Παρασκευάζονται από στάχτη και CaCl2 ή καρβονοποίηση με ταυτόχρονη ενεργοποίηση με διαβίβαση θερμού αέρα ή ατμών. Οι άλλες δύο διεργασίες είναι γνωστές από τη χρωματογραφία (που θα εξετασθεί παρακάτω).  Καθαρισμός προϊόντων Καταβύθιση Βαλβίδα εκτόνωσης Παραδοσιακή μέθοδος ανάκτησης πρωτεϊνών Στηρίζεται στην υδροφιλικότητα-υδροφοβικότητα των πρωτεϊνών. Διατάραξη με pH, θερμοκρασία, μεταβολή διαλυτότητας με προσθήκη ουσιών οδηγεί σε συσσωμάτωση. Η επιλογή τέτοιων ουσιών οδηγεί στην επιλεκτική καθίζηση με καθαρότητα του επιθυμητού προϊόντος (της πρωτεΐνης) με ελάχιστη μετουσίωση Τεχνικές Εξαλάτωση Καθίζηση με οργανικούς διαλύτες Ισοηλεκτρική καθίζηση Μεταβολή στη θερμοκρασία και στο pH  Καθαρισμός προϊόντων Εξαλάτωση (salting out) Θυρίδα φόρτωσης Πραγματοποιείται με προσθήκη αλάτων. Βαλβίδα εκτόνωσης Αφαιρούνται μόρια νερού από το διάλυμα και την επιφάνεια πρωτεϊνών. Έτσι, λόγω των υδρόφοβων περιοχών τους, αναπτύσσεται ευρεία επαφή με αποτέλεσμα τη συσσωμάτωση. Η συσσωμάτωση οδηγεί στην καθίζηση. Η εξίσωση Debye-Hückel περιγράφει την εξαλάτωση πρωτεϊνών logS =logSo-Ksmα όπου m = molality του άλατος logS =logSo-Ks’w S = υποθετική ιδανική διαλυτότητα της πρωτεΐνης για m=0 Ks = σταθερά εξαλάτωσης w = ιοντική ισχύς  Εξαλάτωση αιμογλοβίνης Για δεδομένη συγκέντρωση πρωτεΐνης και άλατος οι σταθερές Ks και Ks’ είναι ανεξάρτητες από τη θερμοκρασία και το pH. H S είναι συνάρτηση και των δύο μεταβλητών. Η κλίση των καμπυλών είναι η ίδια και η διαλυτότητα των πρωτεϊνών μηδενική σε ουδέτερο pH  Εξαλάτωση διαφόρων πρωτεϊνών Άλατα εξαλάτωσης που χρησιμοποιούνται: Φωσφορικά, θειικά και χλωρικά. Το (NH4)2SO4 χρησιμοποιείται στη βιομηχανία λόγω χαμηλού κόστους.  Καταβύθιση με οργανικούς διαλύτες Οι οργανικοί διαλύτες θα πρέπει να είναι αναμίξιμοι με νερό Ελαττώνεται η διηλεκτρική σταθερά του διαλύματος των πρωτεϊνών, οι πρωτεΐνες συσσωματώνονται και καθιζάνουν Μειονέκτημα της καταβύθισης είναι η μετουσίωση Ως διαλύτες χρησιμοποιούνται: μεθανόλη, αιθανόλη, ακετόνη, ισοπροπανόλη.  Ισοηλεκτρική καθίζηση Στο ισοηλεκτρικό σημείο (pI), οι πρωτεΐνες εμφανίζουν την ελάχιστη διαλυτότητα. Άρα, στο αντίστοιχο pH, οι πρωτεΐνες καθιζάνουν. Το μεγαλύτερο πρόβλημα είναι το εύρος pH, στο οποίο η πρωτεΐνη θα παραμένει σταθερή. Προσεκτικός έλεγχος pH και καλή ανάμιξη  Ηλεκτροφόρηση Πρόκειται για τεχνική που βασίζεται στη διαφορά δυναμικού μέσα σε ένα διάλυμα οργανικών ουσιών (αμινοξέων, πρωτεϊνών, κ.ά.). Λαμβάνει χώρα σε πηκτή (gel). Λόγω διαφορετικού φορτίου, οι πρωτεΐνες κατευθύνονται με ανάλογη ταχύτητα προς το ηλεκτρόδιο που τις έλκει. Αφήνοντας τη διαδικασία να τρέξει για αρκετό χρόνο παίρνουμε τις θέσεις των πρωτεϊνών στην πηκτή. Η πηκτή προστατεύει τα ρεύμα από ανάμιξη και λόγω φυσικής συναγωγής δρα ως μοριακό κόσκινο. Θερμότητα Joule πρέπει να λαμβάνεται υπόψη κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Στη βιομηχανία, λόγω του μειονεκτήματος του χρόνου, έχουν αναπτυχθεί ηλεκτροφορήσεις συνεχούς λειτουργίας με ανακύκλωση του ρυθμιστικού διαλύματος.  Ηλεκτροφόρηση Η κίνηση των ιόντων στο ηλεκτρικό πεδίο περιγράφεται από την εξίσωση 𝐄 F = ( )q 𝐝 E = η διαφορά δυναμικού μεταξύ των ηλεκτροδίων d = η απόσταση μεταξύ τους Ο λόγος E/d είναι η ισχύς του πεδίου. Στο διάλυμα, η έλκουσα δύναμη του ηλεκτροδίου αντικρούεται από τη φόρτιση ή τριβή με το επιταχυνόμενο μόριο. Το μέγεθος της φόρτισης εξαρτάται από τη σχέση Stokes F= 6prηV r = η ακτίνα του σφαιρικού μορίου η = το ιξώδες V= η ταχύτητα του μορίου F = η δύναμη που ασκείται στο μόριο 𝐄 Άρα, V= q 6dprη  Ηλεκτροφόρηση με πολυακρυλαμίδιο Απαιτείται η χρήση αδρανούς υλικού. Τέτοιο υλικό είναι το πολυακρυλαμίδιο Η πηκτή λαμβάνεται με πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου με τετραμεθυλενοδιαμίνη (TEMED) και υπερθειικό αμμώνιο Η εξίσωση Rodhard και Chranbach περιγράφει τη σχέση πηκτής με την κίνηση του μορίου logM= logMo-KRT M = η ηλεκτροφορητική κίνηση Mo = η ελεύθερη κίνηση στο διάλυμα σακχαρόζης Τ= η ολική συγκέντρωση της πηκτής KR = η ολική συγκέντρωση της πηκτής TEMED όπου KR = C(R+r) C = σταθερά R = η μέση γεωμετρική ακτίνα του μορίου R = η ακτίνα των ινών της πηκτής  Ηλεκτροφόρηση με πολυακρυλαμίδιο Απαιτείται η χρήση αδρανούς υλικού. Αυτό είναι το πολυακρυλαμίδιο. Η πηκτή λαμβάνεται με πολυμερισμό του ακρυλαμιδίου με τετραμεθυλενοδιαμίνη (TEMED) και υπερθειικό αμμώνιο [(ΝΗ4)4S2O8)] Ηλεκτροφόρηση με πολυακρυλαμίδιο Ηλεκτροφόρηση με πολυακρυλαμίδιο  Διαχωρισμός πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους Α. Ηλεκτροφόρηση σε 12.5 % SDS-πολυακρυλαμίδιο. B. Ηλεκτροφόρηση σε 15 % SDS-πολυακρυλαμίδιο. Η βαφή των ζωνών πρωτεϊνών γίνεται με Coomassie Blue  Χρωματογραφικές μέθοδοι Πρόκειται για μεθόδους που επιχειρούν το διαχωρισμό και καθαρισμό πρωτεϊνών με βάση την κατανομή των προς διαχωρισμό ουσιών ανάμεσα σε μια κινητή και μια στατική φάση. Η κινητή φάση περιέχει το διαλύτη που περιέχει τις ουσίες προς διαχωρισμό και το διαλύτη έκλουσης. Η στατική φάση μπορεί να είναι ένα πολυμερές, στερεό με πορώδες, μια πηκτή, μια ρητίνη ιοντοανταλαγής, κ.ά. Στην προκειμένη περίπτωση, τρία είδη χρωματογραφίας στήλης θα εξετασθούν: Ιοντοανταλλαγή Μοριακή διήθηση Συγγένεια Η χρωματογραφική διεργασία πραγματοποιείται σε στήλη Η στήλη περιέχει πληρωτικό υλικό (είναι η στατική φάση) Πρόκειται για διεργασία διαλείποντος έργου αν και έχουν γίνει προσπάθειες για συσκευές συνεχούς λειτουργίας.  Χρωματογραφικές μέθοδοι Διάταξη χρωματογραφικής στήλης με καθοδική ροή (α) και ανοδική ροή (β).  Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Χρησιμοποιείται στη χημική βιομηχανία για τον καθαρισμό του νερού. Το πληρωτικό υλικό είναι ρητίνες ιοντοανταλλαγής. Αποτελούνται από ένα πολυμερές πλέγμα (πολυμερές στυρολίου-διβινυλοβενζολίου, ακρυλικό, κυτταρίνη ή δεξτράνη). Στο σκελετό του πολυμερούς αυτού υπάρχουν: Ιοντικές λειτουργικές ομάδες συνδεδεμένες με το πολυμερές Αντισταθμιστικά ιόντα για την ηλεκτρική ουδετερότητα της ρητίνης Έτσι, μια όξινη κατιοντική ρητίνη περιέχει σουλφονικές ομάδες (-SO3H) συνδεδεμένες στο πολυμερές και αντισταθμιστικά ιόντα νατρίου (-SO3─). Άρα, μια τέτοια ρητίνη χρησιμοποιείται για την ανταλλαγή κατιοντικών ειδών προς διαχωρισμό. R‒H+ + NaOH R‒Na+ + H2O  Υλικά χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής Α. Ανιοντικό, C: Κατιοντικό 25, 50: Βαθμός πορώδους  Χρωματογραφία συγγένειας Πρόκειται για μέθοδο με μεγάλη διαχωριστική ικανότητα. Βασίζεται στη στερεοδομή της στατικής φάσης και της ένωσης που θα διαχωριστεί. Το πληρωτικό υλικό φέρει ένα βιοειδικό ligand (L), συνδεδεμένο μέσω μοριακού δεσμού με το πολυμερές. Η ανάπτυξη δεσμού γίνεται έτσι ώστε το ligand να διατηρεί τη δομή του για ενίσχυση της δέσμευσης του προς διαχωρισμό υλικού (υπόστρωμα S). Επιπλέον, το υπόστρωμα θα πρέπει να απομακρύνεται πολύ εύκολα μετά το διαχωρισμό. Το L μπορεί να συνδέεται με το πολυμερές με ένα βραχίονα, έτσι ώστε η σύνδεσή του με το S να μην παρακωλύει την αντίδραση σύνδεσης. Χρωματογραφία συγγένειας  Χρωματογραφία συγγένειας Τα χαρακτηριστικά του αδιάλυτου πολυμερούς είναι παρόμοια με εκείνα των μοριακών κoσκίνων 1. Χαμηλή μη εξειδικευμένη απορρόφηση 2. Χαμηλή ροή 3. Χημική και μηχανική σταθερότητα σε μεγάλο εύρος pH, ιοντικής ισχύος και μεγάλων συγκεντρώσεων αντιδραστηρίων μετουσίωσης 4. Ύπαρξη αρκετών χαρακτηριστικών ομάδων που μπορούν να ενεργοποιηθούν 5. Υψηλό πορώδες Τα κριτήρια αυτά πληρούνται από πληρωτικά υλικά, όπως αυτά που φαίνονται: Αγαρόζη Πολυακρυλαμίδιο και Υάλινα σφαιρίδια  Χρωματογραφία συγγένειας Η σύνδεση του L στο πολυμερές συνεπάγεται Ενεργοποίηση των χαρακτηριστικών ομάδων του φορέα Σύνδεση του L με αυτές τις ομάδες Οι αντιδράσεις θα πρέπει να είναι ήπιες Η σεφαρόζη 4Β είναι αγαρόζη, η οποία ενεργοποιείται πριν αντιδράσει το L μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Χρησιμοποιείται BrCN για τη διαμόρφωση του πληρωτικού υλικού. Δεδομένος όγκος πηκτής αιωρείται στο νερό. Προστίθεται BrCN και ρυθμίζεται το pH στο 11. Η ενεργοποιημένη αγαρόζη πλένεται με ρυθμιστικό διάλυμα (pH 10-11) προ της αντίδρασης με το L. Τα ligands L περιλαμβάνουν ανάλογα υποστρωμάτων, συνένζυμα, και υποστρώματα ενζύμων. Όταν ένα υπόστρωμα δρα ως ligand, τότε θα πρέπει να μην αντιδρά καταλυτικά με το ένζυμο (παράλειψη μεταλλοϊόντων, μεταβολή pH, κ.ά.). Ενεργοποίηση με BrCN Αντίδραση του BrCN με υδροξύλια σε αγαρόζη Ενεργοποίηση με BrCN Διασπαση πεπτιδικού δεσμού με BrCN Χρωματογραφία συγγένειας  Μοντελοποίηση της χρωματογραφίας συγγένειας Για τη μοντελοποίηση της χρωματογραφία συγγένειας γίνονται παραδοχές. Η σύνδεση πρωτεΐνης –ligand είναι μη αντιστρεπτή. Δίνεται έμφαση στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων παρά στην ανάπτυξη του μοντέλου. Έτσι, έχει επιτευχθεί όχι μόνο περιγραφή διαχωρισμού πρωτεϊνών, αλλά και κυττάρων (ανάλογα με τη φύση των κυτταρικών μεμβρανών), και διαχωρισμοί πολτών ζύμωσης χωρίς άλλη κατεργασία. Το μοντέλο προϋποθέτει ακινητοποιημένα σωματίδια –ligands σε μεμβράνες υδροπηκτής, Πλεονεκτήματα Μειωμένη αντίσταση στη μεταφορά μάζας Αποκλεισμός μεγαλομορίων από τη σύνδεσή τους σε ligand ή την απόφραξη του συστήματος Η αντίδραση περιγράφεται ως εξής: 𝑘1 P+L PL 𝑘−1 Vsorption=k1[P][L] Vdesorption=k-1[PL] Η σταθερά ισορροπίας θα είναι [P][L] k keq = [PL] = k−1 1 Η δεσμευμένη πρωτεΐνη μπορεί να εκλουσθεί με το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Η μέθοδος χρησιμοποιείται στη φαρμακευτική βιομηχανία. Το κόστος του πληρωτικού υλικού είναι μεγάλο  Χρωματογραφία πηκτής ή μοριακής διήθησης Το πληρωτικό υλικό είναι μακρομόρια που έχουν υποστεί κατεργασία και δίνουν τρισδιάστατο πλέγμα – πηκτές. Οι κόκκοι της πηκτής όταν τεθούν στο νερό απορροφούν μεγάλους όγκους και διογκώνονται. Πηκτές: πολυσακχαρίτες από φρούτα και ρίζες, πρωτεΐνες από ιστούς ζώων, ανόργανα άλατα. Συνήθως χρησιμοποιούνται πηκτές δεξτράνης (Sephadex) και πολυακρυλαμιδίου (Biogel) Το δείγμα τοποθετείται στην κορυφή της στήλης και με τη βοήθεια του εκλουστικού υγρού τα μόρια μεταφέρονται προς τα κάτω. Τα μεγάλα μόρια δεν μπορούν να διαπεράσουν τους κόκκους της πηκτής, έχουν την ίδια ταχύτητα με το εκλουστικό υγρό και άρα εξέρχονται από τη στήλη με αυτό (πρώτα). Τα μικρά μόρια εισχωρούν στην πηκτή και η μέση ταχύτητα είναι ανάλογη με το χρόνο παραμονής μέσα στον κόκκο (χώρο) της πηκτής. Άρα, κινούνται με μικρότερη ταχύτητα και εξέρχονται αργότερα. Ο Flodin στήριξε την εξήγησή του στο ότι ο συντελεστής κατανομής μεταξύ κινητής και στατικής φάσης επηρεάζεται από στερεοχημικούς παράγοντες. Για την περιγραφή του φαινομένου, λαμβάνονται υπόψη οι εξής παράμετροι για το πληρωτικό υλικό, τη ροή και τη συμπεριφορά του δείγματος στην πηκτή.  Παράμετροι κλίνης Η γεωμετρία και οι διαστάσεις της κλίνης είναι καθοριστικοί παράγοντες Ο ολικός όγκος της κλίνης Vt υπολογίζεται από τις διαστάσεις της κλίνης Ο νεκρός όγκος (void volume) Vo είναι ο όγκος του υγρού μεταξύ των κόκκων της κλίνης. Υπολογίζεται με τη βοήθεια δείγματος που εκλούεται τελείως χωρίς κατακράτηση των μορίων και μπορεί να μετρηθεί σε ενώσεις μεγάλου μοριακού βάρους. Για υλικά με σκληρούς κόκκους του ίδιου μεγέθους ο νεκρός όγκος είναι 35% του ολικού όγκου της στήλης. Συνήθως, όμως, τα χρησιμοποιούμενα υλικά είναι λιγότερο σκληρά και ο νεκρός όγκος είναι μικρότερος Ο όγκος του πληρωτικού υλικού είναι Vx είναι Vt-Vo Μεταβλητές για το χαρακτηρισμό της χρωματογραφικής κλίνης ΩVx ΩVo ΩVt  Παράμετροι ροής και συμπεριφορά δείγματος Παράμετροι ροής Η ταχύτητα ροής μετρείται σε mL/min ή mL/h Για σύγκριση με διαφορετικές στήλες, η ταχύτητα ροής μετρείται σε mL/min.cm2 ή cm/min Συμπεριφορά δείγματος Σημαντικός παράγοντας είναι ο όγκος έκλουσης κάθε συστατικού V1, δηλ. ο όγκος που απαιτείται για την πλήρη έξοδο κάθε συστατικού από τη στήλη. Το V1 είναι ανεξάρτητο από την ταχύτητα ροής, αλλά εξαρτάται από τη γεωμετρία της στήλης. Για να μην υπάρχει επίδραση των διαστάσεων της στήλης στη συμπεριφορά του δείγματος έχουν εισαχθεί οι παρακάτω μεταβλητές: Σχετικός όγκος έκλουσης V1/Vo: παρουσιάζει μικρές διακυμάνσεις, αλλά προσδιορίζεται εύκολα Σταθερά κατακράτησης R: Το αντίστροφο του σχετικού όγκου έκλουσης. Ανάλογη της ταχύτητας μετανάστευσης Rf. O λόγος V1/Vt: Υπολογίζεται εύκολα και παρουσιάζει μικρότερες διακυμάνσεις από το σχετικό όγκο έκλουσης Συντελεστής κατανομής k: Ορίζεται από τη σχέση V1=V0+kVs Vs = όγκος της στατικής φάσης V −V Αν όλο το πληρωτικό υλικό είναι η στατική φάση τότε Kαν= 1 0 Vx V −V Αν η στατική φάση είναι μόνο το υγρό που εγκλωβίζεται στο πλέγμα της πηκτής, τότε Kd = 1 0 Vt  Παράμετροι ροής και συμπεριφορά δείγματος Σχέση μεταξύ παραμέτρων που χαρακτηρίζουν τη συμπεριφορά του δείγματος  Παράμετροι για το χαρακτηρισμό της πηκτής Όριο διαχωρισμού (Exclusion limit) Το ανώτατο όριο περιοχής του κλασματικού διαχωρισμού για ένα είδος ουσιών. Το όριο διαχωρισμού είναι το μοριακό βάρος των μικρότερων ουσιών που δεν μπορούν να διεισδύσουν στους κόκκους των σωματιδίων της πηκτής. Χρησιμοποιείται το μοριακό βάρος αντί της ακτίνας Stokes (μεγαλύτερη ακρίβεια). Το όριο διαχωρισμού πάντα δηλώνεται για ποιο είδος ουσιών έχει υπολογισθεί. Όγκος κατακρατούμενου διαλύτη Sr (Solvent regain) Είναι ο όγκος που απορροφάται από ένα γραμμάριο ξηρής πηκτής κατά τη διάρκεια διόγκωσής της. Δεν περιλαμβάνει τον όγκο μεταξύ των κόκκων της πηκτής. Για πηκτές δεξτράνης και πολυακρυλαμιδίου, ο Sr σχετίζεται με τις ιδιότητες κλασματικού διαχωρισμού. Μικρό Sr συνδέεται με (περιοχές κλασματικού διαχωρισμού) όριο διαχωρισμού μικρού μοριακού βάρους.  Γραφική παράσταση μοριακών παραμέτρων – ιδιοτήτων έκλουσης Στη χρωματογραφία πηκτής, η συμπεριφορά του δείγματος μπορεί να συσχετισθεί με Το μέγεθος των μορίων Την ακτίνα Stokes Το μοριακό βάρος Ο Andrews πρότεινε τη βασική γραφική παράσταση μεταξύ V1/Vo, V1/Vt, kd, και kαν με το μοριακό βάρος σε λογαριθμική κλίμακα Πλεονεκτήματα Τα σφάλματα διατηρούνται σταθερά κατά μήκος των αξόνων Η παράσταση είναι ενδεικτική των αντιδράσεων των διαφόρων πηκτών Ο λογαριθμικός άξονας για τα μοριακά βάρη επιτρέπει να έχουμε όλη την κλίμακα τιμών χωρίς σφάλματα, ιδιαίτερα για ενώσεις με μικρό μοριακό βάρος (σφαιρικές πρωτεΐνες) Γραφική παράσταση μοριακών παραμέτρων – ιδιοτήτων έκλουσης Γραφική παράσταση μοριακών παραμέτρων – ιδιοτήτων έκλουσης  Διήθηση με μεμβράνες Οι μεμβράνες είναι προσαρμόσιμα συστήματα Προσαρμογή σε αντιδραστήρες Χρήση από το δεύτερο Παγκόσμιο Πόλεμο Επιτυγχάνονται διαχωρισμοί χωρίς αλλαγή φάσης και άρα κατανάλωση ενέργειας Οι μεμβράνες τείνουν να καταργήσουν τα συστήματα διήθησης. Αλλά, υπάρχουν μειονεκτήματα. Μειονέκτημα: Η απόφραξη, η οποία συνήθως δεν είναι αντιστρεπτή Στην κατηγορία αυτή διήθησης ανήκουν: Η υπερδιήθηση Η μικροδιήθηση Η αντίστροφη ώσμωση Η ηλεκτροδιάλυση Διήθηση με μεμβράνες  Υπερδιήθηση Η λειτουργία συστημάτων υπερδιήθησης γίνεται με εφαρμογή θετικής πίεσης και περιγράφεται από την εξίσωση KA Q=( )ΔP τ όπου Α = επιφάνεια της μεμβράνης Q = ροή μέσω της μεμβράνης Κ = διαπερατότητα της μεμβράνης τ = πάχος της μεμβράνης ΔP = η υδραυλική πίεση που εφαρμόζεται Τα υλικά που χρησιμοποιούνται είναι οξική κυτταρίνη, το PVC, το πολυακρυλονιτρίλιο, κ.ά. Οι μεμβράνες αυτές αντέχουν μέχρι τη θερμοκρασία 90-93 οC και σε μια περιοχή pH 0.5-12. Οι μεμβράνες αυτές υπερδιήθησης έχουν διάμετρο πόρων μερικά μm. Υπερδιήθηση Υπερδιήθηση  Άλλες τεχνικές διήθησης Μικροδιήθηση Οι μεμβράνες που χρησιμοποιούνται εδώ έχουν συνήθως διάμετρο πόρων 0.1-0.2 μm. Κατακρατούν κυρίως βακτήρια, δρουν ως αποστειρωτικά φίλτρα ή φίλτρα εγκλωβισμού σε αντιδραστήρες αερόβιων διεργασιών. Ηλεκτροδιάλυση Βασίζεται σε εφαρμογή ηλεκτρικού ρεύματος σε σειρά μεμβρανών που κατακρατούν εκλεκτικά ανιόντα και κατιόντα. Χρήση σε αφαλατώσεις. Αντίστροφη ώσμωση Ορισμένες μεμβράνες έχουν την ιδιότητα να επιτρέπουν τη διέλευση του διαλύτη (φάσης σε περίσσεια) από ένα αραιό διάλυμα σε ένα πυκνότερο (λόγω διαφοράς δυναμικού). Όταν η διαφορά πίεσης ανάμεσα στα δύο διαλύματα λόγω διαφοράς όγκου γίνει ίση με την ωσμωτική πίεση, η ροή σταματά. Έτσι, αν εφαρμόσουμε σε ένα πυκνό διάλυμα πίεση μεγαλύτερη της ωσμωτικής, θα γίνει διάχυση μόνο του διαλύτη μέσω της μεμβράνης. Επιτυγχάνεται ροή καθαρού υγρού στην έξοδο μιας τέτοιας συσκευής. Εφαρμογή σε διαχωρισμό πρωτεϊνών και μορίων μικρού βάρους. Μικροδιήθηση Ηλεκτροδιάλυση Αντίστροφη Ώσμωση  Παραδείγματα παραλαβής καθαρών πρωτεϊνών Κάθετη διεργασία Σειρά διαχωρισμών μέσω των οποίων η δραστική πρωτεΐνη (το προϊόν) διαχωρίζεται από άλλα πρωτεϊνικής ή μη πρωτεϊνικής φύσης σώματα. Για την περίπτωση πρωτεΐνης από τον οργανισμό E. coli, υπάρχουν τέσσερα στάδια Απομόνωση των ενώσεων εγκλίσεως Καθαρισμός της πρωτεΐνης σε μετουσιωμένη κατάσταση Αναδίπλωση της πρωτεΐνης σε βιοδραστική μορφή Τελικός καθαρισμός του βιοδραστικού προϊόντος  Παραδείγματα παραλαβής καθαρών πρωτεϊνών Α. Απομόνωση των ενώσεων εγκλίσεως (Inclusion bodies) Περιλαμβάνει: 1. Απομόνωση από τους ξενιστές 2. Διαλυτοποίηση Πρόκειται για συσσωματώματα με άκρως πυκνές δομές πρωτεϊνών, που παράγονται στο κυτταρόπλασμα του οργανισμού E. coli. Έχουν μερική δευτεροταγή δομή (όχι πλήρη) και το μέγεθός τους μπορεί να φτάσει το μέγεθος ενός κανονικού βακτηριακού κυττάρου. Τα πιο πολλά σώματα εγκλίσεως είναι ορατά σε οπτικό μικροσκόπιο. Μορφολογικά είναι διαφορετικά από άλλες ενδοκυττάριες δομές στο κυτταρόπλασμα. Απομόνωση Απομόνωση σημαίνει λύση των κυττάρων. Εξαρτάται από τους ξενιστές. Στην περίπτωση του οργανισμού E. coli, η εξωτερική μεμβράνη αποτελείται από λιποπρωτεΐνες, λιποπολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες. Η εσωτερική μεμβράνη αποτελείται από φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες. Στον περιπλασμικό χώρο υπάρχουν πεπτιδογλυκάνες. Όλες αυτές οι στοιβάδες δεν είναι εύκολο να διασπαστούν. Συνήθως, χρησιμοποιούνται υπέρηχοι μετά από ομογενοποίηση με υψηλή πίεση.  Παραδείγματα παραλαβής καθαρών πρωτεϊνών Διαλυτοποίηση Χρησιμοποιούνται 1. Υδροχλωρική γουανιδίνη 2. Ουρία (Η2ΝCONH2) Η απόδοση της διαλυτοποίησης εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης και το αντιδραστήριο μετουσίωσης, το pH, και την παρουσία σουλφυδρυλομάδων (-SH) Τα πιο πολλά σώματα εγκλίσεως είναι ορατά σε οπτικό μικροσκόπιο Μορφολογικά είναι διαφορετικά από άλλες ενδοκυττάριες δομές στο κυτταρόπλασμα.  Παραδείγματα παραλαβής καθαρών πρωτεϊνών Β. Παραλαβή πρωτεΐνης Γίνεται σε μετουσιωμένη, αλλά καθαρή κατάσταση με χρωματογραφικές τεχνικές. Γ. Αναδίπλωση του μορίου της πρωτεΐνης Πραγματοποιείται προς απόκτηση της φυσικής βιοδραστικής μορφής. Πρόκειται για πολύ σημαντικό στάδιο. Πραγματοποιείται με διαπίδυση, διήθηση και χρωματογραφία πηκτής. Για υποβοήθηση της αναδίπλωσης, μπορεί να προστεθεί και άλλη ένωση (πρόσθετα) στο ρυθμιστικό διάλυμα της πρωτεΐνης μας. Μπορεί να γίνει με σταδιακή διαλυτοποίηση ή χρήση αντίστροφων μικκυλίων. Δ. Παραλαβή της πρωτεΐνης σε καθαρή μορφή Για θεραπευτική χρήση χρειάζεται μια σειρά από χρωματογραφικές μεθόδους που εξαρτώνται από τη σταθερότητα της πρωτεΐνης και την καθαρότητα που θέλουμε να πετύχουμε. Τα στάδια αυτά, όπως αναφέρονται στην περίπτωση της ινσουλίνης που προκύπτει από εφαρμογής της τεχνικής ανασυνδυασμένου DNA, φαίνονται στο παρακάτω σχήμα.  Παραδείγματα παραλαβής καθαρών πρωτεϊνών Στάδια τελικού καθαρισμού και παραλαβής δραστικής ινσουλίνης από σώματα εγκλίσεως