Industrial Microorganism Lecture Notes PDF

‫‪02‬‬ ‫‪Biotechnology‬‬ ‫‪Industrial microorganism‬‬ ‫هذا العمل ال يغين عن حضور المحارضة‬...

‫‪02‬‬ ‫‪Biotechnology‬‬ ‫‪Industrial microorganism‬‬ ‫هذا العمل ال يغين عن حضور المحارضة‬ ‫‪48‬‬ ‫ف اول المحاضرة الدكتور بيكلمنا ع الصورة دي‬ ‫✓‬ ‫فبيقولك بقى انها بتوضح ال ‪ biological systems‬أو ال ‪ organism‬ف ازاي بقى احصل عليه أو ازاي اعمل ‪ improve‬للخصائص بتاعته‬ ‫✓‬ ‫و ازاي اعمل ‪ fermentation‬أو ‪ production‬ليه‬ ‫ف سمي هللا كده و ركز ف الكلمتين دول بيقولك ان انت اول حاجة بتحتاج ‪ tank‬و ده بنسميه ‪ fermenter‬او ‪fermentor bi-reactor‬‬ ‫✓‬ ‫علشان تحط فيه ال ‪ media‬اللي بنجيبها من ‪ raw material‬معينة و بعدها بدخل ف خطوة تانية و هي ال ‪fermentation control‬‬ ‫‪ process‬بخلصها و بدخل ع الخطوة االخيرة و هي ال ‪ Downstream process‬اللي بيتم فيها حدوث ال ‪ Extraction‬و ال ‪purification‬‬ ‫معنى الكالم ده اني محتاج ‪ 3‬حاجات علشان ال ‪ system‬يبقى كامل اول حاجة ال ‪ biological catalyst‬و ال ‪fermentation process‬‬ ‫✓‬ ‫بكل اللي بيتم فيها (‪ (tank /media /operation/control process‬و بعدين عندنا اخر خطوة و هي ال ‪ Downstream process l‬و‬ ‫كل ده ح ندرسه بالتفصيل قدام بس دلوقتي ح بدأ ف اول حاجة و هي ال ‪ Biological catalyst‬اللي ممكن ‪ Bacteria‬أو ‪ fungi‬أو‬ ‫‪ tissue cultures‬و دلوقتي ح نبدأ ف ال ‪ Chapter‬التاني و ادخل معايا ي باشا برجلك اليمين‬ ‫‪Isolation, preservation and improvement of industrial microorganisms‬‬ ‫‪Industrial Microbes Originally isolated from nature, but increasingly "improved" by genetic manipulation‬‬ ‫‪via‬‬ ‫‪protoplast fusion‬‬ ‫‪mutagenesis and‬‬ ‫‪(fungi, and‬‬ ‫‪recombinant DNA‬‬ ‫‪nuclear fusion or‬‬ ‫‪selection or‬‬ ‫‪streptomycetes and‬‬ ‫‪technology‬‬ ‫‪actinomycetes) or‬‬ ‫ايه الفرق بقى ؟‬ ‫‪.1‬الطفرة بيبقى الجين اللي بيطلع المنتج موجود بس بيطلعه بكمية قليلة فبخليه يطلع المنتج بكمية أكبر بال ‪mutation‬‬ ‫‪.2‬ال ‪ nuclear fusion‬دة برضو الجين موجود بس بعمل تعديل لل ‪ quality‬بتاعته عشان يدينا ‪hyper producing strain‬‬ ‫‪.3‬ال ‪ protoplast perfusion‬بعمل ‪ perfusion for two different organisms‬يطلع اورجانزم جديد بمنتج جديد وبتركيز عالي‬ ‫التالتة دول الجين كدة كدة موجود فيهم وانا بعدل عليه إنما بقى ال ‪ recombinant DNA‬انا اللي بدخل جين مش موجود اصال‬ ‫‪1‬‬  Biotechnology Title of lecture 01 The nutritional characteristics of the organism; cheap media or ‫احلي حاجة انه يقدر ينمو على‬ 1- is it able to grow in very cheap medium or pre- Cheap media ‫ يعني كل اما اشتغلت ف‬predetermined one determined one ‫كل ماكانت التكلفة قليلة وكل ماكان فيه بيع كتير‬ The optimum temperature of the organism, an optimum, above 40°. ‫ بيحصل‬Organism under fermentation process ‫ كل ماكان احسن ليه الن‬40 ‫ اعلى من‬optimum ‫كل ماكان‬ ✓ tank ‫ فبيرفع درجة حرارة الميديا ودرجة حرارة‬exothermic reaction ‫ والتفاعل دا بيبقي‬biochemical reaction 2- 45 ‫ يقدر ينمو عند‬organism ‫ فاذا كان‬organism & product ‫ ل‬destruction ‫ ممكن يؤدي الي‬tank ‫لما الحرارة تترفع فى‬ ✓ low cost ‫ ب‬45-60 ‫ من‬cooling ‫ اقدر اعمل‬60 ‫والحرارة اترفعت ل‬ final product ‫ عالي ويطلع‬cost ‫ فكدا هيبقي‬20-60 ‫ من‬cooling ‫ وانا جيت اعمل‬20 ‫ يقدر ينمو عند‬organism ‫انما لو‬ ✓ ‫تكلفته عالية‬ ‫ بس عند درجة حرارة معينة‬best condition for production ‫ هي‬optimum ‫طب يعني ايه‬ ✓ be available in pure culture be genetically stable, but amenable to ‫قابل‬ contamination ‫ مفيهوش اي‬pure ‫ يكون‬organism ‫يعني‬ ‫ للتعديل الجيني‬genetic manipulation 3- mixed ‫ اخري علشان ميبقاش عندي‬organism ‫ من‬4- ‫ ولكن اقدر انا‬rabid mutation by it self ‫ميحصلش فيه‬ mixed with ‫ اللي طالعة متبقاش‬product ‫ وبالتالي‬culture induction by ‫ يعني اعمله‬genetic manipulation ‫اعمله‬ other products ‫ لكن مش هو اللي يعمل من نفسه‬mutation have high productivity of desired metabolites, or products 5- ‫ واقدر كمان اعملها‬vegetative ‫ غير لما تكون‬storage ‫ فاقدر اعملها‬bacterial spore in small size ‫يعني انا لما يبقي عندي‬ ‫ هيلف على‬filamentous organism ‫ لما يكون عندي‬separation from media ‫ كويس وكمان سهلة فى عملية‬handling ‫ هتبقي اسهل‬precipitation ‫ فعملية‬rods ‫ او‬spherical ‫الشفط ويعمل مشكلة انما لما يكون‬ Characters of industrial organisms ‫احنا اخدنا الخصائص ديه المحاضرة اللي فاتت ف محتاجين بس ننراجعها كويس سوا هنا تاني‬  Source of Microbes Microbes are obtained from two sources 1- Culture collection ‫خلي بالك االختصارات مهمة‬ Culture collection Address Such as American type culture collection (ATCC). These organisms are called standard National collection of Type Cultures London, UK organisms are mainly used for assays (NCTC) (microbiological, vitamins), training on running American Type Culture Collection Rockville, USA the fermentation process, and educational (ATCC) purposes never used for production of required Deutsche Sammlung von Braunschweig, materials. Because they give very low yield of Mikroorganismen und Zelkulturen Germany the required product. (DSM) Collection of Microorganisms (JCM) Saitama, Japan American ‫ الموجودة فى كافة دول العالم زي‬culture collection ‫ او بجيبه من‬nature ‫عندي حاجة من االتنين اما افصله من‬ ✓ ‫ مثال وطبعا دا مكلف وغالي جدا و ده بستخدمه‬penicillin ‫ اللي انا عايزه زي‬pure strain ‫ اقدر اشتري من عندهم مثال ال‬culture laboratory ‫ أو‬vitamines ‫ أو ال‬antibiotics ‫ لل‬assay ‫ بعملها لل‬Reference antibiotics resistance ‫علشان اقدر استخدمه ك‬ ‫ بس مش بستخدمه عادة ف الصناعات اال قليل اوي‬diagnosis ‫ اللي تحت بس الشرح على بعضه احسن‬isolation ‫ الشرح اللي جاي تبع‬ number of desired organism ‫ ودا بيزود‬enriched culture media ‫ بشكل اساسي النها بتكون‬soil ‫ من ال‬nature ‫ افصله من‬١ ‫✓ او‬ ‫ بتاعتي لما احط عليه االورجانيزم و‬enriched media ‫ بحط فيها ال‬flask ‫✓ طب ده بيتعمل ازاي ؟؟! بيقولك ي سيدي ده بيتعمل ف‬ ‫ طب ليه ؟؟! بيقولك ي عم انك بتحضر الميديا و تزرع فيها ز مش بتغير فيها حاجة والظروف اللي‬batch culture ‫ازرعها بيكون ده‬ ‫ و دايما بعمل تعويض‬tank ‫ بينما لو انا بحط االورجانيزم ف‬batch culture ‫بيتم فيه الزراعة بتكون ثابتة ف علشان كده بيكون اسمها‬ ‫نخلي بالن كويس من الفرق بينهم‬....... continues culture ‫للمواد الغذائية اللي بتستهلك او اشيل اي فضالت فيها ف ده اسمه‬ 2  Biotechnology Title of lecture 01 2- Isolation from nature o usually from soil since the soil is very rich in microbial contents by using enrichment liquid culture. o Isolation methods are based on selection of the desired characteristic. o Enrichment culture will increase the number of a given organism relative to numbers of other types in the original inoculum. o i.e., use selective force for isolation of desired organism by A. addition of certain substance in B. Enrichment liquid culture is carried out in shake flasks (for the batch enrichment liquid aeration) to increase growth rate of desired organism.. culture to enhance the growth of C. The selective force may also be re- established (repeated sub desired organism or to inhibit or culturing) by inoculating the culture into identical fresh medium retard growth of undesired at time interval relating to max growth rate of desired organism. organism.  The prevalence of an organism in a batch enrichment culture will ‫ بتكون‬batch culture ‫بيقولك بقى أن ال‬ depend on its maximum specific growth rate compared with the ‫ بحط‬constant volume of media ‫عبارة عن‬ maximum specific growth rates of the other organisms capable of for ‫فيها ال اورجاميزم و بسيبه فيها‬ growth in the inoculum. Thus acerten time  Thus, provided that the enrichment broth is sub-cultured at the ‫ف علشان كده مع الوقت النواتح اللي انا‬ correct times, the dominant organism will be the fastest growing ‫عايزها بتزيد بينما البي مش عايزاها بتقل‬ of those capable of growth.  Prior to the culture stage it is  Such sub-culturing will be repeated several times(to allow greater often advantageous to subject the increase of desired organism in liquid culture) before the environmental source (normally dominant organism is isolated by spreading a small inoculum of soil) to conditions which favour the enriched culture onto solid medium the survival of the organisms in question.  For example, air-drying the soil will favor to inhibit the vegetative cells but not spore forming cells as in case of actinomycetes. under reduced temp or in ‫ ودا بيكون‬preservation or storage ‫ فالزم احفظه يعني اعمله‬organism ‫طبعا احنا فصلنا‬ ✓ dehydrated form ‫نركز مع الدكتور كويس ف النقطة ديه علشان مهمة جدا و محتاجة تركيز‬ ✓ The preservation of industrially important microorganisms The culture used to initiate an industrial fermentation must be viable and free from contamination. Thus, industrial cultures must be stored in such way as to eliminate genetic change. The preservation (Storing either) at 1-Reduced 2- dehydrated temperature or form Storage on agar Storage under Lyophilization Dried cultures slopes liquid nitrogen 3  Biotechnology Title of lecture 01 1- Storage at Reduced temperature a- Cultures grown on agar slops may be stored in a refrigerator (5º) or a freezer (-20°) and sub-cultured at approximately 6-monthly intervals. A) Storage ‫ وممكن‬dehydration ‫ فبيقلل عملية‬waxy material ‫ او‬oil ‫ ب‬cotton plug ‫ ل‬Deeping ‫لو جيت عملت‬ ‫يعيش مدة اطول‬ on agar  The time of subculture may be extended to one year if the slops are covered with sterile slopes medicinal grade mineral oil. b- or culture grown in broth may be stored in a freezer at 20 of after addition of 10-20% glycerol. tissue culture ‫ علشان اقدر احتفظ بيها بما فيها‬biological system ‫دا يعتبر الطريقة المثالية لكل‬ ✓ max stationary phase ‫ لحد اما اوصل‬bacteria ‫ ل‬growing ‫بعمل‬ ✓ cell in crew protective agent ‫ ل‬resuspending ‫ ثم اعمل‬max yield biomass ‫طب ليه ؟ علشان اخد‬ ✓ storage in liquid ‫ واعميه‬sealed ampoule ‫ فى‬suspension‫ ل‬freezing ‫ واعمل‬10% glycerol ‫مثال‬ -150 to -196 ‫ محفوظة عند درجة‬bacteria ‫ طول ماانت ضامن ان‬liquid nitrogen ‫ طول مافيه‬nitrogen best method for ‫ وجا شئ طبيعي فتعتبر‬freezing ‫ اثناء‬loss ‫ يحصلها‬bacteria ‫طب لو حصل ان بعض‬ ✓ ‫ وطبعا دا غالي‬long term ‫ هيموت‬collection ‫ البد من انك تجدد دا كله تاني الن لو دا محصلش ف‬evaporate ‫لو حصل‬ ✓ The metabolic activities of micro- organisms may be reduced considerably by storage at the very low temperatures (-150° to -196°) which may be achieved using a liquid nitrogen refrigerator. This approach is the most universally applicable of all preservation methods of all biological systems. B) Storage Fungi, bacteriophage, viruses, algae, yeasts, animal and plant cells and tissue cultures under have all been successfully preserved by this technique. The technique involves growing a culture to the maximum stationary phase, re- liquid suspending the cells in a cryoprotective agent (such as 10% nitrogen glycerol) and freezing the suspension in sealed ampoules before storage under liquid nitrogen. NB1; Some loss of viability is suffered during the freezing and thawing but there is ‫ مراحل التجميد والذوبان‬stages virtually no loss during the storage period. again It is the best method for long term (for years) preservation of cells that do not survive freeze- drying, such as animal and plant cells and tissue cultures. NB2; Although the equipment is expensive the process is economical on labor. However, the method has the major disadvantage that liquid nitrogen evaporates and must be replenished ‫ لتجدد بانتظام‬regularly If this is not done, or the apparatus fails, then the consequences are the loss of the collection 2- Storage in a dehydrated form ‫ بس‬spores ‫ده مناسب للبكتيريا اللي بتقدر تعمل‬ Dried soil cultures have been used widely for culture preservation. Used only for fungi, actinomycetes and other spore forming bacteria. Moist, sterile soil may be inoculated with culture and incubated for several days for A. Dried some growth to occur and then allowed to dry at room temperature and kept in a dry cultures atmosphere or, preferably, in a refrigeration. ‫ ودي تنفع فقط‬dried culture ‫ فطبعا كدا كفيش حياة فممكن استخدم‬organism ‫تنزع الماية من جسم‬ ✓ spore ‫ وبعض البكنيريا اللي بتعمل‬fungi ‫ لكل‬spore form‫ل‬ ‫ وبعدين‬growth‫ اللي موجود هيحصل‬culture media‫ ل‬miosting ‫ ونعمله‬sterile ‫ بيبقي‬soil ‫بنجيب‬ ✓ refrigerator ‫ او‬room temp ‫ فى علب ونحطها فى‬batching ‫ وبعد كدا هعملها‬spore form ‫تتحول‬ 4  Biotechnology Title of lecture 01 Lyophilization, or freeze-drying, involves the freezing of a culture by its drying under vacuum which results in the sublimation of the cell water. The technique involves growing the culture to the maximum stationary phase and resuspending the cells in a protective medium such as milk, serum or sodium glutamate. A few drops of the suspension are transferred to an ampoule, which is then frozen and subjected to a high vacuum until sublimation is complete, after which the ampoule is sealed. The ampoules may be stored in a refrigerator and the cells may remain viable for 10 years or more Lyophilization is very convenient for service culture collections because, once dried, the cultures do not need further attention (stable) and the storage equipment is only refrigerator which is cheap and reliable B. However, freeze-dried cultures are tedious to open and revitalize and several sub- Lyophilization cultures may be needed before the cells regain their typical characteristics. Lyophilization are NOT suitable for preservation of animal and plant cells and tissue cultures. Overall, the technique appears to be second only to liquid nitrogen storage and even when liquid nitrogen is used makes an excellent insurance against the possibility of the breakdown of the nitrogen freezer drying under vacuum which results in the sublimation of the cell ‫ دي بقا بعملها‬Lyophilization milk, serum or sodium ‫ ب‬protective media ‫ فى‬resuspending ‫ وبعملها‬growth ‫ وبيحصل‬water freeze dryer ‫ في‬drying under vacuum ‫ و اعملها‬frozen ‫ واعملها‬ampules ‫ وبعدين بنحطها فى‬glutamate ‫ فوق‬vipe ‫ فى االنبوبة وبعد كدا بتحط‬copper sulfate ‫ بس بنحط‬storage ‫ ونعمل‬ampule‫ ل‬sealing ‫وبعدين‬ ‫ هتسمع فرقعة معناها‬sealing ‫ مش مظبوطة وانت بتعمل‬sealing ‫ اتغير يبقي كدا عملية‬copper ‫االنبوبة فلو‬ ‫ سنين‬10 ‫انها باظت وعملت خرم فالزم تتغير والعملية دي بتقعد على االقل‬ Quality control of preserved stock cultures: ‫ علشان اجاوب علي‬quality control ‫بنعمل‬ ✓ o Each batch of newly preserved cultures should be ‫هل‬/ ‫ وال‬viable ‫ هل هي‬/ ‫ وال‬pure ‫هل هي‬ routinely checked to ensure their quality: ‫ وال‬productive ‫هي‬ o At least 3% of the ampoules are reconstituted and the ‫ من االمبول اللي عملت فيه‬At least 3% ‫بناخد‬ ✓ cultures assessed for purity, viability and productivity. ‫ واشوف هل‬subculture ‫ وبعدين‬preservation o If the samples fail any one of these tests the entire batch / ‫ وال‬grow ‫ هل هي‬/ ‫ وال‬contaminated ‫هي‬ should be destroyed. ‫ بتاعي‬product ‫هل هي طلعت‬ How could you increase the yield product Improvement the quality ‫ ودلوقتى هنشوف ازاى هنعمل‬preservation ‫ بعدها‬isolation to organism ‫يبقا كدة عرفنا ازاى بنعمل‬ mutation ‫ودى عن طريق كذا حاجة اولها‬ Mutation >> change in nucleotide sequence lead to change in characters phenotypically or microorganisms activities To increase the yield 1- Improvement the 2- Improve quality of industrial conditions of micro-organisms production physical nutritional Mutations Lysine condition condition 5  Biotechnology Title of lecture 01 1- Improvement the quality of industrial micro-organisms 1. Mutations :  The mutagenic agents could be UV radiation, ionization radiation, chemicals like nitrous acid, nitrosoguanidine,... etc.  The exposure to these agents leads to the death of most of the cells in a culture, however, some survivors may contain some of the mutants exhibiting changed characteristics , desired one. ‫ و ده إما‬mutation ‫ هي الي بتتغير وتحصل فيها‬cells ‫ مابتتغيرش وفيه‬cells ‫ بتموت وفيه‬cells ‫ فيه‬mutation ‫ بتتعرض ل‬cells ‫لما‬ ✓ ‫ أو يعدل على الماتور بتاعه فيزود االنتاج‬loss ‫ أو يعمل لها‬activity ‫يغير‬ more than one gene in the same chromosome in ‫ بتصرب‬... ‫ مش بتصرب جين معين الء‬at certain site ‫بتصرب الكروموسوم‬ ✓ certin site ‫ أو الء‬desired ‫ ممكن يبقى‬Certain site ✓ ‫ اللي‬organism ‫ في أماكن كتير فيه فانت بتختار‬mutations ‫ أو تعمل‬normal ‫ أو متعملش فيه حاجة فيفضل‬m.o ‫ ممكن تقتل‬UV ✓ specific site of the desired m.o ‫ في‬mutation ‫عمل‬ ‫ علشان ايه‬mutation ‫انت هتعمل‬   A small population of these cells (mutants) could ‫ بتبقي مهمه‬1ry ‫ اما‬metabolites ‫ بيطلع‬microorganism ✓ be the one which produces large number of bioactive ‫ للبروتين بتاعه‬building up ‫للعمليات الحيويه بتاعته ذي‬ ‫ معين‬age ‫ بيطلعها في‬secondary metabolites ‫او يطلع‬ ✓ components of interest. ‫او مرحله عمريه معينه ومش بتبقي مهمه بالنسباله‬  These components are either primary or secondary nuclear fusion and protoplat fusion..‫خلى بالك‬ ✓ metabolites. ‫ مهمة و امتحان‬sec metabolite ‫مهمين في‬ Primary metabolite Secondary metabolite essential for cell growth Or its production are are not essential for cell growth associated with activities or energy production its production are not associated with cell ‫ اما هى نفسها مهمة للنمو او مهمة لحاجة مهمة‬1ry ✓ growth or energy production ‫ هو ف حد ذاته مش‬alcohol production ‫للنمو يعنى مثال‬ ‫ مش مهمة للنمو وال الطاقة‬،‫ بيطلعها في وقت فراغه‬Mo ✓ 1. ‫ و اللى‬energy production ‫ بس هو الزم عشان‬essential ‫زي البنت وهي صغيرة وقتها كله ليها تلعب وكده لكن لما‬ metabolism or catabolism ‫الزمة لكل العمليات سواء‬ ‫تبقى جدة تقعد تطبخ ألحفادها و تعمل كروشية ليهم‬ ‫ وبالتالي‬oxotrophe ‫لو مش قادر يصنعه بنفسه نسميه‬ ✓ ‫بالصوف نفس الفكرة بس الزم أوالدها بجيبوالها الصوف و‬ ‫مش قادر ينمو و بالتالي يموت‬ ‫ تحت‬٣ ‫ النقطة رقم‬media components ‫ده بنعتبره‬ its production correlates cell growth and produced at concentrations correlate growth rate, as single compound. and in trophophase ‫ بتاعة‬metabolites ‫ يزيد كل مال‬cell growth ‫كل مال‬ ✓ single not in mixture ‫ بيطلع‬metabolite ‫الخليه هتزيد‬ its production doesn't correlate with rate of ‫بيقولك الكحول اللي البكتيريا بتطلعه لما بتعمل تفاعل‬ ✓ cell growth. 2. ‫ يعني عشان البكتيريا‬primary metabolite ‫كيميائي يعتبر‬ Its rate of ptoduction dosnot correlate with rate ‫تقدر تطلع المنتدى الفالنية الزم الكحول يطلع زي وانت‬ of cell growth ‫خارج تقابل واحد صاحبك اهلك يشترطوا عليك تاخد اخوك‬ ‫الصغير معاك كدة كدة اخوك مش مهم في الخروج لكن الزم‬ ‫ فخروج الكحول مقترن بخروج‬، ‫ييجي معاك عشان تخرج‬ ‫المنتج اللي انت عايزه‬ its production depends on media components ‫ يعنى‬media combonant ‫ بتاعه معتمد علي‬production ✓ its production are not associated to media precursors ‫ الزم تحطلها‬penicillin G ‫هى عايزة تطلع‬ components ‫بتاعه فالميديا‬ 3. simple, ‫مش مرتبطة بالميديا يعنى سواء الميديا‬ ✓ ‫ على حسب‬tetracycline ‫مثال انتاج المضادات الحيوية زي‬ ✓ ‫ هيطلعها عادى‬organism ‫ ال‬complex , synthetic.. ‫ أو‬clonotetracycline ‫ أو‬Doxycycline ‫الميديا ممكن يطلع‬ ‫ و منهم التوكسيك أو الء‬tetracycline 6  Biotechnology Title of lecture 01 examples are amino acids, fatty acids, some 4. examples are antibiotics and some vitamins vitamins and alcohol. usually produced and secreted outside the cell usually produced and kept inside the cell outside the cell ‫ بتكون‬metabolites ‫✓ الميزة هنا بقا ان‬ ‫ علشان تحتفظ بيها جوا الخليه‬metabolites ‫البكتريا تطلع‬ ✓ ‫وممكن تبقا بكميات كبيرة ولكن ناخد بالنا انها لما بتطلع‬ ✓ ‫ ودى مشكلة طبعا‬very small concentration ‫في‬ 5. ‫ بتطلعها بكمية كبيرة برا الخلية واللى بيبقا جوا‬antibiotics limited ‫الخلية بتبقى عايزة كمية معينة فتطلعها ب‬ ✓ ‫الخلية بيبقا بكمية قليلة اقل م الكمية الالزمة لقتل‬ ‫بغض النظر كونتها في وقت قد إيه تبطل تنتجها لحد‬conc ‫ بالنسبالها في الظروف‬outo toxic ‫البكتيريا دى ف بتبقي‬ ‫متخلص اللي عندها يعني مبتخزنش‬ ‫العاديه‬ Metabolite formed after growth has occurred, during idiophase and usually produced at high concentrations in idiophase and as single or 6. mixture of closely related organic compounds. ‫ وبداية‬logarithmic phase ‫ بتطلع مع نهاية‬Metabolite ✓ ‫ و بيبقي‬idiophase ‫ وبيكون اسمها‬stationary phase max rate of production ‫فيها‬ single or in mixture ‫ بيطلع‬metabolite ‫هنا بقا‬ ✓ Selection of mutant producing improved (higher) level of primary metabolites. The most important commercially available primary metabolites are the amino acids. glutamic lysine Two of the most common and commercially available amino acid acids are Glutamic acid is also called glutamate, mostly metabolized in brain and is an essential neurotransmitter. I.e., is an excitatory neurotransmitter The brain can use glutamic acid as fuel that increases the firing of neurons in the central nervous system. ‫ نقصه بيعمل أمراض كتير ذي الزهايمر وكدا‬brain ‫ بتاع‬fuel ‫ هو‬glutamic acid This is essential for normal, healthy brain function It is converted into either glutamine or Gamma-Aminobutyric Acid (GABA), which are the two other amino acids that help pass messages to the brain If you don't produce the proper quantities of glutamic acid some serious brain disorders can arise. Glutamic acid may prove beneficial in the treatment of muscular dystrophy,Parkinson’s disease and schizophrenia. Glutamic acid helps to correct personality disorders and is useful in treating childhood behavioral disorders. A- Glutamic It is used in the treatment of epilepsy, mental retardation, muscular dystrophy, ulcers, acid and hypoglycemic coma; a complication of insulin treatment for diabetes Production of Glutamic acid: The organism for the production is Corynebacterium glutamicum. Two basic aspects must be known in addition to the fact that primary metabolites produced in concentration correlating only the cell need. These two basic aspects are: a- Increasing synthesis of the glutamic acid concentration in the cells above their requirement resulting in induction negative feedback mechanism and thus stop the conversion of a-ketogutamic acid (the intermediate of production of glutamic acid. 7  Biotechnology Title of lecture 01 b- Cells naturally requires the vitamin biotin (25- 35µg/mg/dry) for synthesis of fatty acid of cell membrane-phospholipids providing the high (norm cell membrane integrity. Weakness of the cell membrane integrity increases the permeability. ‫ وهنالقي ان فيه مشكلتين وهنشوف اتغلبوا عليهم‬production of glutamic acid ‫ نيجي بقا لل‬ ‫ازاى‬ ‫ اللى‬alfa ketoglutaric acid ‫ لحد ما توصل لل‬glucose ‫ كدة بتبدا بال‬cycle ‫✓ االول تعالى بص ع‬ succinic acid ‫ وجزء تانى بيتحول ل‬glutamic acid ‫ ويتحول ل‬deamination ‫جزء منه بيحصله‬ ‫ لالنزيم اللى‬block ‫ فالبكتيريا تعمل‬mutation ‫ فعملوا‬glutamic acid ‫طيب انا عاوز كله يتحول ل‬ ‫ طب تمام كدة حلينا اول مشكلة‬succinic ‫ ل‬alfa ketoglutaric ‫مسؤل عن تحويل‬ Corynebacterium glutamicum ‫ اسمها‬glutamic acid ‫ نيجي لتانى مشكلة البكتيريا اللى بتصنع‬ ‫ودى بتصنعه بكميات قليلة جدا وحسب احتياج الخلية وكمان بيبقا جوا الخلية واول ما بتصنع الكمية‬ ‫ بكميات‬glutamic ‫ طيب انا عاوز‬glutamic ‫ يوقف تصنيع‬ve-feed back ‫اللى الخلية محتجاها بتعمل‬ ‫كبيرة‬ permeability of cell membrane to glutamic ‫ بردو بس المرادى تزود‬mutation ‫✓ الحل بقا عملوا‬ ‫ فكل اللى يتصنع يطلع ع برا الخلية والجزء اللى يتبقا جوا الخلية بيكون اقل من احتياج الخلية‬acid biotin auxotroph loss ‫فتخليها تصنع ع طول طب وده ازاى بقا عن طريق‬ fatty acid ‫ الخلية محتاجاه عشان تصنع‬vitamin ‫ ده عبارة عن‬biotin ‫طيب يعنى ايه بص ياسيدي‬ ✓ ‫ بتاع الخلية وبالتالى هيحصل‬cell membrane ‫ اللى فال‬phospholipids ‫اللى بتدخل ف تكوين‬ ‫ فيحصل بقا كل اللى‬interference in permeability of cell ‫ ويحصل‬deficient in phospholipids ‫قولناه فوق ده‬ low ‫ فممكن تموت فالزم امدها ب‬biotin ‫بس خلي بالك هنا البكتيريا بتفقد قدرتها على تصنيع‬ ✓ concentration of biotin ‫وبالتالي هو أصال بينتج جوه الخلية بس و كمان بتركيز‬primary metabolite ‫جلوتاميك أصال بنعتبره‬ ✓ inrespect to the max growth rate ‫قليل و تبعا الحتياجات الخلية و‬ ‫طب الخطوة دى ممكن اعملها بطريقة تانية ؟‬ ✓ weakness in ‫ ويعمل‬cell wall ‫ فيشتغل على‬low concentration of penicillin ‫ايوة ممكن احط‬ ✓ permeability ‫ و يزود‬cell wall Corynebacterium glutamicum produces glutamic acid during tri-carboxylic acid cycle (Krebs cycle). For commercially production of glutamic acid two essential characters must be present in C. glutamicum. Lack enzyme which converts :  a-Ketogutaric acid to succinic acid, so direct the cycle for production of glutamic acid with higher rate,,,,,,,.  Biotin auxotroph has cell membrane deficient in phospholipids thus corrupts their selective permeability, resulting in continuous release glutamic acid outside and productivity…….i.e., Inhibits negative feedback mechanism  The explanation of excretion of glutamic in the biotin limiting condition is based upon the fact that it results into the cell membrane being deficient in phospholipids thus corrupts their selective permeability.  This will the release out of the amino acid and thus no -ve feedback ,consequently there is continuous production of amino acid, i.e., increase the productivity 8  Biotechnology Title of lecture 01 B- Lysine Promotes skin health through increased it plays a role in the production of carnitine (loss of lipid by oxidation, and transport the amino acids into collagen formation May be used to treat viral infections like mitochondria where it used for energy production) Promotes normal growth and development by herpes simplex, cold sores, shingles, human increasing collagen formation papilloma virus (HPV) infection such as Supports the production of other proteins; like genital warts, and genital herpes Can relieve migraines and other types of pain enzymes, antibodies and hormones Promotes bone health by increasing calcium and inflammation When taken with other nutrients like vitamin absorption: prevents osteoporosis or weak bones by reducing bone loss C, it can reduce chest pains (angina) related to Helps convert fatty acids to energy, aiding in weight heart disease Helps in muscle building, when taken with reduction Helps lower bad cholesterol levels, thus reducing other amino acids like arginine the risk for heart disease ‫ مع ال‬muscle atrophy ‫فبيستخدم للناس اللي عندها‬ glutamate The organism used for production is Corynebacterium glutamicum Homoserine auxotroph...... To direct the conversion of aspartyl semialdehyde to A. pathway of synthesis of lysine instead of pathway of synthesis of homoserine. Increase of cell permeability, i.e., B. corruption of cell selective permeability to 1- sufactants; 2- bata- overcome -ve feedback mechanism. fatty acid lactams This is achieved by derivatives. ‫ كدة هنالقى انها بتبدا ب‬cycle ‫نبص ع‬ ✓ Asparyl ‫ لحد ما نوصل لل‬Aspartate ‫ واللى جزء منه بيطلع‬semialdehyde ‫ والجزء التانى بيطلع‬lysine ‫ل‬ large ‫ وده بيطلع‬Homoserine number of amino acid ‫ بس‬secondary pathway ‫فيه بقا‬ ✓ very minute amount of ‫بتطلع‬ lysine and other amino acids production lysine ‫طيب انا لو عاوزة ازود انتاج‬ ✓ ‫هعمل ايه ؟‬ of Lysine: homoserine ‫ايوة بالظبط هعمل‬ ✓ ‫ يعنى هوقف تصنيع‬auxotroph Aspartyl ‫ واخلى‬homoserine lysine ‫ كله يتحول ل‬semialdehyde ‫ اللى البكتيريا محتاجاها و من غيره‬amino acid ‫ هو اللى بيطلع كل‬homoserine ‫بس خد بالك انا قولت‬ ‫ فالميديا‬homoserine ‫تموت فالزم احطلها انا‬ ‫ الن انا كدة كأني قسمت‬production of lysine ‫ اللى هحطها مش هتأثر على‬homoserine ‫هنا كمية‬ ✓ ‫ وانا‬lysine ‫ كله هيدي‬Aspartyl semialdehyde ‫اللى ف الرسمة دى التنين منفصلين يعنى كدة‬cycle ‫اللي‬hemoserine‫وهنا كمية ال‬amino acids ‫ التانية هتبدا م اوله وتطلع‬cycle ‫ ال‬homoserine ‫حاطة‬ ‫بحطها بتكون كبيرة عادي على عكس اللي كان بيحصل في البايوتين‬ ‫طيب كدة حليت اول مشكلة نيجي لتانى مشكلة‬ ✓ ‫ فهحل‬lysine ‫ وتوقف تصنيع‬negative feedback ‫ وطبعا هتعمل‬lysine ‫الخلية هتطلع كمية كبيرة م‬ ✓ ‫المشكلة دى ازاى ؟‬ ‫حاجات‬3 ‫ وده عن طريق‬cell permeability ‫ هزود‬glutamic acid ‫بالظبط زى‬ ✓ ‫ وافتكر كدة وخلى بالك‬glutamic ‫ ودى شرحناها المرة اللى فاتت ارجع لل‬biotin auxotroph ‫اول حاجة‬ ✓ homoserine ‫ هنا مهمة وبحطها بكمية قليلة مش زى‬biotin ‫كمية‬ ‫ تدخل ف تصنيع‬fatty acid derivatives ‫ وده بعنى هحط‬surfactant ‫تانى حاجة عن طريق انى استخدم‬ ✓ weakness in cell wall ‫ وتعمل‬lipid bilayer retard in synthesis of cell wall ‫ عشان يعمل‬low concentration of penicillin ‫تالت حاجة احط‬ ✓ 9  Biotechnology Title of lecture 01 NB: Increasing cell permeability c- low concentration and decreasing the primary metabolites a- biotin b-surfactants; fatty (sub-MIC) of accumulation inside the cell, thus auxotroph acid derivatives. penicillins inhibit negative feedback mechanism is achieved by using of primary amino acid / ‫ هو‬cell ‫ أهميته ل‬Homoserine ✓ primary metabolite /essential to live ‫شوية مالحظات مهمة‬ ‫ اللي دخلته مش هيأثر‬homoserine auxotroph ‫كمية‬ ✓ ‫ هو نفسه المستخدم‬lysine ‫ المستخدم ف تصنيع‬organism ✓ Aspartyl ‫ ملهاش عالقة ألن‬production of Lysine‫علي‬ Corynebacterium glutamicum ‫ وهو‬glutamic ‫؛ فال‬ lysine ‫اتحول كله ل‬semialdehyde lysine ‫ بس انما‬biotin auxotroph ‫ بستخدم‬glutamic ‫فال‬ ✓ in very short time ‫ في‬lysine ‫ يتحول الي‬Aspartyl ‫لما‬ ✓ biotin & homoserine auxotroph ‫ممكن استخدم االتنين‬ ‫ و مش هيكون‬negative Feedback mechanism‫يعمل‬ ‫ انما كمية‬essential ‫ بتكون‬biotin ‫ كمية‬lysine ‫فال‬ ✓ lysine ‫ بكمية كبيرة إال إذا خرجنا‬lysine ‫اللي هو‬product not essential ‫ بتكون‬homoserine outside the cell homoserine or biotin ‫تعالوا بقا نشوف ازاى بحضر‬ ✓ Isolation of an auxotroph (e.g. auxotroph homoserine auxotroph) mutation ‫ عشان اعمل‬UV ‫االول هنجيب البكتيريا ونعرضها ل‬ ✓ unselective ‫المهم ف بكتيريا هتموت وبكتريا هيحصل فيها‬ This is done by using penicillin enrichment homoserine ‫ دى هيكون‬mutation ‫ومن ضمن‬mutations technique. ‫ بعد كدة هاخد كل البكتيريا اللى حصل‬or biotin auxotroph Penicillin selectively kills growing bacterial cells penicillin ‫ فيها‬culture media ‫ دى واحطها ف‬mutation ‫فيها‬ and therefore if the survivors of mutation homoserine or ‫قوم ايه تموت كل البكتيريا ماعدا اللى فيهم‬ treatment were cultured in a medium containing biotin auxotroph penicillin and lacking the growth requirement of killing ‫ بيعمل‬penicillin ‫بص يا سيدى‬..... ‫وتعالى نفهم ازاى‬ ✓ the desired mutant only those cells unable to grow ‫ اثناء‬cell wall ‫ فقط ألنه بيمنع تكوين‬to live dividing cell would survive, these are, the desired auxotrophs. ‫تمام كدة طيب دلوقتى البكتيريا اللى فيها‬growth & dividing If the cells were removed from the penicillin ‫ هى بس اللى ما عندهاش‬homoserine or biotin auxotroph broth, washed and resuspended in a medium ‫ النه قولنا الزم اوفرلها‬growth & dividing ‫القدرة على‬ containing requirements of the desired auxotroph ‫ فالميديا عشان تقدر تنمو وتنقسم ف‬homoserine or biotin then the resulting culture should be rich in the ‫ مش هيشتغل عليها ومش هتموت‬penicillin ‫عشان كدة‬ required type. sub ‫طيب نكمل ناخد بقا البكتيريا اللى ما ماتتش دى ونعمل‬ ✓ NB; Nakayama's group succeeded in isolating a ‫ فكدة الخاليا‬homoserine or biotin ‫ ونحط فالميديا‬culture homoserine auxotroph of c. glutamicum which ‫هيبقا لها القدرة ع النمو واالنقسام فيبقا ايه بقا الزم الميديا‬ synthesized 44 g dm-3 lysine......44gm/1000 cm-3 ‫ النه لو موجود هيقتل‬penicillin ‫االخيرة دى ما يكونش فيها‬ = 44gm/L........ 44MG/ML ‫البكتيريا‬ Selection of secondary metabolite producing strains Screening for isolation and Improve its quality, e.g: Strain from nature and penicillium notatum produces 1µg/ml and replaced by Penicillium chrysogenum (10 µg/ml) and improve its quality after mutation (U.V.) and Increased to yield to 50 mg/ml. Streptomyces kanamyceticus strains are either autotoxic resistant (i.e., resist to autotoxic product) by mutation or genetically engineered strain provides high yield of kanamycin. Autotoxic resistant: a strain which resists high concentration of antibiotic in trophophase and thus able to grow in presence of accumulated relatively higher concentration inside the cell during increased /greate roductivity in idiophase. In case of kanamycin, this strain by mutation (mutation of already present gene) produces relatively higher 6- N. kanamycin acetyltransferase or acquires it by genetic engineering (i.e., introducing cloned gene) and thus is resistant to high concentration of kanamycin during growth phase. 10  Biotechnology Title of lecture 01 vitamins ‫ زي بعض‬secondary metabolite ‫ لو عاوزين نصنع‬ ‫ ليها‬essential ‫ ليها والزم تصنعها من نفسها وبعضها مش‬essential ‫ دي بتكون‬vitamins ‫ بعض البكتيريا‬- trace element ‫ انما‬primary metabolite ‫ وبالتالي هي‬organism ‫ ألي‬essential ‫ بتكون‬amino acids ‫ و‬fatty acid ‫ لكن كل‬- Ca / Mg ‫ مفيش بكتيريا بتطلع‬secondary metabolite ‫ده‬ ‫ وبعدين عملوه في شكل‬،‫ مايكرو بنسلين‬١ ‫لقوه بيطلع‬penicillium notatum ‫ فبيقولك هنا أن أول بنسلين عملوه كان في شكل‬- ‫ مرة اكتر‬٥٠٠ ‫خلته ينتج بنسلين‬mutation ‫ وبعدين عملوا‬١٠ ‫ فبقى بيطلع‬penicillium chrysogenum - : ‫ وعندى مثالين‬mutation ‫ عن طريق نعمل‬secondary metabolite ‫ ازاي نعمل‬ fungi penicillium in Production of penicillin ‫ نستخدم‬- production of Streptomycin or Kanamycin , neomycin ‫ في‬Bacteria Streptomyces ‫ تاني طريقة باستخدام‬- Auxotoxic / autotoxic ‫ تعال نعرف الفرق بين‬ ‫وتعمل‬ ‫ ده‬toxin ‫ ضد‬defense Mechanism ‫ تقوم البكتيريا تعمل‬...‫ من برة الخلية هيموت البكتيريا‬toxin ‫ دي‬Auxotoxic - penicillin ‫ من الدخول او تطلع‬toxin ‫ وتمنع‬Auxotoxic resistant ‫ ده يموتها هي زي المعدة‬toxin ‫ ولكن في نفس الوقت بتدافع ومتخليش‬toxin ‫ دي بكتيريا بتطلع مضاد حيوي او‬Autotoxic - ‫ بيحميها زي ان البكتيريا تحمي‬defense Mechanism ‫ المحاط بجدار المعدة فيه‬membrane ‫كدة مش بتهضم نفسها علشان‬ ‫ كمثال بكتيريا بتطلع واحد‬naturally (normal ) concentration produced by bacteria under normal condition ‫نفسها من‬ accumulated conc inside the cell ‫هي عندها االنزيم اللي يكسر‬ bacteria ‫ اللى يموت‬normal conc ‫ تطلع برة بيتبقي شوية جوا الخلية أقل من‬antibiotics ‫ لما‬bacteria ‫ بعض‬- overcome accumulation concentration inside the cell ‫ اللى‬defense Mechanism ‫ بتطلع‬genes ‫ اذا عندها‬- ‫ ملزوق علي‬bacteriocin ‫ يموت بكتيريا اللي حوليها والجين المسؤل عن خروج‬bacteriocin ‫ المسؤلة عن انها تخرج‬Bacteria - membrane ‫ يطلع بروتين يلزق في المكان في‬segment ‫ يمسك فيه يطلعه برة و‬segment ‫ منهم‬segment ‫األقل في خمسة‬ ‫ بيكسر فيه علشان تحمي نفسها وتمنعه كأنه بيسد ليه السكه وبكدة البكتيريا بتحمي نفسها‬bacteriocin ‫اللي‬ Why Autotoxic resistant strain is required for production of kanamycin but not Penicillin G?) In kanamycin the Streptomyces strain in Bacteria which is affected by kanamycin This strain acquires more 6- N. Kanamycin-acetyl- transferase production and thus is resistant to high concentration of residual kanamycin accumulated inside the cell. Consequently, is able to grow at high conc. Produced in idiophase. 6-N. kanamycin ‫ جين يطلع انزيم‬Streptomyces kanamyceticus ‫ او الطريقة التانية ممكن ادخل جوا‬mutation ‫كدا عملت‬ ✓ ‫ فيبقا ف عندى كمية كبيرة من االنزيم بتخرج هتكسر‬mutation + enzyme ‫ من‬combination ‫ او اعمل‬acetyltransferase ‫ اللي موجودة‬accumulated kanamycin ‫ اللي‬accumulation ‫ يكسر‬6- N. kanamycin acetyltransferase ‫ فتطلع قصاده‬Kanamycin X ‫ بتطلع‬normal ‫ ال‬Bacteria ✓ ‫ جوا الخلية‬residual conc. ‫ هيطلع برة الخلية ألنه بكمية كبيرة ولكن‬hyper producer kanamycin ‫جواها اما لو كانت البكتيريا‬ ‫ ويخلي البكتيريا تموت وابقا كدة ما عملتش حاجة‬MIC ‫ عشان ما يزيدش عن‬kanamycin ‫هيزيد بردو عشان يكسر‬ inside ‫ بكمية كبيرة علشان تعمل‬6- N. Kanamycin-acetyl- transferase ‫ اللي تخليها تطلع‬defense Mechanism ‫فهنزود‬ ✓ Autotoxic ‫ تنمو وده اسمه‬Bacteria ‫ و‬MIC ‫ يقل عن‬residual ‫ يبدأ‬destruction to high accumulation ‫ وتموت‬accumulated inside the cell ‫ من بره فهيحصل‬Kanamycin in high conc ‫ دي بكتيريا لو دخلنا ليها‬Streptomyces ✓ ‫ البكتيريا مش هتموت‬MIC ‫ طالما ما وصلش لل‬residual conc inside the bacteria ‫ بيطلع برا و‬secretion ‫انما هى اما بتعمل‬ ✓ )MIC = minimum inhibitory concentration) ✓ ‫ جوا الخلية و االنزيم ده مش بيخرج برة الخلية‬Kanamycin ‫ فيها جينات بتطلع انزيم اللي بيكسر‬Bacteria ‫اللي بيحصل كالتالي‬ ✓ ‫ هيتكسر باالنزيم وبالتالى هيكون أقل من‬Bacteria ‫ اللي موجود جوا‬Kanamycin residual ‫ موجود برة و‬Streptomycin ‫وبكدة‬ 6- N. kanamycin acetyltransferase ‫ جوا الخلية االنزيم اسمه‬accumulation ‫ وبالتالى مش بيبقا فيه‬effective conc 11  Biotechnology Title of lecture 01 Very important to know; The antibiotics like kanamycin (as secondary metabolites) released out the cell and 6- N. ‫ بكمية كبيرة‬penicillin ‫ بتطلع‬fungi ‫لو خليت‬ autotoxic resistant ‫هل انا كدا محتاج احضر‬ Kanamycin-acetyl transferase produced by wild-type (isolated ‫ ️⁉ اإلجابة ال ألن‬mutation ‫ عن طريق‬strain from nature) strain is enough to inactivate residually ‫ يموتوا بكتيريا‬Streptomycin ‫ و‬Kanamycin accumulated synthesized antibiotic in the cell. fungi ‫مش بيعمل حاجة في‬ Autotoxic resistant strain produces more and more inactivating enzyme to inactivate more residually accumulated antibiotic in the cell. Techniques used either by a- Mutation of already defense enzyme encoding gene or by b- Genetically engineering; introducing a cloned gene (which mediates the production the 6- N. Kanamycin- acetyl transferase) into the cells To increase the yield 1- Improvement the quality of 2- Improve conditions of industrial micro-organisms production A. Mutations B. genetic physical nutritional recombination condition condition glutamic nuclear protoplast genetic lysine acid fusion fusion engineering 12