Tema 6. Identificación de Microorganismos Industriales PDF

Tema 6 Tema 6. Identificación de microorganismos industriales y monitorización de poblaciones en la industria. 1 Interés de la identificación (especies y cepas). - Conocer la enología de la fermentación y su influencia en la elaboración de vino. - Determina...

Tema 6 Tema 6. Identificación de microorganismos industriales y monitorización de poblaciones en la industria. 1 Interés de la identificación (especies y cepas). - Conocer la enología de la fermentación y su influencia en la elaboración de vino. - Determinar la dominancia de las levaduras inoculadas y sus posibilidades biotecnológicas. - Evitar la reselección de cepas vínicas. Desde hace muchos años, en el mercado existen muchas levaduras francesas que son reseleccionadas y aisladas, por lo que al intentar seleccionar una levadura autóctona en estos años es muy difícil, ya que muchas veces se selecciona erróneamente una levadura “vieja”, usada muchas veces dando así vinos muy parecidos y poca personalidad entre bodegas. 2 Identificación de microorganismos enológicos. 3 Técnicas clásicas. Se utilizan criterios morfológicos, bioquímicos y fisiológicos mediante claves dicotómicas. Algunos ejemplos son: Tema 6 En algunos casos se requiere de más de 100 pruebas para identificar un microorganismo. Para levaduras y bacterias vínicas se puede simplificar a unas 20-30 pruebas, si se sabe de dónde vienen. 3.1 Técnicas morfológicas Levaduras - Morfología de colonia en medio sólido. - Observación microscópica.  Tema 6 Según el tipo de división se puede dividir en: Multilateral Bipolar (asexual) Fisión Reproducción secual: Levaduras “perfectas”. Para observar las esporas de las levaduras en el microscopio se deben seguir ciertos pasos: 1) Incubar en medio de esporulación a 25ºC durante 3-7 días. 2) Si no aparecen esporas, transferir a otro medio y esperar otras 2-3 semanas. 3) Teñir las esporas, sin el tinte éstas no se observan bien Formación de pseudomicelio. Para la mejor observación no teñir. - Incubar sobre una fina lámina de medio PDA sobre un portaobjetos a 25ºC durante 4-7 días. - Observar después al microscopio en el porta. Pseudomicelio simple Pseudomicelio. Con Pseudomicelio con Pseudomicelio con Verdadero micelio (Sin blastosporas). blastosporas alargadas blastosporas esféricas en blastosporas alargadas con artrosporas en una sola fila. Tipo una sola fila. Tipo en cadenitas. Tipo terminales. Mycocandia. Mycetórula Blastodendrium Tema 6 Mohos - Observación microscópica. Crecimiento de los Mohos. Las hifas de los mohos se rompen con facilidad cuando se manipulan, por ello es necesario crecerlos sobre el propio portaobjeto para observarlos al microscopio. El medio utilizado es el mismo que para pseudomicelio (PDA) o también Agar Saboraud. Se utilizan portas muy gruesos que en el medio presentan un hueco donde se coloca el medio para el crecimiento del microorganismo y tras esto se coloca el sube objetos. Ésto se hace para que crezca el microorganismo sin alterar el crecimiento. Bacterias. - Esféricas - Elipsoidales cocos. - Cilíndricas, bacilos, bastones. - Helicoidal-espiral - Cocos en cadena, en pareja, en tétradas, cubos, racimo. - Bacilos en cadena, empalizada. 3.2 Técnicas bioquímicas y fisiológicas. Levaduras Crecimiento en distintos medios. Agar acetato 1 % selectivo para Zygosaccharomyces. Agar cicloheximida, que para la síntesis de proteínas en eucariotas (actidiona) 0,01 % selectivo para Brettanomyces. ○ Inhibe la síntesis de proteínas a nivel de la elongación, ○ Específica de eucariotas. ○ Ésta levadura es resistente al producto. GYC observación de la formación de halos disolución precipitados,… (Brettanomyces). Fermentación de azúcares. Medio líquido (0,67 % Yeast Nitrogen Base, 2 % azúcar a testar) con campana de Durham, se utiliza para comprobar la fermentación. Esterilizar los mono-, di-y trisacáridos por filtración. Inocular la levadura y dejar crecer a 25-30ºC durante 2-3 días. La prueba es positiva si aparece gas en la campana. Los azúcares a probar son: - Glucosa. - Galactosa. - Maltosa. - Melibiosa. - Lactosa. - Sacarosa. - Celobiosa. - Rafinosa. Tema 6 Asimilación de compuestos carbonados. Medio SÓLIDO (0,67 % Yeast Nitrogen Base sin aminoácidos, 1 % compuesto a testar, 2% agar). Si se añaden ácidos es necesario ajustar el pH a 5,5 mínimo antes de autoclave. Sembrar la levadura con un palillo o asa y dejar crecer a 25-30ºC durante 2-3 días. Nota: Se pueden probar varias colonias en una misma placa. La prueba es positiva si crece la levadura en el medio. Como control se debería sembrar las mismas levaduras en el mismo medio sin fuente de carbono. Los compuestos a probar son: - D-glucosa. - Maltosa. - myo-Inositol - D-glucuronato. - DL-ácido láctico. Asimilación de nitrógeno. Medio SÓLIDO (1,17 % Yeast Carbon Base, 1 % compuesto a testar, 2% agar). Si se añade nitrito es necesario ajustar el pH a 6,5. Proceder como anteriormente Los compuestos a probar son: - Nitrato. - Nitrito. - Etilamina - L-lisina (Para Saccharomyces). - Cadaverina. - Glucosamina. Auxonogramas. - Una alternativa para ver la asimilación de fuentes de C o N es el uso de auxonogramas. - Se utilizan los mismos medios pero sin fuente de C o N. - Se inoculan antes de solidificar(45ºC) con la levadura en estudio. - Una vez enfriado el medio se colocan 5 mg del compuesto a analizar sobre un punto determinado de la placa. - Se pueden hacer varias pruebas por placa (4-6). - Las placas no se incuban invertidas. - El crecimiento se detecta por la formación de turbidez alrededor del punto en el que se colocó el compuesto. No crece sin el compuesto. La levadura crece dónde estén situadas las gotas con el compuesto. Se siembra la levadura y se pone la gota. Kits de identificación de microorganismos. Existen varios kits comerciales (galerías de identificación) que permiten realizar muchas de las pruebas de fermentación, asimilación, etc, indicadas de manera rápida (24-48 horas) y con pequeños volúmenes (microtests): Estas pruebas se desarrollaron para microorganismos de interés clínico, y en el caso de los microorganismos del vino no basta con estas pruebas para identificarlos, siendo necesario el uso de algunas pruebas complementarias (morfológicas, esporulación, asimilación y fermentación de otros compuestos,...). Tema 6 - El microorganismo (crecido en medio líquido) se siembra en cada uno de los pocillos de la galería con una pipeta. - Se incuba el tiempo recomendado por el fabricante. - Se observa el resultado de cada una de las pruebas comparándolo con una ficha proporcionada por el fabricante, obteniéndose un código que se correlaciona con un determinado microorganismo. Existen aparatos que leen las tiras y proporcionan el resultado automáticamente. Identificación de levaduras del vino. A través de una clave dicotómica, se van asociando las características hasta encontrar el microorganismo que tenemos, en caso contrario definirlo como un nuevo microorganismo. Bacterias. Tema 6 Identificación de levaduras del vino. Prueba catalasa. Distingue bacterias aerobias (catalasa +) de anaerobias (catalasa -). Se añade agua oxigenada (H2O2 ) al microorganismo, desprendiendo este oxígeno si la prueba es positiva. Oxidación de lactato. Acetobacter se diferencia de Gluconobacter en que la primera tiene la capacidad de oxidar el lactato hasta CO2 y H2O. Para seleccionarla deben crecer la bacteria en medio sólido con lactato cálcico. El desarrollo de Acetobacter provocará la formación de precipitados de carbonato cálcico. Tema 6 Ketogénesis. A. aceti y A. pasteurianus pueden distinguirse por su diferente capacidad para oxidar el glicerol (no reductor) a dihidroxiacetona (reductora), que puede detectarse por cualquier método de medida de azúcares reductores. Se crece la bacteria en un 10-15 mL de un medio con 80 mL de agua, 0,5 g de extracto de levadura y 2 mL de glicerol. Su función es analizar la aparición de azúcares reductores. La prueba positiva indica la presencia de A. aceti. Producción de ácido 5-Ketoglucónico. A. aceti y Gluconobacter producen cristales de este ácido cuando crecen en medio GYC (glucose yeast extract carbonate) pasadas 2-3 semanas. Gluconobacter produce además pigmentos marrones solubles en agua. Diferenciación entre bacterias lácticas. Las bacterias homofermentativas se pueden distinguir de las heterofermentativas porque las segundas producen gas al fermentar la glucosa, para ello se crecen en tubos con medio líquido (TJB o similar) con campana Durham. Para diferenciar los coco-bacilos de L. oenos* de los pequeños bacilos de Lactobacillus sp. Se puede realizar la prueba de producción de amonio a partir de arginina, ya que los lactobacilos forman amonio. Procedimiento: - Las bacterias se crecen en 2 mL de un medio con arginina (0,6 %), jugo de tomate y glucosa (2 %). - Incubar 3 semanas a 30ºC. - Transferir 1 mL a un medio sólido para detectar el amonio y añadir 3 gotas de reactivo de Nessler´s. Si el medio cambia de color pasando a rosa-naranja la prueba es positiva. 3.3 Técnicas moleculares. Levaduras. Identificación mediante análisis total o parcial del genoma o análisis de la composición bioquímica del microorganismo. Se requieren pocas pruebas, aunque son más complejas que las técnicas clásicas. Para poder hacer éste tipo de pruebas se necesitan conocimientos previos. Con el desarrollo de nuevas técnicas, éstas pruebas se van simplificando y bajando el precio. Permiten diferenciar entre cepas, y el resultado se obtiene más rápido (horas a pocos días). Por sí solas algunas no suelen ser definitivas, por lo que se necesita del uso de los métodos clásicos Se pueden analizar perfiles de lípidos, de proteínas celulares, o la estructura molecular del material genético. Eran caros, mucho trabajo y frecuentemente no definitivos. Hoy son más asequibles. Identificación a nivel de especie - Pruebas morfológicas. - Electroforesis de cariotipos. Identificación a nivel de estirpe (cepa). - PCR-RFLP de DNA ribosomal. Tema 6 Cuando únicamente queremos detectar la presencia de un microorganismo en una muestra, el procedimiento puede ser mucho más sencillo. Casi todas las técnicas moleculares se basan en 3 técnicas comunes en biotecnología: 1. Electroforesis de DNA o proteínas. 2. PCR. 3. Análisis con enzimas de restricción del DNA. MALDI-TOF. Identificación mediante espectrometría de masas (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry). Existe hace más de 30 años. En los últimos años han aparecido varias plataformas comerciales que permiten acceder más fácilmente a esta tecnología y aplicarla de forma más fiable, específica y rápida para identificar bacterias y hongos. La identificación de microorganismos se realiza mediante análisis de proteínas, principalmente ribosómicas, creando un espectro de masas que se supone específico para cada especie. Un microorganismo dado presentará siempre una serie de picos característicos en el espectro, y esto permite la creación de bases de datos con los espectros de masas de distintos microorganismos. El espectro de un determinado microorganismo se compara automáticamente con la base de datos. NO DNA Análisis de los ácidos grasos celulares. Cultivo de los organismos en condiciones estandarizadas. Extracción de los ácidos grasos de las células en fase estacionaria por saponificación. Análisis por cromatografía (gas líquido, de gases o capilar) y comparación con bases de datos de los resultados obtenidos y estadísticamente. Reproductividad, el análisis debe poder repetirse, los ácidos grasos dependen de las condiciones del cultivo, por lo que a veces se obtiene bien el análisis y otras no. Electroforesis de proteínas (PAGE) o fracciones extracelulares. Cultivo en condiciones estandarizadas. Se basa en la extracción de las proteínas o separación de las fracciones extracelulares. Se hace una electroforesis en gel de poliacrilamida, desnaturalizados normalmente, se obtiene un patrón de bandas, y se compara con bases de datos y estadística. Dentro de la reproductividad, en éste método, depende de las condiciones de cultivo. Tema 6 DNA Electroforesis de DNA (dsDNA). El ADN presenta en solución carga negativa, por lo que aplicando un campo eléctrico pueden ser separados fragmentos de distinto tamaño. Se realiza normalmente sobre geles de agarosa en posición horizontal. Tras separar los fragmentos se revelan por fluorescencia del bromuro de etidio que se une al ADN. Existen lectores automáticos para esta labor. Combinada con otras técnicas es una potente arma para la identificación de microorganismos. Electroforesis de cromosomas enteros en campo pulsante (PFGE). Las electroforesis unidimensionales tienen el problema de que sólo pueden separar fragmentos pequeños de ADN (100 pb a 50 Kpb). Con la PFGE se resuelve este problema, pudiéndose separar cromosomas enteros (hasta 6000 Kpb). Consiste en aplicar campos eléctricos con dirección alternada: - OFAGE perpendicular - FIGE inversión - TAFE transversal (ver figura) - CHEF ver figura Utilizada para realizar seguimiento de la cepa inoculada en una fermentación. Las levaduras de distintas especies presentan perfiles electroforéticos MUY DISTINTOS, mientras que las que presentan de la misma especie muestran patrones ligeramente distintos. Para bacterias se puede utilizar también PFGE, asociado normalmente a análisis de restricción. Análisis de restricción de DNA. Las enzimas capaces de cortar el DNA son las enzimas de restricción. Se encuentran de forma natural en las bacterias para protegerse del DNA extraño. Cortan el DNA en sitios específicos, generalmente entre 4-11 nucleótidos de longitud. Se conocen más de 600 endonucleasas de restricción en bacterias. Si fragmentamos el DNA con una determinada endonucleasa aparecen fragmentos específicos que podremos separar mediante la electroforesis. Cada especie dará unos fragmentos distintos (perfil de restricción distinto). Tema 6 Huella genética del DNA total (FINGERPRINT). Permite detectar diferencias a nivel de cromosomas y comprobar la estabilidad genómica de las levaduras industriales. Pone en evidencia diferencias más pequeñas en el DNA que las observadas con PFGE o con la separación de fragmentos de DNA mitocondrial, permitiendo evaluar mejor el nivel de parentesco entre 2 cepas. La metodología se basa en: 1. Aislar DNA totalmente, 2. Digerir con enzimas de restricción 3. Separar los fragmentos por electroforesis, 4. Hibridar con sondas específicas de ADN (radiactivas)--. Generan perfiles de bandas simples y fáciles de comparar entre ellos. Análisis de restricción (RFLP) del DNA mitocondrial. Se utiliza de forma eficaz en laboratorios de empresa o de referencia, en éste caso en levaduras. Las cepas de levaduras enológicas presentan un importante polimorfismo intraespecífico del DNA mitocondrial. Extrayendo éste DNA, y sometiéndolo a las enzimas de restricción adecuadas, se obtiene un patrón distinto para cada cepa. Se utiliza para diferenciar distintas cepas de S. cerevisiae, para seguir la implantación de una cepa inoculada en una fermentación. Una variante más sencilla no mitocondrial. requiere la separación previa del ADN nuclear. Ambos ADN difieren considerablemente en el porcentaje de G+C (40% y 20 % respectivamente).-- Utilizando enzimas con puntos de corte ricos en G+C el ADN nuclear será fuertemente digerido, originando gran número de pequeños fragmentos. El ADN mitocondrial (menos fragmentado) aparecerá en la parte superior del gel. Se puede utilizar para más especies de levaduras que el anterior. Una variante más sencilla no mitocondrial. requiere la separación previa del DNA nuclear del mitocondrial. Ambos DNA difieren considerablemente en el porcentaje de G+C (40% y 20 % respectivamente). Utilizando enzimas con puntos de corte ricos en G+C el DNA nuclear será fuertemente digerido, originando gran número de pequeños fragmentos. El ADN mitocondrial (menos fragmentado) aparecerá en la parte superior del gel. Se puede utilizar para más especies de levaduras que el anterior. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Técnica que consiste en la amplificación ADN enzimática del entre dos regiones de secuencia conocida, de manera que a partir de una única copia de ADN podemos obtener muchas. Con el ADN amplificado se pueden realizar numerosos análisis. Para poder amplificar es imprescindible tener dos cebadores o primers que hibriden con el DNA a ampliar. También es necesario una DNA polimerasa que realice la replicación, y que soporte altas temperaturas (Taq polimerasa). PCR con primers específicos. Si conocemos un gen o secuencia específica de un determinado organismo podemos sintetizar unos primers específicos para el mismo. Bastará hacer después una PCR con estos primers y separar los fragmentos por electroforesis. Un ejemplo es utilizar primers específicos para el gen que codifica la enzima maloláctica en Oenococcus oeni. Tema 6 Electroforesis en gel de agarosa resultante de la PCR específica de Oenococcus oeni para: - (1) cepa tipo O. oeni CECT4100T. - (2-3), dos ejemplos de cepas aisladas de un vino. - (4) Leuconostoc mesenteroides CECT219T. - M es el marcador de pesos moleculares VI de Roche. PCR con primers específicos: “secuencias repetitivas en Saccharomyces sp”. Se utiliza de forma eficaz en laboratorios de empresa o de referencia. En Saccharomyces ssp. existen numerosas secuencias de bases repetidas: - Las secuencias delta (δ) tienen 0,3 Kpb estando asociadas al elemento Ty, calculándose en esta especie cerca de 100 copias. - Con los primers adecuados se amplifican estas secuencias, diferenciándose entre cepas. Los retrotransposones son secuencias largas repetitivas de reconocimiento. En los sitios en los que hay varios fragmentos, se unen y se observan a electroforesis, Los telómeros de los cromosomas presentan dos tipos de segmentos separados por secuencias cortas y repetidas de Citosina y Adenina: - Segmentos X (0,3 a 3,75 Kpb). - Segmentos Y1 (6,7 Kpb) (0 a 4 copias). Al igual que en el caso anterior estas secuencias pueden ampliarse para diferenciar distintas cepas. Comprobación de los híbridos por polimorfismos moleculares: PERFIL INTERDELTA Los genomas de los híbridos muestran un perfil intermedio de los dos parentales utilizados. Éstos resultados confirman que las levaduras “H” son auténticos híbridos de 8260, CEP2 y EX88P1A. RAPD-PCR (Random amplified polymorphic DNA- PCR). Inconveniente de PCR usual: Hay que conocer de antemano la secuencia de la zona que se quiere amplificar, lo que requiere un considerable trabajo previo. Solución parcial: Utilizar un único primer corto (10-15 nucleótidos) de secuencia arbitraria que híbrida aleatoriamente con numerosas zonas del ADN. Las temperaturas de hibridación suelen ser más bajas que con la técnica anterior para facilitar el proceso. Ésta técnica permite establecer el grado de similitud entre organismos, llegando a diferenciar entre géneros, especies y cepas vínicas. - Tiene poca reproducibilidad, además los resultados dependen mucho del primer. Tema 6 UP-PCR (Universal Primer- PCR). Es una variante de la RAPD en la que se utilizan primers universales un poco más largos y la temperatura de hibridación es algo mayor. Se dan las mismas condiciones en todos los laboratorios. Multiplex RAPD-PCR. Modificación de la RAPD en la que se utilizan dos primers al mismo tiempo. - Un primer específico. - Otro aleatorio. Crean unas bandas fijas en todos los microorganismos y las otras difieren, ayuda a la diferenciación de cepas. Mejora la reproducibilidad del método y se obtienen menos bandas, facilitando el análisis. Se ha aplicado con éxito para diferenciar bacterias lácticas (concretamente Oenococcus oeni). La imagen muestra los perfiles RAPD-PCR obtenidos con el cebador Coc (calles 1- 4) y con Multiplex Coc+On2 (calles 5-8) para la cepa Oenococcus oeni 4100T. La extracción de ADN fue la misma para las parejas de las calles 1-3, 2-4, 5-7, 6-8. M es el marcador de pesos moleculares II + VI de Roche. ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)* Se utiliza de forma eficaz en laboratorios de empresa o de referencia. Los genes que codifican el ARN ribosomal se encuentran muy repetidos (100-200 veces) en el ADN nuclear: - El “cluster” 18S - 5.8S - 28S presenta 2 segmentos no codificantes (ITS) que separan tres regiones codificantes, sigue otro espaciador (ETS). - El gen 5S forma parte de la unidad repetida, pero se transcribe en dirección opuesta. Al 5S le sigue otro espaciador IGS que separa la unidad de repetición. Amplificar secuencias de DNA espaciadores que codifican para los RNA ribosómicos. Se pueden amplificar sin afectar al organismo. Las regiones ITS, ETS e IGS son altamente variables entre especies de levaduras, en tanto que los genes ribosomales están muy conservados. Si estas zonas son amplificadas y tratadas con enzimas de restricción se obtendrán perfiles característicos de cada especie (ribotipos). Las regiones que se amplifican suelen ser las comprendidas entre el final de 18S y el inicio de 28S o entre el final de 28S y el inicio de 18S. Se utiliza para diferenciación de cepas e incluso de especies. ¡Son los datos de la PCR! ARDRA-PCR de NTS región de cepas de levaduras. Calles a–f, restricción con HaeIII; calles g – l, restricción con MspI; calles a, b, g y h, C. stellata; calles c, d, i y j, M. pulcherrima; calles e, f, k y l, K. apiculata. Calle M: marcador de pesomolecular,100-bpladder. PCR-HMA (Heteroduplex Mobility Assay). Tema 6 Método simple que requiere únicamente un paso después de la amplificación, la cual consiste en ampliar zonas conservadas (RNAr). Tras la amplificación se separan las cadenas de ADN por calentamiento y se mezclan con otras de cepas identificadas. -Seguidamente se permite la hibridación y se separan por electroforesis. En la electroforesis aparecerán 2 o 3 tipos de banda: - Cadenas no hibridación sencillas que quedan arriba. - Homoduplex: dos cadenas iguales que quedan en el fondo. - Heteroduplex sólo aparecería si los DNA mezclados eran distintos. La formación de heteroduplex se produce cuando los ADN difieren en más de un 2 % de la secuencia. ¡Diferencia entre especies! Ejemplo: Las calles 1,2,4,6 muestran heteroduplex, por lo que los ADN hibridados serían de distintas especies. - Las calles 3 y 5 indicarían que los ADN de las cepas hibridadas son de la misma especie. PCR usando primers de “Intron Splice Site” Los intrones son secuencias intergénicas del ADN de eucariotas que si bien son transcritas no son traducidas, ya que se eliminan durante el procesamiento del ARN mensajero. Zonas muy conservadas, presentan en los extremos secuencias imprescindibles para eliminar el intrón del ARNm. Realizando PCR con primers que hibridan con los extremos de los intrones se pueden obtener fragmentos de ADN útiles para diferenciar entre levaduras. Se ha utilizado para diferenciar cepas de S. cerevisiae. Se diferencian estirpes ya que los intrones varían. PCR fingerprinting con microsatélites (SSR). Los microsatélites o SSR son Secuencias Simples Repetidas en tándem, siendo muy abundantes en los organismos superiores, deben estar lo suficientemente juntas, largas y de manera inversa una a la otra para que un único nucleótido sea capaz de amplificarlas. Esta PCR utiliza como primers oligonucleótidos como: (GTG)5 o (GAC)5. Es una técnica sencilla, rápida y reproducible, con mayor discriminación que por ejemplo la RAPD-PCR. La interpretación es sencilla e inequívoca, ya que suelen aparecer pocas bandas en la electroforesis. Permite diferenciar entre cepas de una misma especie e incluso entre distintas especies, diferencias menos estirpes que otras técnicas, pueden usar combinaciones de técnicas. Puede ser útil para el seguimiento y marcaje genético de cepas de S. cerevisiae comerciales. PCR secuenciación. Amplificación de diversas regiones de los genes del RNA ribosómico u otras zonas conservadas, dichas regiones son las zonas que separan las secuencias que codifican a los RNAr. Secuenciación de los amplificados y comparación con bases de datos o entre cepas a diferenciar para ver el grado de homología entre estos ADN. Identifica a nivel de cepa. Utilizado para estudios de relaciones filogenéticas entre microorganismos. Tema 6 El principal problema se da en las secuencias iguales en estirpes diferentes. Para microorganismos cuya secuencia ya se conoce completamente suele utilizar ésta técnica. Para los virus también se suele utilizar ésta técnica pero, otra vez, con microorganismos cuyo genoma se conozca por completo. Nested-PCR (PCR anidado). Se utiliza de forma eficaz en laboratorios de empresa o de referencia. Utilizada para detectar un determinado microorganismo en una muestra (ej: Brettanomyces/ Dekkera). Básicamente detecta microbios ya identificados y secuenciados. Se basa en realizar dos amplificaciones a partir de la muestra a estudiar (sin necesidad previa de aislar microorganismos del mosto-vino). En la primera PCR se amplifican fragmentos grandes de ADN comunes a todas las levaduras o bacterias. Se amplifican oligos poco específicos y luego 2 oligos del fragmento amplificado. Se obtienen bandas específicas del organismo. En la segunda PCR se utilizan primers específicos para el microorganismo a detectar en la muestra, amplificándose las zonas internas del anterior DNA. Es muy sensible y rápido, el resultado se obtiene en unas 24 hrs. PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Se basa en amplificar por PCR una zona específica conservada y someter los fragmentos a electroforesis en gradiente, de manera que al irse desnaturalizando se separan en la electroforesis de forma distinta dependiendo de la especie. Es rápido (