Cellules Souches et Thérapie Cellulaire 2024 PDF

Utilisation des CELLULES SOUCHES en recherche fondamentale pour une médecine régénérative Pedro L. Herrera Faculté de Médecine, Université de Genève …qu’est ce que la “médecine régénérative” ? maladies dues à une mort cellulaire inappr...

Utilisation des CELLULES SOUCHES en recherche fondamentale pour une médecine régénérative Pedro L. Herrera Faculté de Médecine, Université de Genève …qu’est ce que la “médecine régénérative” ? maladies dues à une mort cellulaire inappropriée et massive : 1. déficiences immunitaires sévères 2. diabète 3. lésions de la moelle épinière 4. démyélinisation des nerfs 5. maladie de parkinson 6. infarctus du myocarde …  « médecine régénérative » …thérapie de remplacement ou « rechange » des cellules manquantes… …produites à partir de « cellules souches » ou « progénitrices » … ou de cellules adultes différenciées !!! (par « reprogrammation cellulaire ») « THERAPIE CELLULAIRE »  Médecine Régénérative: deux approches génération ex vivo de cellules de remplacement obtenues à partir de cellules souches dérivées du patient : moelle, cellules ES ou cellules iPS 4 1 cellules de remplacement dérivées du patient 3 2 exploiter la capacité de régénération (intrinsèque) de l’organe  …C’est quoi une cellule souche ? division p. ex. asymétrique peau p. ex. poil cellule cellule cellules « souche » « engagée » « différenciées » (« juvénile ») cellules indifférenciées … …y a-t-il des cellules souches chez l’adulte ? differentiation potential totipotent zygote, blastomere pluripotent ICM/ES cells, EG cells, EC cells, mGS cells, iPS cells multipotent adult stem cells unipotent differentiated mature cell types ectoderm mesoderm endoderm trophoblast Epigenetics and differentiation potential (cell fate) : pluripotent multipotent unipotent  cellule totipotente le potentiel de différenciation cellulaire (zygote, blastomère), à potentiel illimité cellule cellule pluripotente cellule “juvénile”, « souche » (masse cellulaire interne, ES, iPS), indifférenciée (pluripotente) peut donner tous les tissus de l’organisme (ecto-, méso- et endoderme) _ spécification cellule cellule multipotente différencia tion « progénitrice » (cellules souches « adultes »), (souvent appelée aussi peut donner tous les types cellulaires « cellule souche », par extension) d’un tissu (p. ex. : cellules souches du sang) (multipotente) détermination cellule cellule unipotente « précurseur » le potentiel de différenciation + (unipotente) est restreint : elle ne peut donner qu’un seul type cellulaire mature différenciation cellule “mature”, cellule spécialisée « différenciée » …y a-t-il des cellules souches « adultes » ? …OUI: système de « réparation » du corps ! Des cellules souches indifférenciées et multipotentes persistent dans l’organisme adulte (grâce aux divisions asymétriques) Traitement des leucémies…  …il y a des cellules souches aussi dans le cordon ombilical et le placenta …potentiellement utiles pour traites des maladies génétiques  …et les cellules souches « embryonnaires » zygote (souris)  Masse cellulaire interne Obtention de cellules souches « embryonnaires » (ES cells) zygote ~5 jours de développement  Les cellules souches « embryonnaires » (« cellules ES ») sont PLURIPOTENTES …mais on commence seulement à maîtriser la façon de diriger in vitro la différenciation des cellules souches…  organoïdes, embryoïdes et gastruloïdes Un organoïde est une version miniature et simplifiée d’un organe, fabriquée in vitro avec une “micro-anatomie”. Un embryoïde est ainsi une version d’un embryon précoce (“blastoïde”), et un gastruloïde est un modèle in vitro d’un embryon pendant la gastrulation. Ils sont issus de cellules souches embryonnaires (ESc) ou de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), ou autres cellules souches tissulaires, qui peuvent s'auto-organiser en structures tridimensionnelles grâce à leurs capacités d'auto-renouvellement et de différenciation. (gastruloïdes) (organoïde intestinal)  vers une thérapie cellulaire du diabète actuellement : transplantation d’îlots pancréatiques en recherche biomédicale : utilisation des cellules souches embryonnaires (“cellules ES”) et surtout des cellules pluripotentes induites (“cellules iPS”)  diabète : polyurie associée à polydipsie diabetes insipidus diabetes mellitus défaut en ADH (vasopressine) : hyperglycémie; glycosurie mauvaise réabsorption de l’eau dans les reins type II type I, déficience relative d’insuline juvénile (épuisement de production) : “résistance à l’insuline”; obésité manque absolu d’insuline : destruction des cellules diabète gestationnel (grossesse) : productrices d’insuline fœtus de grande taille (par le système immunitaire) Avec une composante génétique : MODY (diabètes monogéniques) NEONATAL (sécrétion d’insuline inhibée) Pancréas murin (= de souris) îlots pancréatiques Exocrine: 99% Endocrine (îlots): 1% Ilot de Langerhans ( = îlot pancréatique) (souris) Insuline Glucagon Cellules : 70-80% insuline Cellules : 15% glucagon Cellules : 4-5% somatostatine Cellules PP: 1% PP … Vers une thérapie cellulaire pour traiter le diabète ?  thérapie cellulaire : “protocole Edmonton” (transplantation d’îlots pancréatiques …dans le foie!)  « CLONAGE THÉRAPEUTIQUE » par transfert de noyau d’une cellule du corps du patient… fécondation in vitro (SCNT) ovule spermatozoïde zygote extraction du noyau du zygote (énucléation) transfert du noyau cellule d’une cellule du patient du patient zygote cloné à partir du patient (2018)  (2011) production de cellules hES à partir d’un patient diabétique (technique de clonage thérapeutique) En théorie… SCNT = transfert du noyau d’une cellule somatique du patient Traitement du Diabète Type I « clone » du patient obtention de cellules souches embryonnaires… …différenciation en cellules … CLONAGE THÉRAPEUTIQUE CLONAGE THÉRAPEUTIQUE CLONAGE REPRODUCTIF Conflit d’ordre éthique !!! Les cellules souches pluripotentes induites (iPS cells) sont des cellules pluripotentes obtenues à partir de cellules somatiques adultes. Elles permettent de contourner les problèmes éthiques liés à la production de cellules souches embryonnaires (clonage d’embryons humains). Cette technique permet de fabriquer des cellules souches "à la carte » pour la médecine régénératrice.  La reprogrammation cellulaire vers l’état de non-différenciation peut se faire par effacement des marques épigénétiques et forçant l’expression de facteurs de transcription du développement  Production de cellules iPS cells (cellules souches pluripotentes induites) : par transfection (avec des retrovirus) de certains “stem cell-associated” gènes dans des cellules non pluripotentes (p.ex.. fibroblastes adultes): régulateurs de la transcription comme Oct-3/4 (Pouf51), Nanog et Sox2, entre autres. Après 3–4 semaines, quelques- unes parmi les cellules acquièrent la morphologie et les trait biochimiques typiques des cellules souches pluripotentes. ➔ Nanog, Oct4 et Sox2 sont fortement exprimés dans l’épiblaste !!! Pertinence clinique des cellules iPS. La technologie des cellules iPS a des applications potentielles passionnantes dans la modélisation des maladies et la découverte de médicaments. La thérapie de remplacement cellulaire avec des cellules saines dérivées de cellules iPS est également un développement futur possible. Les mutations génétiques peuvent être ciblées par des approches de thérapie génique avant ou après reprogrammation.  Cellules « iPS » (induced Pluripotent Stem Cells) = cellules souches pluripotentes induites par « reprogrammation » de cellules adultes différenciées !!! cellule de la peau du patient cellules-souche pluripotentes induites thérapie par remplacement cellulaire En 2006 (Yamanaka) …pas besoin de produire Prix Nobel en 2012 !!! des embryons par clonage !!! Generation of kidney organoids from human iPS cells 31 octobre 2024 Regenerative Medicine for Diabetes by generating surrogate cells, for cell replacement (“ex vivo cell reprogramming”) knowledge diabetic patient disease modeling or recapitulation in humanized mice DiPS …vers des nouvelles thérapies pour traiter la stérilité féminine… via la production d’ovocytes par reprogrammation cellulaire 10 novembre 2016 La modification du génome “ à la carte ”, in vitro ou in vivo : CRISPR/Cas9 CRISPR / Cas9  …le danger de l’eugénisme ! la « science de l’amélioration des lignées animales » appliquée aux êtres humains, sur le modèle de l’élevage sélectif des animaux (Francis Galton, XIXè siècle)… 2018: un chercheur chinois a utilisé CRISPR, de façon illégale, pour modifier le génome de deux embryons, après FIV. Il est en prison (... bon, il est ressorti maintenant !) Il avait inactivé un gène (CCR5) pour conférer aux embryons une résistance au virus du SIDA. Ces deux embryons sont devenus deux fillettes qui vont très bien. Après coup, on a découvert, avec des souris KO, que ce gène CCR5 est impliqué dans la suppression (effacement) de la mémoire et dans la capacité des neurones à établir des nouvelles connexions (synapses)… rétinite pigmentaire (maladie génétique de l’oeil -cécité) (1er décembre 2016)  Drépanocytose (anémie falciforme) mutation sur un des gènes codant l’hémoglobine (un nucléotide du gène HBB, chaîne  de l’hémoblogine A; chr. 11) érythrocytes érythrocytes normaux drépanocytaires Des perspectives intéressantes grâce aux outils d’edition du génome (tel le système CRISPR-Cas9) : l’idée est de les utiliser pour corriger directement la mutation responsable de la maladie, ou pour modifier les régions régulatrices, en particulier au niveau du gène BCL11A, afin d’inhiber la production de l’hémoglobine mutée au profit de l’hémoglobine fœtale dont le gène est réprimé dès la naissance. Concrètement, la mise en œuvre de ces approches passe par le recueil de cellules souches hématopoïétiques du patient, la réalisation de la modification génétique thérapeutique (insertion du gène normal ou suppression d’un gène régulateur de l’hémoglobine fœtale), puis la réinjection des cellules modifiées dans l’organisme du patient après conditionnement (chimiothérapie myéloablative comme dans l’allogreffe). génération de “chimères inter-espèce” : porc / humain chimère porc / humain morula de porc transgénique zygote fibroblastes de porc de porc modifiés génétiquement (CRISPR) : Porc avec un organe inactivation d’un gène (dérivées du (le pancréas dans cet nécessaire pour le patient, et modifiées exemple) dérivé des avec CRISPR) développement d’un organe cellules iPS humaines, (p.ex. : gène PDX1, requis pour car elles possèdent le le développement du pancréas) gène PDX1 fonctionnel …il est possible de générer des chimères porc/humain avec des cellules iPS humaines injectées dans des blastocystes transgéniques de porc, pour produire des organes “humanisés”…, c.-à-d. dérivés uniquement des cellules iPS humaines.  Médecine Régénérative: deux approches génération ex vivo de cellules de remplacement obtenues à partir de cellules souches dérivées du patient : moelle, cellules ES ou cellules iPS 4 1 cellules de remplacement dérivées du patient 3 2 exploiter la capacité de régénération (intrinsèque) de l’organe L’étonnante capacité de régénération du foie… le Titan Prométhée “Prometeo”, José de Ribera (1630)  Est-ce que le pancréas adulte peut régénérer de nouvelles cellules à insuline après les avoir perdues ? (c.-à-d., comme chez les patients diabétiques type 1) ➔ REGENERATION ? Comment étudier la régénération pancréatique ? souris transgéniques Comment rendre une souris diabétique ? Par élimination des cellules β… …en rendant uniquement les cellules β sensibles à une toxine, dans une souris transgénique  Deux types d’expériences chez la souris: - ablation ( = destruction) cellulaire - traçage des lignages cellulaires Modèle Transgénique d’ablation inductible et rapide des cellules β : sans inflammation ou auto-immunité ZYGOTE MURIN Production de souris transgéniques par micro- injection dans le zygote : 1. d’ADN (le « transgène ») (intégration au hasard : transgenèse «classique»), ou mieux encore 2. de Cas9 + guide RNA + l’ADN à insérer (intégration dirigée : souris «knock-in»)  injection Souris de toxine diphtérique (DT) Pas d’effet Les souris sont insensibles à DT Souris injection de transgénique toxine (DT) Mort des cellules à insuline Les cellules β sont sensibles à (β) DT  transgène: “RIP-DTR” promoteur récepteur de la du gène de l’insuline toxine diphtérique (DTR) (human HB-EGF)  + NICOTINAMIDE + H+ EEF2 + NAD+ ADP-RIBOSE-DIPHTHAMIDE-EF2 DTA (toxine diphtérique) inhibition de la synthèse de protéines: mort cellulaire (apoptose) RIP DTR DT Insuline Glucagon Somatostatine DAPI  Elimination des cellules β Cellules β sensibilisées injection de toxine diphtérique Avant Après Cellules à insuline: 100% > 0,1% ! Souris “saine” DIABETIQUE Traitement: insuline  Toxine Destruction des cellules à insuline chez des souris adultes Souriceau Adulte Agée Après 15 jours 1 mois 10 mois glucagon Toxine Cellules à insuline: 100% 0.4% 1.2% 4% 17% 99%  Réapparition progressive de nouvelles cellules à insuline au cours du temps …mais régénération lente et partielle  Quelle est l’origine des nouvelles cellules à insuline?  souris transgéniques Rapporteur Marqueur X gène cellule α STOP Lac Z « bleu » promoteur du gène du Cre recombinase (à glucagon) inactif LoxP glucagon souris doublement transgénique cellule α (à glucagon): gène rapporteur X activé X Tous les descendants de la cellule marquée sont marqués X X X aussi, de façon irréversible!  Les cellules α (à glucagon) sont marquées irréversiblement (bleues) souris transgénique: Glucagon-Cre; R26R Ilot de Langerhans ( = îlot pancréatique) Marquage du lignage des cellules à glucagon et ses descendants injection de DT nouvelles cellules β cellules  YFP+ régénérées ? cellules α YFP+ (glucagon) ?  Origine des nouvelles cellules à insuline ? insuline glucagon superposition Rapidement après la destruction des cellules β: Des cellules produisant simultanément de l’insuline et du glucagon Nouvelles cellules à insuline Traceur de cellules α Les nouvelles cellules à insuline sont des cellules à glucagon (α) reprogrammées naturellement !  Conclusion intermédiaire Les cellules à glucagon (α) se convertissent en cellules à insuline après l’élimination quasi-totale des cellules β chez les souris adultes Toxine Souriceau Adulte Agée Cette régénération n’est pas efficace: seulement 2% cellules à glucagon se convertissent Une bonne nouvelle: Capacité de régénération préservée dans le temps Toxine Les cellules à glucagon se convertissent Souriceau Adulte Agée aussi chez les souris agées L’insuline agît elle même comme un frein constitutif qui restreint la plasticité des cellules alpha. Le maintien de l’identité cellulaire est un processus actif médié par des signaux répressifs qui refrènent une tendance naturelle des cellules à changer.  Qu’en est-il chez l’Homme? ❖Îlot humain : DIABETE type 2 DIABETE type 1 insulin glucagon insulin glucagon somatostatine somatostatine Cellules produisant de l’insuline Cellules produisant de l’insuline et et du glucagon la somatostatine Pourrait suggérer que des cellules humaines α (glucagon) et  (somatostatine) se convertissent en cellules à insuline dans le diabète de type 1 et 2 Observation surprenante: Ablation du pancréas chez enfants (si tumeurs) => diabétiques … redeviennent souvent normo- glycémiques! Régénération par conversion cellulaire ? à partir de cellules  ? (analogie / jeunes souris)  Qu’en est-il chez l’Homme? Quelques rares cellules β persistent dans le pancréas de patients humains avec un diabète de type I depuis de nombreuses années: est-ce que ce sont des cellules β qui ont « échappé » au système immunitaire (auto-immunité) ? est-ce qu’il s’agît de cellules β nouvellement formées (c.-à-d. régénérées) ?  isolation et induction purification génique reaggrégation production cellulaire α-cells d’insuline ? facteurs de β-cells “pseudo-îlots” à reprogrammation γ-cells + GFP cellules alpha fonctionnelles ? FACS îlots de donneurs δ-cells sains ou diabétiques transplantation chez la souris (in vivo) en culture (in vitro) Insulin Glucagon GFP DAPI Insulin Glucagon GFP DAPI Control (GFP) Engrafted pseudoislets (αPM) α-cell pseudoislet after 1 month PM les cellules non-beta humaines reprogrammées secrètent de l’insuline en réponse au glucose les cellules non-beta humaines qui secrètent de l’insuline en réponse au glucose guérissent le diabète des (DAPI: marqueur de l’ADN des noyaux) souris transplantées  Régénération du Pancréas Adulte Le pancréas adulte des mammifères a la capacité intrinsèque de régénérer des cellules à insuline nouvelles après leur perte totale. Les cellules productrices de glucagon, de somatostatine et de polypeptide pancréatique (les cellules « non-beta ») peuvent, dans des conditions appropriées, se « reprogrammer » (convertir, « transdifférencier ») naturellement pour faire de l’insuline. Plasticité Cellulaire