Biosíntesis de proteínas PDF

TEMA 9.- BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS 1. CÓDIGO GENÉTICO. 1.1.- ARNm ARTIFICIALES PERMITIERON DESCIFRAR EL CÓDIGO GENÉTICO. 1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO 2. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS FASE 1: ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS. A. Unión de los aminoácidos a sus ARNt mediante las am...

TEMA 9.- BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS 1. CÓDIGO GENÉTICO. 1.1.- ARNm ARTIFICIALES PERMITIERON DESCIFRAR EL CÓDIGO GENÉTICO. 1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO 2. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS FASE 1: ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS. A. Unión de los aminoácidos a sus ARNt mediante las aminoacil-ARNt sintetasas B. Corrección de pruebas por las aminoacil-ARNt sintetasas C. Interacción entre una aminoacil-ARNt sintetasa y un ARNt: un "segundo código genético" FASE 2: INICIO FASE 3: ELONGACIÓN 1ª PARTE ELONGACIÓN: Unión de un aminoacil-ARNt entrante. 2ª PARTE ELONGACIÓN: Formación del enlace peptídico. 3ª PARTE ELONGACIÓN: Translocación. FASE 4: TERMINACIÓN Y LIBERACIÓN FASE 5: PLEGAMIENTO Y MODIFICACIÓN POSTRADUCCIÓN A. Modificaciones aminoterminales y carboxilo-terminales. B. Pérdida de secuencias señal. C. Modificación de aminoácidos concretos. D. Unión de cadenas laterales de glúcidos. E. Adición de grupos isoprenilo F. Adición de grupos prostéticos. G. Modificación proteolítica. H. Formación de puentes disulfuro. 3.- ALGUNAS PROTEÍNAS SUFREN UN PLEGAMIENTO ASISTIDO 3.1.- Chaperonas 3.2.- Chaperoninas 4. LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS ES INHIBIDA POR MUCHOS ANTIBIÓTICOS Y TOXINAS 5. DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS 6. REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN 7.- SILENCIAMIENTO POSTRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES Anexo- Traducción en coronavirus TEMA 9. ACTIVIDAD 1. OBJETIVOS DE APRENDIZAJE 2. PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO 3. EVALUACIÓN BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 1 BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 2  TEMA 9.- BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS La síntesis de proteínas consume hasta el 90% de la energía química utilizada por la célula en todas las reacciones biosintéticas. Cada célula procariota o eucariota contienen miles de copias de cada tipo de proteína y de ARN. Cada célula procariota tiene alrededor de 15.000 ribosomas, 100.000 factores proteicos y enzimáticos y unas 200.000 moléculas de ARNt. A pesar de estos datos y de la gran complejidad, las proteínas se fabrican a velocidades vertiginosas: una cadena polipeptídica de 100 residuos se sintetiza en una célula de E.coli en aproximadamente 5 segundos. Para mantener las concentraciones adecuadas de proteínas, los procesos de destinación y degradación proteica han de estar perfectamente coordinados con la síntesis. Introduction to Protein Synthesis: https://www.youtube.com/watch?v=suN-sV0cT6c 1. CÓDIGO GENÉTICO. Francis Crick se preguntó de qué forma se podía transcribir la información genética contenida en el ADN (lenguaje de 4 letras) a la información contenida en las proteínas (lenguaje de 20 letras). Alguna molécula debía desempeñar un papel adaptador, de tal forma que una parte de esa molécula se uniría a un aa específico mientras que otra parte de ese adaptador reconocería la secuencia nucleotídica en el ARNm que codificara ese aa. Esta idea se confirmó: el ARNt adaptador “traduce” la secuencia nucleotídica de un ARNm a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Al proceso global de la síntesis de proteínas se le denomina traducción. 1.1 ARNm ARTIFICIALES PERMITIERON DESCIFRAR EL CÓDIGO GENÉTICO. En la década de 1960 ya se sabía que eran necesarios tres nucleótidos de ADN para codificar cada aa. Recordando probabilidades, si se hacen combinaciones de 4 elementos (A, T, G y C) tomadas de dos en dos, solo se obtendrían 16 combinaciones distintas (42) que son insuficientes para codificar los 20 aas existentes. Los 4 nucléotidos combinados de tres en tres producen 64 combinaciones distintas (43). Esto parecía más factible y se utilizó como hipótesis de partida. Se denomina CODÓN al triplete de nucleótidos que codifica un aminoácido específico. 3D animation http://www.dnalc.org/view/15513-How-many-bases-code-for-an-amino-acid-3D-animation-with-basic- narration.html BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 3 Los resultados de muchos experimentos con polímeros artificiales permitieron la asignación de 61 de los 64 codones posibles. Los otros tres se identificaron como codones de terminación, en parte porque rompían los patrones de codificación de aminoácidos cuando estaban presentes en la secuencia de los polímeros de ARN sintético. El significado de todos los tripletes –lo que denominamos la TABLA DEL CÓDIGO GENÉTICO- fue establecido en 1966 y ha sido verificado de muchas formas distintas. El descifrado del código genético está considerado como uno de los mayores descubrimientos científicos del siglo XX. Los codones son la clave de la traducción de la información genética, que hace posible la síntesis de proteínas específicas. The Genetic Code and Mutations https://www.youtube.com/watch?v=QJHQagpvCAo 1.2. CARACTERÍSTICAS DEL CÓDIGO GENÉTICO Analicemos el código genético para detallar cada una de sus características: Una de las primeras características que se descubrió con respecto al código genético es que no presenta solapamiento. En un código sin solapamiento los codones no comparten nucleótidos. Cuando en un código hay solapamiento algunos nucleótidos son compartidos por codones distintos. Algunos codones tienen funciones especiales. El codón de inicio, AUG, es la señal más común del principio de las cadenas polipeptídicas en todas las células y, además, codifica residuos de Met en posiciones internas de los polipéptidos. Los codones de terminación (UAA, UAG y UGA), también llamados codones fin o codones sin sentido, normalmente señalan el final de la síntesis de un polipéptido y no codifican ninguno de los aminoácidos conocidos. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 4  Marco de lectura abierto (ORF). El primer codón dentro de la secuencia determina la pauta o marco de lectura, de forma con un nuevo codón empieza cada tres nucleótidos y todos los codones son leídos de forma sucesiva (sin puntuación). Aunque cualquier secuencia de ADN o de ARNm tiene tres posibles marcos de lectura lo más probable es que solo una de ellas codifique una proteína determinada. Pauta de lectura 1 Pauta de lectura 2 Pauta de lectura 3 El marco de lectura se establece cuando comienza la traducción de una molécula de ARNm y se mantiene durante la lectura del mensajero completo. Si el marco de lectura inicial se desplaza, todos los codones cambiarán a partir de ese punto y, por consiguiente, todos los aminoácidos que se vayan incorporando: el resultado será una proteína "sin sentido" con una secuencia de aminoácidos alterada. Las mutaciones del marco de lectura producidas como consecuencia de la adicción o la deleción de una base pueden causar una alteración en el marco de lectura del ARN mensajero En una secuencia de nucleótidos al azar, uno de cada 20 codones de cada marco de lectura, es, como promedio, un codón fin. En general, un marco de lectura sin un codón de terminación en 50 o más codones se denomina marco abierto de lectura (open reading frame, ORF). Los marcos de lectura abiertos más largos normalmente corresponden a genes que codifican proteínas. En muchos programas informáticos de bancos de datos de secuencia disponibles en Internet, se utilizan potentes programas para buscar marcos abiertos de lectura con el objeto de encontrar genes dentro de una gran cantidad de ADN no génico. A modo de ejemplo, un gen no interrumpido que codificara una proteína típica de masa molecular 60.000 requeriría un marco le lectura abierto que tuviera 500 codones o más. El código genético es degenerado. Un aminoácido puede ser especificado por más de un codón, por lo que el código se dice que es degenerado. Ello no significa que el código sea imperfecto: aunque un aminoácido puede tener dos o más codones, cada codón especifica un solo aminoácido. La degeneración del código no es uniforme ya que existen aminoácidos codificados por un número diferente de codones. El código genético es casi universal. Los codones de los aminoácidos son idénticos en todas las especies examinadas hasta ahora. Los seres humanos, bacterias, plantas, animales y virus comparten el mismo código genético. Pequeñas variaciones en las mitocondrias, algunas BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 5 bacterias y algunos eucariotas unicelulares constituyen algunas excepciones. Esta universalidad del código indica que todas las formas de vida tienen un antepasado común, cuyo código genético ha sido preservado a lo largo de toda la evolución biológica. Balanceo de la tercera base. Cuando un aminoácido es especificado por varios codones, la diferencia entre ellos se encuentra normalmente en la tercera base (en el extremo 3'). Por ejemplo, la alanina está codificada por los tripletes GCU, GCC, GCA y GCG. Los codones de casi todos los aminoácidos se pueden simbolizar por XYAG o XYUC, siendo las dos primeras letras de cada codón los determinantes primarios de la especificidad. El anticodón es una secuencia de tres nucleótidos que es capaz de reconocer el codón del ARNm y formar puentes de hidrógeno con él de forma antiparalela. Si el anticodón de un ARNt determinado reconociese solamente un codón, las células tendrían un ARNt diferente para cada codón de un aminoácido. Sin embargo, no es así, porque los anticodones de algunos ARNt contienen el nucleótido inosinato (designado como I, y que contiene la base poco frecuente hipoxantina). El inosinato puede formar puentes de hidrógeno con tres nucleótidos diferentes (U, C y A) aunque de forma mucho más débil. Tras el análisis de apareamientos codón-anticodón en diferentes especies Crick llegó a extraer la conclusión de que la tercera base de la mayoría de los codones se aparea débilmente con la correspondiente base de los anticodones, es decir, se “balancea”. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 6 La hipótesis del balanceo de Crick se basa en: 1.- Las dos primeras bases de un codón del ARNm siempre forman pares de bases fuertes del tipo Watson y Crick con las bases correspondientes del anticodón del ARNt y son responsables de la mayor parte de la especificidad del código. 2.- La primera base del anticodón, que se aparea con la tercera base del codón determina el número de codones que pueden ser reconocidos por el ARNt. Cuando la primera base del anticodón es C o A, el apareamiento es específico y únicamente un codón es reconocido por el ARNt. Cuando la primera base es U o G, la unión es menos específica y pueden leerse dos codones. Cuando la inosina (I) es el primer nucleótido (de balanceo) del anticodón, pueden reconocerse tres codones diferentes -el número máximo para cualquier ARNt -. 3.- Cuando un aminoácido es especificado por varios codones diferentes, los codones que difieren en cualquiera de las dos primeras bases requieren ARNt diferentes. 4.- Para que se pueda producir la traducción del total de los 61 codones se requiere un mínimo de 32 ARNt (31 se utilizan para codificar los aminoácidos y 1 para el inicio). El apareamiento débil permite la rápida disociación del ARNt de su codón durante la síntesis proteica. Si las tres bases de los codones formasen apareamientos fuertes con las tres bases del anticodón, los ARNt se disociarían demasiado lentamente, con lo cual la velocidad de síntesis de proteínas sería muy lenta. 2. SÍNTESIS DE PROTEÍNAS Translation (Advanced Detail) https://www.hhmi.org/biointeractive/translation-advanced-detail Antes de comenzar a estudiar el proceso propiamente dicho, recordemos que tanto los ribosomas como los ARNt juegan un papel clave en este proceso celular. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 7  RIBOSOMAS.- El ribosoma es una compleja máquina supramolecular formada por dos subunidades con grandes moléculas de ARN que forman un núcleo estructural y una serie de proteínas que se disponen en la superficie. La estructura de alta resolución confirma lo que se sospechaba desde hacía más de una década: el ribosoma es un ribozima, ya que contiene moléculas de ARN con capacidad catalítica. Las dos subunidades ribosómicas de forma irregular encajan y forman una hendidura a través de la cual pasa el ARNm a medida que el ribosoma se mueve durante la traducción. La mayoría de proteínas tienen dominios globulares, que se encuentran dispuestos en la superficie del ribosoma y aunque la función no se conoce con detalle es probable que muchas de ellas tengan un papel estructural. ARNt.- Para entender cómo pueden actuar los ARNt, como adaptadores en la traducción del lenguaje de los ácidos nucleicos al de las proteínas, hay que examinar su estructura con detalle. Los ARN de transferencia son relativamente pequeños: en las bacterias y en el citosol de los eucariotas, los ARNt tienen entre 73 y 93 nucleótidos, que corresponden a masas moleculares de entre 24.000 y 31.000. Las células poseen al menos una clase de ARNt para cada aminoácido; se requieren al menos 32 ARNt para reconocer todos los codones de los aminoácidos, si bien algunas células utilizan más de 32. La mayoría de ARNt tienen un residuo de guanilato (pG) en el extremo 5' y todos tienen la secuencia de tres nucleótidos CCA(3') en el extremo 3'. Cuando se representan en dos dimensiones, la disposición de los puentes de hidrógeno de todos los ARNt forma una estructura en forma de hoja de trébol con cuatro brazos; los ARNt más largos tienen un quinto brazo corto, o brazo extra. En tres dimensiones, el ARNt tiene forma de L retorcida. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 8  Dos de los brazos del ARNt son esenciales para su función de adaptador: - El brazo del aminoácido lleva un aminoácido específico esterificado por su grupo carboxilo al grupo hidroxilo 2' o 3' del residuo A del extremo 3' del ARNt. - El brazo del anticodón contiene el anticodón. Los otros brazos son el brazo D, que contiene el nucleótido infrecuente dihidrouridina (D), y el brazo TψC, que contiene ribotimidina (T), que no se encuentra normalmente en los ARN, y pseudouridina (ψ), que tiene un enlace carbono- carbono entre la base y la ribosa no habitual. El brazo TψC interacciona con el ARNr de la subunidad grande. El proceso de la síntesis de proteínas se divide en cinco fases: FASE 1: ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS. Resumen: La síntesis de un polipéptido de secuencia definida exige el cumplimiento de dos requerimientos químicos fundamentales: 1. El grupo carboxilo de cada aminoácido debe ser activado para facilitar la formación del enlace peptídico 2. Cada nuevo aminoácido debe ser incorporado de acuerdo con la información contenida en el ARNm que lo codifica. Ambos requerimientos están garantizados por la unión del aminoácido a un ARNt en la primera etapa de la síntesis proteica. La unión de cada aminoácido al ARNt que le corresponde es determinante. La reacción tiene lugar en el citosol y no en los ribosomas. Cada uno de los 20 aas se une covalentemente a un ARNt específico, consumiendo energía del ATP y utilizando enzimas activadores dependientes de Mg2+, denominados aminoacil-ARNt sintetasas. Los ARNt unidos a su aminoácido (aminoacilados) se designan como "cargados". A. Unión de los aminoácidos a sus ARNt mediante las aminoacil-ARNt sintetasas. En el inicio de la síntesis de proteínas, los 20 aminoácidos diferentes son esterificados con sus correspondientes ARNt por las aminoacil- ARNt sintetasas. La mayor parte de organismos tienen una aminoacil-ARNt sintetasa específico para cada aminoácido. Si a un aminoácido le correspondan dos o más ARNt, normalmente el mismo enzima aminoacila todos ellos. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 9 Esta reacción tiene lugar en dos pasos: En el primero se forma un intermediario ligado al enzima, el aminoacil adenilato (aminoacil-AMP), por reacción del grupo carboxilo del aminoácido con el grupo α-fosforilo del ATP para formar un enlace anhídrido con desplazamiento de pirofosfato. En el segundo paso, se transfiere el grupo aminoacilo desde el aminoacil-AMP unido al enzima a su correspondiente ARNt específico. El pirofosfato que se formó se hidrolizó gracias a la pirofosfato inorgánico hidrolasa. Se consumen, por tanto, dos enlaces fosfato de alta energía por cada molécula de aminoácido activada, de modo que la reacción global de activación de aminoácidos es prácticamente irreversible: Mg 2+ Aminoácido + ARNt + ATP aminoacil-ARNt + AMP + 2P¡ ΔG'° ≈ -29 kJ/mol B. Corrección de pruebas por las aminoacil-ARNt sintetasas Se ha visto que algunas aminoacil-ARNt sintetasas tienen una función de corrección de pruebas. Si las interacciones de unión no proporcionan una discriminación suficiente entre dos sustratos los aminoacil-AMP incorrectos se unen a otro sitio activo del enzima, y son hidrolizados. Además, la mayoría de aminoacil-ARNt sintetasas también pueden hidrolizar el enlace éster entre los aas y el ARNt en los aminoacil-ARNt. Esta hidrólisis se acelera mucho en el caso de ARNt cargados incorrectamente con lo que se consigue potenciar la fidelidad del proceso global. La tasa de error media de la síntesis (~1 error por 104 aas incorporados) no es tan baja como la de la replicación del ADN. Los errores en una proteína son eliminados cuando la proteína es degradada, por lo que no pasan a generaciones sucesivas y tienen menor importancia biológica. Una copia defectuosa de una molécula proteica carece normalmente de importancia en presencia de muchas copias correctas de la misma proteína. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 10 C. Interacción entre una aminoacil-ARNt sintetasa y un ARNt: un "segundo código genético" Una determinada aminoacil-ARNt sintetasa ha de ser específica no sólo para un único aminoácido sino también para ciertos ARNt. La discriminación entre varias docenas de ARNt es tan importante para la fidelidad global de la biosíntesis de proteínas como la distinción entre aminoácidos. La interacción entre las aminoacil-ARNt sintetasas y los ARNt ha sido calificada de "segundo código genético", para poner de manifiesto su papel fundamental en el mantenimiento de la precisión de la síntesis proteica. FASE 2: INICIO Resumen: El ARNm portador del código del polipéptido que se ha de sintetizar se une a la menor de las dos subunidades ribosómicas y al aminoacil-ARNt iniciador. La subunidad ribosómica mayor se une a continuación para formar el complejo de inicio. El aminoacil-ARNt iniciador se aparea con el codón AUG del ARNm, que señala el principio del polipéptido. Este proceso, que requiere GTP, es promovido por proteínas citosólicas denominadas factores de inicio. La síntesis de proteínas empieza en el extremo amino-terminal y avanza por adición de sucesivos aminoácidos al extremo carboxilo-terminal del polipéptido (Dintzis, 1961). El codón de inicio AUG específica, por tanto, un residuo de metionina amino-terminal. Aunque sólo existe un codón para la metionina, (5') AUG, todos los organismos contienen dos ARNt para la metionina, uno que se utiliza para incorporar metionina en posición de inicio, y otra para incorporar este mismo aa en posiciones intermedias. Inicio en procariotas: las bacterias contienen dos ARNts diferentes para la metionina: ARNtfMet y ARNtMet, el primero de ellos se utiliza exclusivamente cuando el (5')AUG es el codón de inicio para la síntesis proteica, y el segundo se utiliza para codificar la metionina cuando se encuentra en una posición interna del polipéptido. El primer aminoácido incorporado de acuerdo con el codón de inicio (5')AUG es N- formilmetionina (fMet). Llega al ribosoma como N-formilmetionina- ARNtfMet (fMet-ARNtfMet) y se forma en dos reacciones sucesivas: 1. Met-ARNt sintetasa une la metionina al ARNtfMet 2. Una transformilasa transfiere un grupo formilo procedente del N10- formiltetrahidrofolato al grupo amino del residuo de Met. La adición del grupo N-formilo al grupo amino de Met impide que la fMet se incorpore en las posiciones interiores de los polipéptidos. Inicio en eucariotas: los eucariotas también tienen ARNts distintos para residuos Met al comienzo de la cadena y para residuos Met en posiciones intermedias. Sin embargo, todos los polipéptidos sintetizados por los ribosomas citosólicos empiezan con un residuo de Met (en lugar de fMet), mientras que, curiosamente, los polipéptidos sintetizados en las mitocondrias y cloroplastos empiezan fMet. Este hecho apoya fuertemente la hipótesis del endosimbionte. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 11 ¿Cómo puede un único codón 5'(AUG) distinguir entre la N-formilmetionina del principio (o la metionina en el caso de los eucariotas) y los residuos de Met interiores? La formación del COMPLEJO DE INICIO tiene lugar en tres etapas: EN LA 1ª ETAPA la subunidad ribosómica 30S une dos factores de inicio IF-1 e IF-3. IF-3 impide que las subunidades 30S y 50S se unan prematuramente. A continuación, el ARNm se une a la subunidad 30S. El iniciador 5'(AUG) es guiado hasta su posición correcta por la secuencia de Shine-Dalgarno (llamada así por los investigadores John Shine y Lynn Dalgarno que la identificaron) del ARNm. Esta secuencia consenso es una señal de inicio de cuatro a nueve residuos purínicos, que se encuentra entre 8 y 13 nucleótidos en el lado 5'del codón de inicio. La secuencia se aparea con una secuencia complementaria rica en pirimidinas cerca del extremo 3' del ARNr 16S de la subunidad ribosómica 30S. Esta interacción ARNm-ARNr sitúa la secuencia de inicio (5') AUG del ARNm en la posición correcta de la subunidad 30S, donde es requerida para que se inicie la traducción. El (5') AUG específico al que debe unirse el fMet-ARNtfMet se distingue de otros codones de metionina por su proximidad a la secuencia de Shine-Dalgarno del ARNm. Los ribosomas bacterianos tienen tres sitios que fijan aminoacil-ARNt, el sitio aminoacilo o sitio A, el sitio peptidilo o sitio P y el sitio de salida o sitio E. Tanto la subunidad 30S como la 50S contribuyen a las características de los sitios A y P, mientras que el sitio E se encuentra en su mayor parte en la subunidad 50S. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 12 El iniciador (5')AUG se sitúa en el sitio P, que es el único sitio al que se puede fijar el fMet-ARNtfMet. El fMet-ARNtfMet es el único aminoacil-ARNt que se une primero al sitio P; durante la fase de elongación que viene a continuación, todos los aminoacil-ARNt entrantes (incluido el Met-ARNtMet, que se fija a los AUG interiores) se unen primero al sitio A y sólo a continuación se unen a los sitios P y E. El sitio E es el sitio del que se desprenden los ARNt "descargados" durante la elongación. El factor de inicio IF-1 se une al sitio A, impidiendo la unión del ARNt a este sitio durante la iniciación. EN LA 2ª ETAPA del proceso de inicio, tanto el IF-2 unido a GTP como el fMet-ARNtfMet iniciador se unen al complejo formado por la subunidad 30S, el IF-3 y el ARNm. El anticodón del fMet-ARNtfMet se aparea correctamente con el codón de inicio en este paso. EN LA 3ª ETAPA, todo este gran complejo anterior se combina con la subunidad ribosómica 50S. GTP unido al IF-2 se hidroliza a GDP y Pi, que se desprenden del complejo. En este punto, los tres factores de inicio IF1, IF2 e IF3 abandonan el ribosoma. Una vez completadas las tres etapas descritas anteriormente se obtiene un ribosoma 70S funcional, denominado COMPLEJO DE INICIO, que contiene el ARNm y el fMet- ARNtFMet iniciador. La traducción eucariótica es similar a la traducción bacteriana, encontrándose la mayor parte de las diferencias significativas asociadas al mecanismo de inicio. Los eucariotas presentan varias proteínas de unión tanto al extremo 5' como al 3'del ARNm (por ejemplo, PAB -proteína de unión a poliA- se une a 3'). La proximidad de los extremos facilita la regulación traduccional de la expresión génica. El (5')AUG iniciador es detectado en el ARNm, no por la proximidad a una secuencia del tipo Shine-Dalgarno, sino por un proceso de barrido del ARNm a partir del extremo 5' hasta encontrar el primer AUG que marca el inicio del marco de lectura. Llegados a este punto, el complejo de inicio está listo para la elongación. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 13 FASE 3: ELONGACIÓN Resumen: La cadena polipeptídica naciente se alarga mediante la unión covalente de sucesivas unidades de aminoácidos, transportada cada una al ribosoma y posicionada correctamente por su ARNt, que se aparea con su correspondiente codón en el ARNm. La elongación requiere proteínas citosólicas, denominadas factores de elongación. La fijación de los aminoacil-ARNt entrantes y el desplazamiento del ribosoma a lo largo del ARNm están facilitados por la hidrólisis de GTP, a medida que los residuos son añadidos al polipéptido en crecimiento. 1ª PARTE ELONGACIÓN: Unión de un aminoacil-ARNt entrante. En el primer paso del ciclo de elongación, el aminoacil-ARNt entrante se fija a un complejo EF- Tu que contiene GTP. El complejo resultante aminoacil-ARNt-EF-Tu-GTP se une a continuación al sitio A del complejo de inicio 70S. El GTP se hidroliza y se libera un complejo EF-Tu-GDP del ribosoma 70S. El complejo EF-Tu-GTP se regenera en un proceso en que participan EF-Ts y GTP. 2ª PARTE ELONGACIÓN: Formación del enlace peptídico. Se forma ahora un enlace peptídico entre los dos aminoácidos unidos mediante sus ARNt a los sitios A y P del ribosoma. Ello tiene lugar por transferencia del grupo N-formilmetionilo iniciador desde su ARNt al grupo amino del 2º aminoácido, que se encuentra ahora en el sitio A. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 14 El grupo a-amino del aminoácido en el sitio A actúa como nucleófilo, desplazando el ARNt del sitio P para formar el enlace peptídico. Esta reacción produce un dipeptidil-ARNt en el sitio A, mientras que el ahora "descargado" ARNtfMet permanece unido al sitio P. La actividad enzimática que cataliza la formación del enlace peptídico es la peptidil transferasa catalizada por el ARNr 23S, función que hay que añadir al repertorio catalítico conocido de los ribozimas. 3ª PARTE ELONGACIÓN: Translocación. En la translocación, el ribosoma se desplaza un codón en dirección hacia el extremo 3' del ARNm. Este movi- miento desplaza el anticodón del dipeptidil-ARNt, del sitio A al sitio P. De igual modo, ARNt desacilado se desplaza del sitio P al sitio E, desde donde es liberado al citosol. El tercer codón del ARNm se encuentra ahora en el sitio A y el segundo codón en el sitio P. El movimiento del ribosoma a lo largo del ARNm requiere EF-G (también denominado translocasa) y la energía proporcionada por la hidrólisis de otra molécula de GTP. ¿Cómo se lleva a cabo el movimiento del ribosoma a lo largo del ARNm? Gracias a un cambio en la conformación tridimensional global del ribosoma entero. De la misma forma se irán uniendo los siguientes ARNt de tal forma que por cada residuo aminoácido correctamente unido al polipéptido en crecimiento, se hidrolizarán dos GTP a GDP y P¡, a medida que el ribosoma se desplaza de codón en codón a lo largo del ARNm hacia el extremo 3'. Los ribosomas eucarióticos no tienen un sitio E, los ARNt descargados son liberados directamente del sitio P. Protein Synthesis Animation Videohttps://www.youtube.com/watch?v=Ikq9AcBcohA La corrección de pruebas en el ribosoma. El proceso de la síntesis de proteínas ha sido claramente optimizado a lo largo de la evolución para equilibrar los requerimientos de velocidad y fidelidad. Una mejora en la fidelidad podría disminuir la velocidad, mientras que el aumento en la velocidad probablemente sacrificaría la fidelidad. El mecanismo de corrección del ribosoma solamente establece si se ha producido el apareamiento codón-anticodón correcto. La identidad de los aminoácidos unidos a los ARNt no es revisada en el ribosoma, de tal forma que si un ARNt BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 15 está aminoacilado con un aminoácido incorrecto éste será incorporado sin ningún problema a la proteína. FASE 4: TERMINACIÓN Y LIBERACIÓN Resumen: La finalización de la cadena polipeptídica está señalada por un codón de terminación del ARNm. A continuación, la cadena polipeptídica se desprende del ribosoma con ayuda de proteínas denominadas factores de liberación (“release factor”, RF). La terminación de la síntesis de polipéptidos requiere una señal específica La elongación continúa hasta que el ribosoma añade el último aminoácido codificado por el ARNm. La terminación está señalada por uno de los tres codones de terminación del ARNm (UAA, UAG, UGA) situado inmediatamente después del codón del último aminoácido codificado. Las mutaciones en un anticodón del ARNt que permiten la inserción de un aminoácido en un codón de terminación tienen consecuencias fatales y generalmente son deletéreas para la célula. En las bacterias, cuando un codón de terminación ocupa el sitio A del ribosoma, tres factores de terminación o de liberación, las proteínas RF-1, RF-2 y RF-3, contribuyen a: - la hidrólisis del enlace peptidil-ARNt terminal - la liberación del polipéptido y del último ARNt, ya descargado, del sitio P y - la disociación del ribosoma 70S en sus subunidades 30S y 50S, disponibles para iniciar un nuevo ciclo de síntesis proteica. Tanto RF-1 como RF-2 se unen a un codón de terminación y hacen que la peptidil transferasa transfiera la cadena polipeptídica en crecimiento a una molécula de agua en lugar de a otro aminoácido. Los factores de liberación poseen dominios que aparentemente mimetizan la estructura del ARNt. Aunque no se ha establecido con claridad la función específica del RF-3, se supone que libera la subunidad ribosómica. En los eucariotas, un solo factor de liberación, denominado eRF, reconoce los tres codones de terminación. El coste energético de la síntesis de proteínas es muy elevado. Las proteínas son polímeros que contienen información y el objetivo bioquímico no es simplemente la formación de un enlace peptídico, sino formarlo entre dos aminoácidos específicos. Cada uno de los compuestos fosfato de alta energía gastados en este proceso juega un papel determinante en el mantenimiento del BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 16 alineamiento correcto entre cada nuevo codón del ARNm y su correspondiente aminoácido. Este coste de energía hace posible una gran fidelidad en la traducción biológica del mensaje genético del ARNm a la secuencia de aminoácidos de las proteínas. En las bacterias, la transcripción y la traducción están estrechamente acopladas. Los RNA mensajeros se sintetizan y se traducen en la misma dirección 5'—»3', de tal forma que los ribosomas empiezan a traducir el extremo 5' del ARNm antes de que se haya completado la transcripción. FASE 5: PLEGAMIENTO Y MODIFICACIÓN POSTRADUCCIÓN Resumen: Para adoptar su forma biológicamente activa, el nuevo polipéptido ha de plegarse en su conformación tridimensional adecuada. Antes o después del plegamiento, el nuevo polipéptido puede experimentar modificaciones enzimáticas, incluyendo la eliminación de uno o más aminoácidos (normalmente del extremo amino-terminal); la adición de grupos acetilo, fosfato, metilo, carboxilo u otros grupos a ciertos residuos aminoácidos; el corte proteolítico y/o la unión de oligosacáridos o grupos prostéticos. Durante o después de la síntesis de proteínas, la cadena polipeptídica naciente se pliega y se modifica para adquirir su forma biológicamente activa. Algunas proteínas recién sintetizadas, tanto procarióticas como eucarióticas, no adquieren su conformación biológicamente activa hasta que han sido modificadas por una o más reacciones, denominadas modificaciones postraducción. A. Modificaciones aminoterminales y carboxilo-terminales. El primer residuo insertado en todos los polipéptidos (N-formilmetionina –en procariotas- o metionina -en eucariotas-) puede ser eliminado enzimáticamente en la elaboración de la proteína funcional final. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 17 En hasta el 50% de las proteínas eucarióticas, el grupo amino del residuo amino-terminal es N- acetilado después de la traducción. Los residuos carboxilo-terminales también son a veces modificados. B. Pérdida de secuencias señal. Entre 15-30 residuos del extremo amino-terminal de algunas proteínas forman la secuencia señal que participa en dirigir la proteína a su destino final en la célula. Estas secuencias son finalmente eliminadas mediante peptidasas específicas. C. Modificación de aminoácidos concretos. Los grupos hidroxilo de ciertos residuos de Ser, Thr y Tyr de algunas proteínas son fosforilados enzimáticamente por ATP: los grupos fosfato añaden cargas negativas a estos polipéptidos y esto tendrá un significado funcional diferente dependiendo de la proteína. Por ejemplo, la caseína de la leche tiene muchos grupos fosfoserina que fijan Ca2+. El calcio, el fosfato y los aminoácidos son nutrientes esenciales para los lactantes, así pues, la caseína proporciona tres nutrientes esenciales. Se pueden añadir grupos carboxilo adicionales a los residuos de Glu de algunas proteínas. Por ejemplo, la protrombina, proteína de la coagulación de la sangre, contiene varios residuos de 7- carboxiglutamato en su región amino-terminal. Estos grupos carboxilo fijan Ca2+, que es necesario para iniciar el mecanismo de coagulación. D. Unión de cadenas laterales de glúcidos. La unión de cadenas laterales de glúcidos es especialmente frecuente en proteínas con destino extracelular. La unión puede llevarse a cabo durante o después de la síntesis del polipéptido. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 18 E. Adición de grupos isoprenilo. Se forma un enlace tioéter entre el grupo isoprenilo y un residuo de Cys de la proteína. Los grupos isoprenilo proceden de intermediarios pirofosforilados de la ruta biosintética del colesterol, tales como el farnesil pirofosfato. Un ejemplo son las proteínas Ras, productos de los oncogenes y proto- oncogenes ras, y las proteínas G. El grupo isoprenilo sirve para anclar la proteína en una membrana. La actividad transformante (carcinogénica) del oncogén ras se pierde cuando se bloquea la isoprenilación de la proteína Ras, hecho que ha estimulado la búsqueda de inhibidores de esta ruta de modificación postraducción para su utilización en la quimioterapia del cáncer. F. Adición de grupos prostéticos. Muchas proteínas procarióticas y eucarióticas requieren para su actividad grupos prostéticos unidos covalentemente. Dos ejemplos son la molécula de biotina de la acetil-CoA- carboxilasa y el grupo hemo de la hemoglobina o del citocromo c. G. Modificación proteolítica. Consiste en transformar el polipéptido precursor grande e inactivo, en su forma proteolíticamente activa mediante un recorte proteolítico. Como ejemplos podemos mencionar la insulina, quimotripsinógeno y el tripsinógeno. H. Formación de puentes disulfuro. Son comunes en las proteínas eucarióticas destinadas a la exportación ya que ayudan a proteger la conformación nativa de la molécula de proteína frente a la desnaturalización en el medio extracelular, ya que éste puede diferir significativamente de las condiciones intracelulares y es generalmente oxidante. 3.- ALGUNAS PROTEÍNAS SUFREN UN PLEGAMIENTO ASISTIDO No todas las proteínas se pliegan espontáneamente a medida que se sintetizan en la célula. Para muchas proteínas el plegamiento está facilitado por la acción de proteínas especializadas. Las chaperonas moleculares son proteínas que interaccionan con polipéptidos parcial o incorrectamente plegados, facilitando rutas de plegamiento correctas o aportando BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 19 microentornos en los que pueda tener lugar el plegamiento. Se conocen bien dos clases de chaperonas moleculares. Ambas se localizan en organismos que van de bacterias a humanos. 3.1.- Chaperonas, también conocidas como “proteínas de choque térmico” (Hsp, heat shock proteins), interactúan con un polipéptido en varias etapas durante el proceso de plegamiento. Algunas chaperonas se unen a las regiones hidrófobas de un polipéptido extendido y son importantes para mantener la proteína desplegada hasta que finaliza su síntesis evitando la agregación inapropiada (p. ej. Hsp70). Las proteínas Hsp70 también bloquean el plegamiento de determinadas proteínas que deben permanecer desplegadas hasta que hayan sido traslocadas a través de la membrana. Algunas chaperonas también ayudan en el empaquetamiento cuaternario de proteínas oligoméricas. 3.2.- Chaperoninas, (p. ej. GroEL). Éstas constituyen elaborados complejos proteicos de tipo jaula, compuestos por dos anillos apilados, necesarios para el plegamiento de muchas proteínas celulares que no se pliegan espontáneamente. La proteína parcialmente plegada se introduce en la jaula, se une a la cavidad central mediante interacciones hidrofóbicas y estabilizan dichas regiones que tienden a agregarse en los polipéptidos emergentes, lo que evita el plegamiento prematuro. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 20 4. LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS ES INHIBIDA POR MUCHOS ANTIBIÓTICOS Y TOXINAS La síntesis de proteínas es una de las principales dianas de muchos antibióticos y toxinas naturales. Excepto en los casos especificados, estos antibióticos inhiben la síntesis de proteínas en las bacterias. Las diferencias entre la síntesis de proteínas bacteriana y eucariótica, si bien en algunos casos son sutiles, son suficientes para que la mayoría de estos compuestos sean relativamente inocuos para las células eucarióticas. La selección natural ha favorecido la evolución de compuestos que explotan pequeñas diferencias para actuar selectivamente sobre los sistemas bacterianos, de modo que estas armas bioquímicas son sintetizadas por algunos microorganismos y son extremadamente tóxicas para otros. Los antibióticos son herramientas muy valiosas en el estudio de la síntesis de proteínas, pues casi cada paso de la síntesis de proteínas puede ser inhibido especialmente por uno u otro antibiótico. 5. DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS Las proteínas defectuosas (por ejemplo, mal plegadas) o que están destinadas a un recambio rápido suelen estar marcadas para ser destruidas mediante ubiquitinación, se marcan por la unión de cadenas de una pequeña proteína, muy conservada, llamada ubiquitina. Las proteínas marcadas de esta manera son rápidamente degradadas por un componente celular conocido como proteosoma, que es un sistema proteolítico macromolecular, dependiente de ATP, localizado en el citosol. El proteosoma https://www.youtube.com/watch?v=_exc2c2VRKM 6. REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN La regulación a nivel de la traducción asume un papel más destacado en eucariotas que en procariotas. Cuando se quiere aumentar rápidamente la producción de una proteína, un ARNm que esté en el citoplasma reprimido traduccionalmente puede ser activado para que la traducción sea rápida. Esto es muy útil en genes muy largos, donde la transcripción y maduración BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 21 del ARNm puede requerir varias horas, en célula anucleadas, como reticulocitos (eritrocitos inmaduros) donde los ARNm están almacenados, y en algunas etapas del desarrollo embrionario. En eucariotas hay al menos 3 mecanismos para regular la traducción: 1. Los factores de inicio están sujetos a procesos de fosforilación por quinasas. Las formas fosforiladas son a menudo menos activas y provocan una depresión general de la traducción en la célula. 2. Uno de los mecanismos de regulación más importantes de la traducción en eucariotas se basa en la unión de represores traduccionales a sitios específicos de la región 3’ no traducida (3’ UTR) del ARNm. Estas proteínas interaccionan con factores de inicio o con el ribosoma para impedir o aminorar la traducción. 3. Proteínas de unión que impiden la interacción de los factores de iniciación. Cuando el crecimiento celular es lento, estas proteínas limitan la traducción uniéndose a uno de los factores de elongación (eIF4E, que normalmente interaccionaría con eIF4G). Cuando el crecimiento celular se reanuda en respuesta a un estímulo, las proteínas de unión se inactivan por fosforilación dependiente de quinasas La variedad de mecanismos de regulación traduccional proporciona gran flexibilidad, permitiendo la represión de solo algunos ARNm o la de toda la traducción celular. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 22 7.- SILENCIAMIENTO POSTRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES En eucariotas superiores se ha descubierto una clase de pequeños ARN, micro-ARN (miARN) que participan en el silenciamiento de determinados genes. Actúan interaccionando con los ARNm provocando su degradación o la inhibición de la traducción. En ambos casos, el ARNm, y por tanto los genes que lo producen, es silenciado. En eucariotas superiores se han identificado centenares de miARN diferentes. Se transcriben en forma de un ARN precursor que se corta con endonucleasas (la más conocida Dicer). Una de las hebras del miARN maduro se asocia con el ARNm diana provocando la inhibición de la traducción o su degradación. microRNA formation and function: https://www.youtube.com/watch?v= -9pROnSD-A BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 23 MAPA CONCEPTUAL DE LA SÍSTESIS DE PROTEÍNAS: BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 24  ACTIVIDAD BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS OBJETIVOS DE APRENDIZAJE 1.- Adquirir los conocimientos básicos sobre el proceso biológico de la síntesis de proteínas 2.- Conocer y comprender las características del código genético. 3.- Conocer la estructura y función de las moléculas y estructuras celulares que participan en la síntesis de proteínas. 4.- Comprender cada una de las etapas de síntesis y procesamiento de proteínas. METODOLOGÍA A. Los alumnos prepararán de forma individual el tema 9 “Biosíntesis de proteínas” utilizando el material publicado en BlackBoard y cualquier material bibliográfico que estimen conveniente. B. Posteriormente, contestarán a las siguientes preguntas como guía y ayuda para trabajar el contenido. No tienen que entregar las soluciones. EVALUACIÓN Esta materia se evaluará en los exámenes correspondientes. BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 26  Biosíntesis de proteínas Preguntas 1.- Anemia falciforme. En la hemoglobina de la anemia falciforme hay un residuo de Val en la posición 6 de la cadena β-globina, en lugar del residuo de Glu encontrado en esta posición en la hemoglobina A normal. ¿Puedes predecir qué cambio tuvo lugar en el codón del glutamato en el ADN que justifique su sustitución por valina? (0.5 puntos). 2.- The wobble phenomenon. ¿Cuál puede ser la consecuencia del balanceo de la tercera base en la interacción codón-anticodón? (0.5 puntos). A.- Un aminoacil-ARNt se puede unir a más de un codón. B.- Un codón puede unir más de un ARNt, todos ellos conteniendo el mismo aminoácido. C.- La síntesis de proteínas requiere menos de 61 moléculas de ARNts diferentes. D.- Todas son ciertas. 3.- Apolipoproteína B humana. La edición postranscripcional de este gen permite la síntesis de las formas hepáticas e intestinal de la misma, a partir de un único ARNm, por acción de una enzima citosina deaminasa intestinal, que provoca la transformación de un codón específico CAA en el triplete de finalización UAA, resultando así la forma corta intestinal de la proteína. Supón que el codón CAA fuera sustituido por otro que codifique el mismo aminoácido. ¿Cuál sería el efecto de la citosina deaminasa intestinal en este caso? (1 punto). 4.- Iniciación de la traducción en bacterias. Analiza la siguiente secuencia: UGUGAGGAGGGAGCGAAUGGUUGAGGCUAGGAGGUGCGUUUAUGGUACGC Escribe todas las secuencias de proteínas codificadas por este ARNm (ten en cuenta cómo se inicia la traducción en procariotas). (1 punto). 5.- Talasemia α. Puede producirse por mutación en el codón terminador de la cadena alfa de la globina, que cambia de UAA en posición 142 a CAA. ¿Cuál es el efecto sobre dicha cadena alfa? (1 punto). 6.- Talasemia β0. No se sintetiza la cadena β debido a una mutación en el codón 17 del gen, que transforma AAG (lisina) en el terminador UAG. Los péptidos obtenidos no tienen capacidad para constituirse como cadenas β funcionales y, en consecuencia, la globina α se acumula precipitando y alterando la membrana celular, provocando un síndrome hemolítico. ¿Cuál sería la consecuencia de introducir una mutación en el anticodón de un ARNt de forma que sea capaz de leer UAG e introducir lisina? (1 punto). 7.- El código genético es degenerado, pero los seres vivos utilizan algunos codones sinónimos más frecuentemente que otros. Recientemente, se ha descubierto que las levaduras utilizan una serie de codones en los genes relacionados con el crecimiento celular normal, mientras que utilizan otros codones sinónimos, los menos habituales, en los genes relacionados con la respuesta a estrés. Teniendo en cuenta las características del código genético, señale el BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 27 mecanismo con el que la levadura puede utilizar esta circunstancia para regular la expresión de los genes necesarios en cada situación. (1 punto). A- En condiciones de estrés, cada ARNt es capaz de leer más codones que en condiciones de crecimiento normal. B- En condiciones de estrés, cada codón puede codificar más de un aminoácido, para aumentar la variabilidad de las proteínas sintetizadas y poder responder al estrés. C- En condiciones de estrés, la célula expresa los ARNt capaces de leer los codones poco habituales, para aumentar la producción de proteínas relacionadas con la respuesta al estrés. D- En condiciones normales, los codones poco habituales son leídos por unos ARNt diferentes de los que se utilizan en condiciones de estrés, puesto que cada ARNt solo puede leer un codón. 8.- Completa la tabla de diferencias en traducción de eucariotas y procariotas. (1 punto). 9.- ¿Cuál de las diferencias anteriores permite que en procariotas los ARNm puedan ser traducidos antes de terminar su síntesis, mientras que en eucariotas eso es imposible? (1 punto). 10.- ¿Cuál de las diferencias anteriores permite que en procariotas los ARNm sean mayoritariamente policistrónicos, mientras que en eucariotas la gran mayoría son monocistrónicos? (1 punto). 11.- ¿Qué tipos de procesamiento post-traduccional sufre el colágeno para ser funcional? (1 punto). BIOQUÍMICA I. Dpto. de Medicina. UEM 28