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Regolazione dell’Espressione Genica I geni presenti in un genoma non sono sempre espressi (trascritti in RNA), ma possono essere accesi o spenti (trascritti o non in RNA) secondo necessità. Non sono tutti prodotti nello stesso momento e con le stesse quantità di messaggero. È vero che pa...

Regolazione dell’Espressione Genica I geni presenti in un genoma non sono sempre espressi (trascritti in RNA), ma possono essere accesi o spenti (trascritti o non in RNA) secondo necessità. Non sono tutti prodotti nello stesso momento e con le stesse quantità di messaggero. È vero che partiremo a parlare di RNA messaggeri, che conosciamo come trascritti per la produzione di proteine, ma parleremo anche di RNA regolatori che vengono trascritti ma non tradotti, anche RNA ribosomiale per esempio, il quale non deve essere tradotto in proteina. Gli organismi unicellulari rispondono a stimoli attivando o reprimendo l’espressione genica. Gli organismi pluricellulari hanno cellule con diverse funzioni nei diversi tessuti, hanno generalmente lo stesso genoma ma diverso trascrittoma. Un promotore forte produce molti RNA, anche in base alla risposta a stimoli da parte dell’ambiente, extracellulari. Molto RNAm significa aspettarci molta produzione di proteina, e viceversa. In laboratorio con la PCR si può definire quanto RNA messaggero viene prodotto. Non sempre questa relazione tra quantità di messaggero e proteina è corretto, perchè tutto dipende anche dalla regolazione post-trascrizionale. Per definire la quantità di proteina si usano invece delle tecniche biochimiche più complesse. PROCARIOTI Ci sono due tipi di proteine regolatrici, che legano generalmente il DNA in una porzione vicina o sul gene. ATTIVATORI = REGOLATORI POSITIVI. Un attivatore si lega e facilita la trascrizione, in assenza di questo ho pochissima trascrizione. REPRESSORI = REGOLATORI NEGATIVI. Lega l’operatore che si trova vicino al sito di inizio di trascrizione e non la attiva. Vedremo LAC che ha sia attivatore che espressore. La maggior parte delle proteine regolatrice agisce a livello dell’inizio della trascrizione, perchè ciò risulta energicamente favorevole, rivediamo allora alcuni concetti. INIZIO TRASCRIZIONE L’RNA polimerasi è formata da cinque subunità, beta e beta’ hanno il sito catalitico, le due subunità alpha hanno il carbossiterminale in grado di legare l’elemento UP che permette il passaggio da un complesso chiuso a un complesso aperto. Il fattore sigma è il fattore di inizio che riconosce sequenze specifiche e permette di formare con l’RNA polimerasi l’oloenzima che fa partire la trascrizione. Sigma si lega solo quando deve avvenire la trascrizione, sigma4 si lega al sito a -35, mentre sigma2 a -10.  Il REPRESSORE solitamente si lega all’operatore per far sì di impedire il legame con sigma70. Oppure possono inibire il passaggio da complesso chiuso a complesso aperto. L’ATTIVATORE li lega invece prima, dove a volte si trova l’elemento UP, e il legame porterà a interagire sopratutto con le subunità alpha delle polimerasi favorendo il legame. Oppure può agire con una funzione allosterica, andando a garantire la conformazione della RNApolimerasi per permettere la trascrizione con passaggio da complesso chiuso a complesso aperto. Se questo non avviene efficientemente avrò poca trascrizione, con l’attivatore viene favorito invece questo passaggio. Possono essere subito a monte o molto lontani, prevedendo così un ripiegamento del DNA. Intervengono proteine che facilitano questi ripiegamenti. OPERATORE LAC Quando c’è molto lattosio la cellula reagisce attivando la trascrizione di enzimi per il metabolismo del lattosio, e riduce invece quelli per il meccanismo del glucosio. Quando c’è molto glucosio invece sono aumentati gli enzimi per il metabolismo del glucosio e vengono abbassati quelli del lattosio (che altrimenti sarebbe scisso in glucosio e galattosio, ma del primo ce ne sono già abbastanza quantità) Il modello dell’ operone lattosio in Escherichia Coli è stato proposto grazie a Jacob e Monod, che per primi introducono il concetto di regolazione genica. L’OPERONE è un elemento genomico in cui sono presenti tre geni, produce trascritti policistronici: ß-galattosidasi = scinde in glucosio e galattosio => gene LacZ Lattosio permeasi = fornisce un canale al lattosio per entrare => gene lacY Tiogalattoside transacetilasi => gene lacA Repressore lac => gene lacI I geni sono sempre trascritti in corsivo, quelli umani sempre maiuscoli. Elemento trascrizionale di controllo FUNZIONAMENTO Il gene lacI trascrive e traduce la proteina repressore, che può legare l’operatore che si trova proprio dove si lega la RNApolimerasi. Se c’è lattosio questo si lega al repressone, ne cambia la conformazione cosicché non si possa più legare.  Per far avvenire la trascrizione è espresso un attivatore detto CAP. Questo è in grado di legare il cAMP e reclutare la polimerasi. Quando ci sono sia glucosio che lattosio nell’ambiente in realtà nè il repressore nè CAP legano il promotore, c’è dunque un po’ di trascrizione. Guardando poi la sequenza di -10 e -35 capiremo come mai avviene ma non è molto efficiente. Quando manca il lattosio e c’è solo il glucosio, il repressore non è sequstrato dal lattosio e questo blocca la trascrizione dei geni. Dato che c’è molto glucosio non è opportuno scindere il lattosio per ottenere altro glucosio. Quando manca il glucosio e vi è solo lattosio avrò il legame da parte di CAP ma non da parte del repressore. In tutto ciò il lattosio stesso è legato al cambiamento conformazionale dell’inbitore. Il canale di apertura per far entrare il lattosio è legato alla Adenilato Ciclasi, un enzima chiave per la produzione di AMP ciclico. Questi sono usati per regolare la segnalazione. Se c’è glucosio l’adenilato ciclasi è inibita, non si produce AMPciclico e non si lega CAP. Nel momento in cui non cè glucosio le molecole inibitorie sono modificate e non inibiscono adenilato ciclasi, aumenta AMPciclico che lega il CAP e in questo modo avviene la trascrizione per gli enzimi di scissione del lattosio. Dunque: Quando c’è il lattosio questo si lega al repressore non permettendogli di operare, ma sopratutto si attiva CAP con il legame con cAMP, permettendo di produrre molto RNA messaggero grazie all’attivatore. Le sequenze a -10 e -35 sono simili tra le sequenze consenso tipiche di sigma e quelle del promotore di lac, ma non sono uguali, ciò vuol dire che non sono ottimali, inoltre manca dell’elemento UP. Sigma si lega ma non in maniera forte, quindi si lega e si stacca in continuazione producendo poche molecole di RNA messaggero. È quindi un promotore debole in quanto non ha un consenso tra i migliori. Per questo per funzionare ha bisogno di un attivatore diventando un promotore forte. Le regioni di controllo dell’ operone lac contiene tre siti critici in cis. Si può identificate dove l’RNA polimerasi si lega ai promotori e di conseguenza mappare e capire come si lega il repressore: ovvero nella regione -10 del sito di trascrizione. COME FA CAP AD ATTIVARE LA TRASCRIZIONE? cAMP-CAP si lega a monte dove si lega la RNA polimerasi, c’è spazio per entrambi in modo che si tocchino nelle subunità alpha. Di fatto CAP ha nella sua sequenza una regione attivatrice che prende contatto con la polimerasi nel dominio carbossi-terminale, che si lega poi al DNA adiacente. COME SI LEGANO CAP E DNA? Spesso questi fattori regolatori nei batteri formano dei DIMERI. Dunque: Se ho un repressore si impedisce il legame dell’RNA polimerasi Se ho un attivatore si lega a monte dell’RNA polimerasi e ne favorisce la trascrizione Si è notato che vi sono due SEQUENZE RIPETUTE INVERTITE nell’operatore. da -10 a +10 si trova la sequenza di legame dell’ inibitore dell’operone lac. Può essere una sequenza consenso con mezzo sito da una parte e dall’altra, con sequenza identica. Ciò vuol dire che lacI quando interagisce con il DNA riesce a leggere la sequenza e a relazionarsi con essa, come i due domini di sigma70. La struttura delle proteine che legano il DNA è del tipo HTH (helix turn helix), si trova molto comune proprio nelle proteine che regolano l’espressione genica nei procarioti. Hanno un’alpha-elica perpendicolare al piano e si pone nel solco maggiore del DNA, con circa 22Å, inoltre viene nominata R, ovvero alfa-elica di riconoscimento. Instaura interazioni deboli con le basi.  La seconda alpha elica si dispone perpendicolarmente alla prima. Prende contatto con lo scheletro del DNA stabilizzando la struttura. Turn invece non ha particolari conformazioni. L’appaiamento fra basi forma due o tre legami a idrogeno. Nel momento in cui si generano queste interazioni la base purina o pirimidina ha però altri elementi che possono formare altri legami a idrogeno. I ricercatori hanno visto che per esempio: nell’appaiamento C-G nel solco maggiore, la G può fornire altri due donatori di H, mentre la C uno. nell’appaiamento A-T la A pul offrire un accettore di H, o un H donatore, la T invece un gruppo metilico, leggermente idrofobico. Quando l’alpha-elica è dunque inserita nel solco maggiore, si possono andare a formare altri legami con le basi azotate. Non viene mai rotto l’appaiamento di Watson e Crick quando si lega un fattore di trascrizione, MAI, vengono usati questi aminoacidi presenti nell’ alpha-elica per formare nuove interazioni. Non tutte le basi azotate sono impegnate nell’interazione con la proteina. Questo significa che nel consenso di interazione di un fattore di trascrizione, quelle molto conservate sono quelle che si legano, mentre le altre posono variare tanto non è ingaggiata in altri legami a idrogeno. Questo ci fa capire perchè si parla di sequenze consenso. Alcune basi variano da un promotore all’altro perché non vengono legate da un fattore di trascrizione. Lattosio presente -> l’alfa-elica riconosce il promotore e quando è presente lattosio la conformazione della molecola cambia per cui non sono più disponibili le alfa-eliche per il legame. Nasconde le alfa-eliche per l’interazione con il DNA (struttura chiusa). Oggi mezzo sito (” half-size”) lega un dimero. Lattosio assente -> espone le alfa- eliche per l’interazione con il DNA (struttura aperta). CAP-cAMP lega il DNA come dimero. I segnali dall’ambiente influenzano la conformazione dell’attivatore CAP. CAP è comune in vari promotori , è un fattore di tracrizione usato in molti operoni. Se infatti ci sono mutazioni in: 1) a carico della adenilato ciclasi (ATP - > cAMP) 2) a carico del gene che codifica per CAP causano la perdita simultanea della capacità di metabolizzare il lattosio, maltosio, galattosio e arabinosio. RIASSUMENDO Modello di Jacob e Monod: defini che l'espressione dei geni parte da siti specifici chiamati promotori posti all'inizio del gene. L'espressione può essere regolata da repressori o attivatori che agiscono tramite gli operatori. In vitro si usa IPTG e non lattosio. Inoltre il promotore è modificato con un promotore virale ricombinante T7 ibrido, con una parte virale e una con le sequenze necessarie per l’inizio del sito di trascrizione, RBS, ATG, il gene, infine TAA e una sequenza di U. ß-GALATTOIDASI Anche la ß-galattosidasi è un elemento inducibile attraverso l’utilizzo dell’operaio lac, in grado di convertire il lattosio in allolattosio una volta all’interno della cellula, è quest’ultimo che va ad interagire con il repressore lacI. Per vedere se è avvenuto il clonaggio si può rompere il gene della ß-galattosidasi, che contiene il sistema lac operator. Se è avvenuto il clonaggio correttamente il plasmide sarò intero e si avranno delle colonie di colore blu, altrimenti saranno bianche. L'enzima ß- galattosidasi è separato in due peptidi LacZalpha e LacZomega che da soli non sono attivi. Mediante complementazione genetica noi forniamo LacZalpha e possiamo ottenere un enzima attivo con la subunita LacOmega espressa dal batterio/lievito  C’è una distanza di 25 paia di basi da -10 a -35, che permette a sigma70 di legarsi e portare l’RNA polimerasi nel sito di trascrizione. PROMOTORE merT MerR e’ un attivatore che controlla l’espressione del gene merT che conferisce alla cellula la resistenza agli effetti tossici di ioni Hg nell’ambiente. In presenza di Hg, MerR si lega a una sequenza del DNA che sta fra la regione -10 e quella -35 del promotore di merT. Si è scoperto che al distasa tra -10 e -35 infatti non era ottimale, portando in questi punti non si sarebbe potuto legare sigma70 in contemporanea. MerR si lega al filamento opposto di quello dove si lega la polimerasi. Il promotore di merT e’ pero’ anomalo e presenta una distanza non ottimale fra le due regioni. Inoltre, il legame di MerT blocca il promotore in questa forma sfavorevole a legare la polimerasi. Il mercurio lega MerR e ne induce un cambiamento conformazionale: la conseguenza e’ che il DNA al centro del promotore ruota, esponendo il solco maggiore, rendendo il promotore addatto a legare sigma70 e quindi la polimerasi. FATTORI SIGMA Noi abbiamo parlato fino ad ora di sigma70, ma nei batteri ci sono vari fattori sigma, non solo la 70, che possono essere ingaggiate in situazioni diverse come shock termico, carenza di azoto, ecc. Sigma54 per esempio è regolata solamente da attivatori, che si attivano attraverso la fosforilazione, che legano regioni a -80 e -160 dal sito di inizio trascrizione. Gli attivatori funzionano poichè con ripiegamento del DNA, favorito da una proteina, gli attivatori prendono contatto con l’RNA polimerasi. Questa dunque si può legare al suo promotore utilizzando sigma54, ma in assenza di questi la trascrizione è poco efficiente. Quando si legano questi attivatori il DNA è ripiegato e inizia la trascrizione. Gene glnA = gene della glutammina sintetasi attivato in risposta a bassi livelli di azoto. NtrC interagendo con sigma54 attiva la polimerasi REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE DEI FAGI In laboratorio si è visto che la RNA polimerasi fagica è molto utilizzata. Nei batteri l’RNA polimerasi ha cinque subunità di base più sigma per il riconoscimento del promotore -10 e -35. Per gli eucarioti sono ancora più subunità, 5 o 12, dunque da riprodurre in laboratorio sono molto più complicate. La più semplice RNA polimerasi è quella fagica, per esempio del fago T3 e T7, perchè è composta da un’unica subunità, un’unica proteina, e riconosce in modo specifico solo la sequenza nucleotidi a dei promotori fagici. Inoltre i promotori sono forti, non hanno bisogno di attivatori. Nel momento in cui bisogna trascrivere in vitro si usano quelle fagiche, non batteriche o eucariotiche. Legano un sito singolo e breve. Il La RNA polimerasi del T7, ha alta processività, ha una forme simile a quella di una mano, ha il pollice, le dita, e riconosce una sequenza di 10/15 nucleotidi. Il pBluescript è uno dei vettori di clonaggio più semplici, non ha un promotore eucarioti o per far produrre proteine. È un vettore di clonaggio base che permette una selezione bianca/ blu nella crescita di colonie. Dallo schema si osserva: Il gene bla, resistenza alla penicillina, sito unico di clonaggio e origine di replicazione. Si osserva in blu lacZ,il peptide alpha traduce per la ß- galattosidasi, che complementa il peptide omega espresso di alcuni ceppi batterici modificati dai biotecnologi. Si hanno sempre ceppi specifici che non si trovano nell’ambiente. Questi promotori hanno il promotore T3 e T7 con sequenze molto brevi dove si lega l’RNA polimerasi fagica permettendo di ottenere RNA in vitro. In mezzo c’è il sito unico di clonaggio con esperimenti di base. Questo vettore è dunque molto semplice ma utile per esperimenti di base. FAGO LAMBDA Una volta dentro il batterio può scegliere di effettuare ciclo litico o lisogenico. Entra nel batterio e sceglie che ciclo effettuare. Inietta il suo materiale genetico nel batterio e può: replicare immediatamente utilizzando le RNA polimerasi batteriche, ma va a replicare le proteine del capside del fago e replica sopratutto il suo DNA. In questo modo si assemblano proteine del fago mette insieme in vitro per formare il capside, e se sono presenti le sequenze cos si possono riprodurre molecole di DNA, poi va a lisare la cellula. scegliere di integrare il suo genoma in quello dell’ospite. Questo può farlo quando sono presenti proteine repressori di lamda, quando si esprimono grandi concentrazioni di questa proteina portata dal fago stesso, questo integra il suo genoma. Rimane così integrato e viene trasmesso alle generazioni successive, a un certo punto può riattivarsi l’escissione del DNA fagico e riattivare il ciclo litico. Il fago lambda viene spesso usato per introdurre materiale in un batterio, e ci permette di accomodare frammenti più grandi rispetto ai plasmidi, possiamo poi introdurre ciclo litico o lisogenico. Il GENOMA del fago lambda, ha circa una 50ina di geni, ha due estremità cos coesive, pertanto è circolare e si richiude. A destra ci sono geni per la testa, per la coda, proteine di lisi per il batterio, dunque tutti i geni che servono per il ciclo litico per lisare la cellula. Sulla sinistra ci sono invece l’integrasi, att (per permettere l’integrazione), tutte le proteine per il ciclo lisogenico. Nella parte centrale avviene la decisione per quale ciclo effettuare. Per la regolazione si utilizza RNA dell’ospite, non fagica. Verranno attivati questi geni utilizzando RNA polbatterica. Si legano un repressore in -10 e -35 per impedire l’attacco dell’RNA pol e un attivatore che si lega a monte all’RNA polimerasi per favorire l’isomerizzazione. CI codifica per la proteina inibitrice del ciclo litico, che dunque favorisce il ciclo lisogenico. Cro è un repressore della trascrizione, entrambi sono proteine che sono in grado di legare il DNA Queste due proteine possono legare il DNA, sono del tipo Helix-Turn-Helix. Hanno dunque un dominio di legame del DNA simile a fattori dell’ operone Lac. Pl e Pr = Ci sono due promotori forti (con regioni -10 e -35 molto simili al consenso che favorisce il legame di alpha2 e alpha4 di sigma70. Dunque non necessitano di attivatori per iniziare la trascrizione). Prm è un promotore debole invece, è il Promoter for Repressor Mateniance, necessita di un attivatore.  COME IL FAGO DECIDE LA LISOGENIA? È una scelta legata ad alcune condizioni fisiologiche. PR è un promotore forte che va a trascrivere sopratutto un gene che si trova subito a valle (i batteri producono elementi policistronici) e viene prodotta una proteina che facilita l’espressione, che si lega a un sito e si lega a un altro promotore: PRE. Quest’ultimo serve a instaurare inizialmente l’espressione di CI e dunque dell’inibitore. Inizia a trascrivere. Se la freccia va a destra è usato il filamento inferiore come stampo e la sequenza è identica al filamento superiore, e viceversa. Il trascritto nella seconda immagine dunque ha sequenza rovesciata rispetto alla prima immagine. CI viene trascritto perchè ha AUG nel filamento inferiore, e andrà a produrre una proteina che si legherà a PRM. Dunque sia PR che PRM sono promotori deboli, il primo attivato grazie a CII e il secondo grazie a CI. CII è un iniziatore della trascrizione anche per iniziare la tracrizione della integrasi, così oltre ad attivare l’espressione dell’inibitore del ciclo litico attiva l’espressione dell’integrasi per legare il genoma fagico al batterico attivando il ciclo lisogenico. Il genoma fagico può integrarsi nel DNA del batterio tramite circolarizzazione grazie a cos. A una ventina di nucleotidi da attP c’è attB in grado di legare le integrasi, dunque il DNA del fago può integrarsi in quello del batterio lasciando due impronte att ai due lati, che potranno essere rilegate per poi scindere il DNA del fago una volta che si voglia riattivare il ciclo litico. È un’integrasi del tipo tirosina ricombinasi, ovvero 4 molecole che si legano nei siti att. 2 legano il filamento superiore e 2 il filamento inferiore. Tagliano non in contemporanea ma in successione. Quelle sul filamento superiore assumono una conformazione attiva e solo dopo la formazione della giunzione di holiday si attivano anche quelle inferiori. Abbiamo l’intermedio dell’enzima con la tirosina con l’OH con il fosfato, che va ad attaccare il fosfato del filamento opposto formando la giunzione di Holliday, si attivano le altre due integrarsi che formano un altro intermedio con ossidrile in 5’ che va ad attaccare il legame tirosina-fosfato. Avviene così l’integrazione del genoma del fago. Dunque dopo la produzione di queste proteine repressori si attiva l’altro promotore debole. Si ha un feedback loop positivo per mantenere il genoma fagico in uno stato lisogenico all’interno del genoma batterico. CI non è nè attivatore nè repressore, è entrambi. Ha sempre domini helix-turn- helix per legare il DNA. La maggior parte dei fattori che regolano l’espressione dei batteri formano dimeri, anche qui infatti c’è una regione di dimerizzazione. Può poi formare anche multimeri. La regione N-terminale vicino alla regione terminale del DNA, fa si di interagire con RNA polimerasi ed effettuare il passaggio da complesso chiuso ad aperto. Funziona un po’ come CAP. Non deve legare piccole molecole. È regolato dalla quantità. Da dx a sx trascritto Da sx a dx trascritto PR => promotore forte, ha una sequenza -10 e -35 e in mezzo ha OR1 un operatore in grado di legare fattori che regolano l’espressione nei batteri, ovvero Helix-Turn-Helix. Regola l’espressione di Cro. PRM => promotore debole che necessita di CI. Anche qui tra -10 e -35 c’è un OR3, che è in grado di legare fattori che interagiscono negativamente con il legame di sigma70 e RNA polimerasi. Infatti se si lega una proteina, questa interferirà con il legame dell’RNA polimerasi. Entrambi dunque hanno operatori che possono essere inibiti grazie al legame con dei fattori. Hanno sequenze molto diverse e legano fattori diversi. OR2 => Tra i due promotori c’è un terzo operatore. Questo permette di interagire con altre proteine che si possono legare dietro all’RNA polimerasi e funzionare da attivatori. CICLO LISOGENICO Il repressore di lamba CI, con dominio di legame al DNAe dominio di dimerizzazione, si lega con legame cooperativo all’operatore 1 e 2, non 3. Legandosi all’operatore 1 impedisce di trascrivere Cro, legandosi a 2 permette di legare RNA polimerasi. Se lega OR1 si comporta da repressore occupando il sito per trascrivere Cro e non permettendo di legare RNA pol. Se lega OR2 per feedback positivo va a legarsi a RNApolimerasi e permette la trascrizione da destra a sinistra. Man mano che si accumula CI sempre più se ne produce. La cellula si riempie di repressori e non si può attivare ciclo litico. La cellula mantiene così il DNA fagico integrato nel genoma. CICLO LITICO A una certo punto può attivarsi, è importante che non si accumuli troppo repressore dunque. Ci sono sistemi di feedback, infatti ci sono altri siti di legame per CI più lontani, che ripiegano la polimerasi che non può più trascrivere, con feedback negativo dunque. Si formano grandi complessi che occupano addirittura l’OR3. Il repressore dunque autoregola la sua concentrazione finemente con unattività inibitoria quando raggiunge alte concentrazioni. Per attivare il ciclo litico deve essere degradato il repressore, riducendo la sua concentrazione della cellula e attivare il promotore PR, forte, che non ha bisogno di attivatore. Nel momento in cui si libera la regione in cui era presente il repressore si può legare l’RNA polimerasi. Basta abbassare la concentrazione di repressore dunque. Inizia ad essere trascritto Cro, un fattore helix- turn-helix che lega l’operatore 3, impedendo che continui ad essere trascritta CI, dunque si blocca completamente e viene degradata. Non essendoci più CI la cellula può permettere il distacco del genoma del fago e gli enzimi per la lisi del batterio. Ci sono varie condizioni fisiologiche per le quali si disattiva CI. Ad esempio in risposta a dei danni al DNA, in cui RecA (fattore per la riparazione del DNA) degrada il repressore CI e riesce così ad attivare Pr e Cro. IN QUALI CONDIZIONI SI ATTIVA IL CICLO LITICO O LISOGENO? Se siamo in laboriatorio e si usa il fago lambda per portare all’interno del batterio il DNA, si può favorire un ciclo piuttosto che l’altro andando a scegliere le concentrazioni di fago che infettano le cellule. Se ho pochi fagi che infettano le cellule, il fago sa che ci sono molti batteri disponibili per altre infezioni => sceglie normalmente il ciclo litico. Infatti un fago per cellula per la trascrizione, prima espressione, regolata di CI è talmente poca che non è sufficiente per iniziare ad accumularsi ed inibire Cro. Immaginiamo di avere moltissimi fagi, se uccidessero tutte le cellule batteriche non avrebbero più ospiti da infettare => sceglie il ciclo lisogenico. Quando la cellula è infettata da più fagi si raggiunge un livello di CI per inattivare i geni del ciclo litico e attivando il lisogenico. Viene integrato il genoma nel batterio e si riproducono con esso. C’è interesse dunque da parte del parassita di mantenere in vita il proprio ospite per sopravvivere. Dal punto di vista molecolare è invece la concentrazione di CI che semplicemente non è abbastanza elevata in presenza di pochi fagi per attivare il ciclo lisogenico. Ci sono dei plasmidi che derivano dal fago in cui sono mantenuti alcuni di questi geni per effettuare ciclo litico o lisogenico in base alle necessità. EUCARIOTI Diversamente dal procarioti le cellule eucariotiche degli organismi multicelluari hanno relativamente pochi geni che sono regolati in maniera reversibile dalle condizioni ambientali (eccezione: S. cerevisiae, questo a volte si comporta più come i batteri ricevendo stimoli dall’ambiente esterno e regolando l’espressione in base a questi) Il controllo dell'espressione genica nelle cellule degli eucarioti multicellulari svolge un ruolo molto importante nella regolazione dello sviluppo e del differenziamento cellulare In fase di sviluppo embrionale la cellula si svilupperà in modo diverso. Ci sono cellule differenti in diversi tessuti che dunque espreimeranno solo pochi geni in ogni momento in maniera molto differente. Per poter legare RNA polimerasi a DNA, si è visto che sono necessari fattori generali della trascrizione. Il DNA genomico degli eucarioti è organizzato in forma di cromatina. I nucleosomi possono essere un impedimento al legame di attivatori o repressori e alla trascrizione e pertanto possono svolgere un ruolo regolatorio. La distanza tra i nucleosomi a volte è piccola e per far avvenire la trascrizione è necessario spostarli. Vedremo come si genera lo spazio necessario. ELEMENTI TIPICI DI UN PROMOTORE EUCARIOTICO C’è il sito di inizio di trascizione, la TATA box, a cui si lega TBP che fa parte di TFIID, a monte l’elemento bre. Si lega TFIID per inserire la RNA pol, fa infatti da ponte. Ci sono poi altri elementi a monte e a valle, sono elementi spesso presenti nei promotori. Anche i fattori DPE vengono legati da TFIID. Quest’ultimo è composto anche da TBP e da molte TAF in grado di legare DPE e altro in assenza di TATABox o in assenza di TBP, e molte altre funzioni. BRE che si trova a monte della TATABox lega TFIID. Quando sono andati ad analizzare vari promotori si è trovato nel 12% di promotori con TATABox, dunque non è sempre presente. TATA - less sono promotori senza TATAbox , sono più o meno 60-70%. Le TATABox sono più presenti in geni che devono sempre essere trascritti, ovvero housekeeping. Per geni più specifici, non house-keeping, sono più comuni invece i TATA-less. Inr Initiator può essere presente sia in promotori con che senza TATA. È caratterizzato da regioni ricche di pirimidine che vengono legate da varie TAF. Questo Inr lega TAF1 e TAF 2 (dette TAF250 e TAF150 => per il loro peso molecolare, si trovano nell’uomo ad esempio). Con o senza TATA viene comunque reclutato TFIID. Questo perchè TFIID è legato a TBP, e le TAF 1 e TAF2, fanno si che venga portato comunque al promotore per legare comunque l’iniziatore. Fondamentalmente TFIID viene dunque sempre comunque reclutato. DPE è un altro elemento che si trova comunemente nei promotori TATA-less all’interno della regione trascritta. Queste proteine servono per richiamare gli altri fattori generali della trascrizione e RNA polimerasi. Quando deve trascrivere e muovere RNApol poi questi vengono rilasciati, quindi non è un problema che siano a valle. Viene anch’esso contattato da TAF in TFIID in maniera cooperativa con lnr. Nei promotori DPE-dipendenti sia lnr sia DPE sono necessari e la spaziatura è fondamentale per legarli in contemporanea. Nei promotori in cui manca la TATAbox è fondamentale per stabilizzare. Il DPE è frequente quanto la TATA-box, in Drosophila : - 29% dei promotori hanno TATA-box ma non il DPE - 26% hanno un DPE ma non una TATA-box - 14% hanno un DPE + TATA-box => raro che siano insieme - 31% non hanno DPE o TATA-box DPE serve per legare TAF6 o TAF9 (nell’uomo indicate come TAF40 TAF60). TBP lega la TATAbox, poi TAF1 e TAF2 legano l’iniziatore. Nel caso in cui manchi la TATAbox c’è per esempio DPE, TFIID allora si lega comunque perchè ci sono TAF6 e TAF9 per legare l’iniziatore. PROMOTORE MINIMO - PROMOTORE BASALE => lega tutto l’apparato per la trascrizione. Ci sono elementi che legando RNA polimerasi diventano necessari per attivare o disattivare determinati geni. REGOLAZIONE CROMATINA C’è tutto un sistema di regolazione che va a regolare anche la struttura della cromatina, per esprimere solo geni in alcune cellule. In particolare dipende dalla presenza di elementi enancher o silencer, per rispettivamente attivare o silenziare l’espressione. Nei batteri tutto si trova molto vicino al sito di inizio di trascrizione. I repressori si legano tra -10 e -35 interferendo con sigma70, l’attivatore si trova invece subito a monte, non molto lontani dunque. Nei lieviti si ha il promotore basale, gli elementi regolatori possono essere anche più lontani, negli eucarioti infatti il DNA può essere ripiegato Nei mammiferi se il promotore minimo è il viola, avrò sia elementi vicini che molto lontani. Ci sono casi in cui effettivamente l’espressione di molti geni è molto lontana dall’inizio della trascrizione. Quando si parla di “molto lontani” ci sono casi in cui l’espressione è veramente MOLTO lontana. Ad esempio il GENE SONIC HEDGEHOG. È un piccolo gene con soli tre esoni. Nell’uomo si trova nel cromosoma 7 in q36, ovvero nel braccio lungo. È espresso solo in alcune cellule specifiche. Ha un’espressione molto particolare in quanto non si sono trovate regioni regolatorie per questo, nelle vicinanze del genoma. Questo gene regola il numero di dita e la separazione degli occhi. I medici analizzano proprio il genoma di una famiglia con dita in sovrannumero e trovano che la mutazione è avvenuta in un introne di un gene differente da sonic hedgehog. È una situazione particolare. Fenotipi che si osservano in pazienti forniscono ai ricercatori elementi per ricostruire i promotori di questi geni complessi. La cromatina nelle cellule che lo esprimono verrà molto ripiegata portando i fattori vicini. VIDEO => Chi si lega agli elementi promotoriali? Negli eucarioti la trascrizione inizia quando si legano i GTF così si può legare RNApol, deve essere attivata per aprire il DNA. Gli attivatori possono agire direttamente con TFIID. Altri si legano lontani ma nessuno si lega direttamente a RNApol ma al mediatore, che a sempre un’azione con la RNApol. I repressori possono interagire in modo competitivo coi mediatori, impedendo il legame dell’attivatore, o in altri punti. Alcuni attivatori e repressori vanno a modificare la struttura della cromatina, le code degli istoni sono modificate per impacchettare di più, in quanto per attivare l’espressione genica vanno spostati i nucleosomi. Le interazioni regolano l’espressione e la quantità di RNA prodotta per ogni gene. ATTIVATORE DELLA TRASCRIZIONE Il fattore di trascrizione è sempre composto da un dominio di legame al DNA, dimerizzato, ha poi delle regioni proteiche che separano il dominio di attivazione o represione. Queste regioni proteiche interagiscono con altri mediatori. I due domini sono normalmente ben separati, ma vicini. Non devono necessariamente essere nella stessa proteina, ci sono casi con fattori in grado di legare non DNA, ma proteine che non hanno il dominio di legame al DNA ma il dominio di attivazione. Mediante DNA ricombinante si possono prendere pezzi di una proteina, metterlo in frame (deve essere tutto ben in frame) con una TAG con un’altra e generare delle proteine chimeriche. Bisogna sempre progettare bene. Gli attivatori eucarotici (come anche molti di quelli procariotici) hanno regioni ben distinte per il legame al DNA e per l’ attivazione genica. Spesso queste attivita’ si trovano in domini proteici separati. Gal4 ad esempio e’ uno degli attivatori piu’ studiati nel lievito: esso controlla l’ espressione del gene GAL1 (enzima per il metabolismo del galattosio). I primi 150 AA hanno domini di legame del DNA in sequenze dette UAS, dal 147 AA a 768 c’è una regione proteica di link. Dopo c’è il dominio di attivazione della trascrizione. È un gene forte, grande. Ci sono elementi UAS ripetuti. Sono stati fatti due esperimenti per dimostrare che le due attivita’ siano distinte: nel primo, si e’ espresso un frammento di Gal4 che codificava solo per la regione legante il DNA. La proteina risultante legava normalmente il DNA ma non attivava l’ espressione genica. nel secondo esperimento, si e’ prodotto un gene ibrido codificante i tre quarti di Gal4 fusi al dominio di legame al DNA del repressore batterico LexA. Si e’ visto che questo polipeptide ibrido, anche se aveva una regione legante il DNA alternativa, svolgeva normalmente la funzione di attivazione. Questo dimostra quindi che non sia il dominio di legame al DNA quello a regolare l’ attività genica. Con galattosio si lega a UAS (upstream activating sequence), con 4 elementi di legame a GAL4, e aumenta fino a 1000 volte la trascrizione di GAL1.  Analisi Interazione Tra Proteine In questa lezione si trattano delle metodologie dell’interazione tra le proteine basate sui lieviti, in particolare Saccharomyces cerevisiae. Molte funzioni si basano sull’interazione delle proteine che interagiscono e si influenza l’una con l’altra (CDK e Cicline) => studiare l’interazione tra le proteine è molto importante e alla base delle tecniche in laboratorio. Per definire la funzione di una proteina è spesso utile identificare le altre proteine con le quale si associa per esplicare la sua funzione: Metodi genetici; I metodi di analisi delle proteine non vengono fatte quotidianamente nei lab di biologia molecolare, perché sono metodologie più impegnative, si basano sul lievito S. cerevisiae. => vedremo solo questi Metodi biochimici; Metodi che si basano su immagini (cfr. corso di biologia cellulare); SACCHAROMYCES CERVISAE È un organismo unicellulare, eucariotico, che cresce velocemente sia in colture liquide che in colture solide, come i batteri, formando colonie. Il suo genoma è stato tutto sequenziato e permettono di generare mutanti piuttosto facilmente, si può inserire DNA tramite trasformazione come nei batteri. DIPLOIDIA E AUXOTROFIA Si può sfruttare l’auxotrofia dei lieviti e il fatto che il lievito passi da una forma diploide, 2n forma aα, ad una forma aploide, n che può essere a o α. In condizione di stress il lievito, così come i funghi, effettua la meiosi (N.B. nell’uomo la meiosi avviene solo nelle cellule della linea germinale), quando rispondo agli stress ambientali generano dei gameti che spesso si incistano. I lieviti possono generare due tipi di gameti: 1. Gamete a 2. Gamete α I due gameti aploidi sono chiamati mating types. Mettendoli l’uno accanto all’altro, in assenza di stress cellulare, i due gameti aploidi si fondono e si ottiene un organismo diploide, i due aplotipi si fondono e tornano a formare un diploide. Sia le cellule dei gameti, a ed α, che la forma diploide del lievito possono essere propagate sia in un coltura liquida che su terreno solido Agar. Se si ha una mutazione nella forma aploide a ed una mutazione diversa nella forma aploide α, si ottiene una cellula diploide che contiene entrambe le mutazioni, si può sfruttare la fusione dei due mating types per inserire delle mutazioni in organismi diploidi. Auxotrofia = esistono dei ceppi mutanti del lievito che perdono i geni per degli enzimi che consentono di sintetizzare determinati aminoacidi. Tutti questi ceppi sono ben caratterizzati e possono essere selezionati in base alla loro abilità di metabolizzare o meno un certo antibiotico. Si può propagare la colonia del lievito, cresciuta su un terreno arricchito, in un terreno in cui è presente l’antibiotico oppure dove è assente un aminoacido tramite la tecnica del replica plating.  Inizialmente si ha un terreno di coltura che contiene istidina e poi una seconda a piastra in cui manca l’istidina. Con la tecnica di replica plating, si fa una copia delle colonie della prima piastra sulla seconda e poi si confrontano, in base alle coordinate. Se ci sono delle colonie mancanti, queste sono le colonie mutanti che non riescono a sintetizzare l’istidina. L’auxotrofia permette di usare dei terreni per la selezione. Nei batteri si sceglie la selezione con gli antibiotici, eventualmente fornendo un gene che gli conferisce la resistenza agli antibiotici, in questo caso il gene Bla per ampicillina. Nel caso dei lieviti auxotrofi, i lieviti mutanti possono crescere solo se nel terreno ci sono gli aminoacidi che non riescono a sintetizzare da soli. In questo caso si può fare crescere il lievito anche in assenza di triptofano se si fornisce, attraverso il DNA esogeno, un piccolo gene che porta con sé l’enzima per metabolizzare e generare il triptofano. Il gene si chiama con il nome dell’enzima che permette di sintetizzare, il gene è una regione codificante per un enzima che permette il metabolismo dell’aminoacido in questione. Un lievito mutante può crescere in un terreno che è arricchito con gli aminoacidi che non riesce a sintetizzare, ma non in terreno che ne è privo. Si possono selezionare i lieviti che hanno accolto la molecola di DNA esogeno con il gene per sintetizzare l’aminoacido necessario. Auxotrofia usata per selezionare le cellule che si sono trasformate, perché quando si cerca di fare entrare molecole di DNA si utilizzano delle metodologie che favoriscono l’entrata del DNA nella cellula, ciò nonostante, l’efficienza non è mai del 100%, anzi spesso è molto bassa, per cui sono necessari sistemi di selezione per ottenere una popolazione di cellule di trasformanti. MAPPA DEL PLASMIDE Questa è la mappa di un vettore per il clonaggio in lievito. I vettori e la clonazione nei lieviti passano comunque sempre attraverso l’amplificazione in E. Coli, come bioreattore per avere plasmide, infatti sono presenti i siti: ColE1 ampR Nel vettore è presente anche: Gene TRP1, per un enzima che consente il metabolismo di triptofano => il lievito sopravvive anche in assenza di triptofano perché viene espresso; GAL1, è un promotore molto forte per l’enzima GAL 1 che se indotto nel lievito aumenta l’espressione anche di 1000 volte: è molto efficiente. È spesso utilizzato perché, inserendo il plasmide di DNA nella cellula eucariota del lievito, è molto probabile che si esprima; Sito multiplo di clonaggio, attraverso questo sito può aggiungere una HA tag che permette di seguire la proteina; Origine di replicazione per gli eucarioti, Ori;dunque diversa da ColE1 vista finora. ATTIVAZIONE DELLA TRASCRIZIONE I metodi genetici si basano su questo concetto: per attivare l’espressione in eucarioti è necessario che ci sia un dominio di legame al DNA (giallo) adiacente al dominio di attivazione della trascrizione. Sono 2 domini che devono trovarsi uno accanto all’altro perché la proteina lega il DNA, l’enancher, che si trova al di fuori del promotore minimo, e il dominio di attivazione che negli eucarioti non va a legare in modo diretto la RNA polimerasi, come avviene nei procarioti, la proteina lega dei cofattori che possono essere il mediatore o TFIID (fattore chiave tra i fattori generali della trascrizione). Il dominio proteico di legame al DNA può essere in una proteina diversa rispetto a dove si trova il dominio di attivazione, l’importante è che poi siano portati l’uno vicino all’altro tramite dei ripiegamenti.  VALUTARE INTERAZIONE TRA PROTEINE Seguendo questo ultimo concetto per valutare l’interazione tra le proteine, se si vuole testare l’interazione tra la proteina X e una proteina Y, si generano due proteine che non esistono in natura, ricombinanti: una proteina X con un dominio di legame al DNA; una proteina Y con il dominio di attivazione del DNA; Se nel nucleo le due proteine interagiscono generano un fattore di trascrizione andando ad attivare l’espressione genica. Se non interagiscono non si attiva la trascrizione. In questo modo si valuta se c’è attivazione dell’espressione genica, come si fa a vedere se si è attivata l’espressione? Per fare ciò si utilizzano dei geni reporter ovvero piccoli geni di facile analisi in base ad un fenotipo. SISTEMA A DUE IBRIDI è un sistema che deriva da due proteine ibride, la proteina X ed la proteina Y : una che contiene il dominio di legame al DNA, X, ed una che contiene il dominio di attivazione della trascrizione, Y. Colloquialmente ricercatori chiamano le due proteine di cui si cerca di testare l’attivazione: ESCA, bait, la proteina con il dominio di attivazione => Y; PREDA, target, la proteina con il dominio di legame al DNA => X; Lo scopo è capire se le due proteine si legano in modo diretto l’una con l’altra: c’è interazione tra le due? Per questa analisi si utilizza un metodo genetico. Si generano due proteine ibride, utilizzando il DNA ricombinante (cfr. progettare il clonaggio di una proteina con la tag di istidine in frame) => si ottiene il cDNA della proteina X e lo si clona, togliendo il codone di STOP, in frame con un dominio di legame al DNA di un fattore di trascrizione ben caratterizzato. Si applica la stessa procedura con la proteina Y ma si inserisce il dominio di attivazione della trascrizione di un fattore di trascrizione ben noto e caratterizzato. La cornice di lettura delle proteine ha un ATG, non ha il codone di STOP qui ma continua la lettura codone dopo codone comprende il dominio di attivazione, alla fine ci sarà il codone di STOP. Se le due proteine interagiscono il dominio di legame al DNA, questo si troverà vicino al dominio di attivazione della trascrizione. È necessaria la presenza di un promotore che possa legare il dominio di legame al DNA e così si attiva l’espressione. I GENI REPORTER, permettono di rilevare un promotore o l’interazione, e nei lieviti sono: 1. Geni che condizionano la sopravvivenza del lievito, è un piccolo gene che permette di visualizzare l’interazione tra due proteine o l’attività del promotore => si inserisce il gene per l’enzima che sintetizza, ad esempio, la leucina. Il lievito in assenza di leucina non sopravviverà fin tanto che non c’è interazione tra Y ed X. Solo i lieviti dove le due proteine hanno interagito possono sopravvivere, grazie all’interazione si attiva il gene per la sintesi della leucina; 2. Geni della selezione bianco-blu: si fa esprimere la β-galattosidasi, in presenza di H-Gal, lo scinde formando un idolo di colore blu che pigmenta le colonie; IPOTESI: Proteina X interagisce in modo diretto legandosi alla proteina Y STRATEGIA GENETICA: Clono la proteina X come proteina di fusione con il dominio di interazione di un fattore di trascrizione con il suo promotore e la proteina Y come proteina di fusione con il dominio di attivazione di un fattore di trascrizione. COME SI RILEVA L’INTERAZIONE: Se il dominio di legame al DNA viene tenuto vicino al dominio di attivazione della trascrizione, quando il dominio di legame interagisce con il suo promotore di potrà attivare la trascrizione. Per valutare l’interazione tra X e Y si dovrà attivare la trascrizione di un gene che possa essere facilmente rilevato (reporter): in assenza di sua espressione la cellula muore o non cambia colore. Il gene reporter non si esprime in presenza del solo dominio di interazione con il DNA. Il gene reporter non si esprime in presenza del solo dominio di attivazione della trascrizione  È importante che da sola la proteina X non vada ad attivare l’espressione; quindi, si deve togliere il dominio di attivazione della trascrizione. La proteina Y, di conseguenza, non deve avere il dominio di legame al DNA altrimenti porta direttamente all’espressione. È importante controllare che le proteine non attivino loro stesse l’espressione. Se la proteina X interagisce con la proteina Y si hanno i due domini, di attivazione e di legame, vicini => il fattore di trascrizione utilizzato dai due geni è Gal4. I domini di attivazione della trascrizione interagiscono con alcune TAF. Viene trascritto un gene per la sopravvivenza ovvero di enzimi per la sintesi di alcuni aminoacidi. Per valutare la interazione tra X e Y si dovrà attivare la trascrizione di un gene che possa essere facilmente rilevato (reporter): in assenza di sua espressione la cellula muore. Uno dei sistemi a due ibridi utilizzato si basa sul fattore di trascrizione GAL4 che è caratterizzato molto bene caratterizzato. Il GAL4 ha i 147 primi aminoacidi che si legano alle sequenze UAS, più lontano gli aminoacidi da 768-881 legano il dominio di attivazione della trascrizione. Il dominio di interazione con il DNA di GAL4 riconosce le sequenze UAS sul DNA GAL4 è un fattore di trascrizione di lievito e quindi faccio gli esperimenti in lieviti difettivi per GAL4. GAL4 è molto adatto a fondere i suoi primi aminoacidi (giallo) con la proteina X (rossa) e gli ultimi con la proteina Y (blu). Il reporter scelto è GAL1-LacZ, è composto promotore di GAL1, dove si lega GAL4, fuso con LacZ gene per la β-galattosidasi. Come vado ad inserire tutti i componenti: PLASMIDI Con la clonazione si ottiene la proteina ibrida preda, X, una proteina ibrida esca, Y (c’è anche il sistema reporter). Tutto ciò si deve inserire in un ceppo di lieviti, si devono potere selezionare i lieviti che contengono tutti questi sistemi insieme. Nel DNA del plasmide X sono presenti: ATG la regione codificante della proteina X; i geni per la sintesi autonoma del triptofano => Se si toglie il triptofano dal terreno di coltura, sopravvivono solo i lieviti che hanno al loro interno il plasmide con il mini-gene per il triptofano. manca il codone di STOP; il dominio di legame con il DNA per GAl4. Il plasmide Y che manca sempre del codone di stop; I geni per la sintesi autonoma dell’istidina; Ci sono i codoni per la trascrizione di GAL 4; Il segnale di poliU; Per selezionare i lieviti che hanno introdotto si toglie l’aminoacido istidina del terreno di coltura. Il plasmide contiene il gene per la sintesi dell’istidina e quindi permette ai lieviti di sopravvivere. Si immagini di essere in laboratorio ed avere una linea di lieviti che contiene già all’interno: le sequenze UAS il promotore che lega GAL4; a valle il gene repoter, di sopravvivenza, per esempio la leucina (gene di sopravvivenza). Inserendo i due plasmidi nel lievito si ottengono lieviti trasformati e lieviti non trasformati. Togliendo l’istidina e il triptofano dal terreno, rimarranno solamente lieviti che hanno entrambi i plasmidi. Dato che alcune proteine potrebbero attivare la trascrizione di per sè, solitamente si utilizzano entrambi sistemi reporter per evitare gli artefatti sperimentali (sia sopravvivenza che selezione). I due geni reporter sono LacZ e il gene per leucina. Si hanno i lieviti trasformati con i plasmidi, per cui si può testare l’interazione tra le proteine; si toglie anche la leucina per ricercare i trasformanti e per vedere dove avviene l’interazione. Se non interagiscono Y ed X => non c’è trascrizione Se interagiscono Y ed X => c’è trascrizione Si prendono le piastre arricchite con X-Gal, per dare il substrato per formare l’indolo, qui si individuano 4 colonie blu. Sono tutte valide ovvero c’è l’interazione tra Y ed X ? Si controlla operando una replica plating sul terreno mancante di leucina. Una delle colonie non è presente, dunque solo 3 sono valide per analizare l’interazione. Se c’è una mutazione, ad esempio in alcune forme di cancro, per capire l’effetto della mutazione sulla proteina mutata nelle interazioni con altre molecole si può testare in questo modo, è un sistema molto sensibile. A volte l’interazione tra le proteine in vivo è molto transitoria, per cui si potrebbe generare le cellule mutanti di lievito e riscontrare che la preda e l’esca non si legano più perchè non rilevano più l’attivazione dei geni reporter. DUNQUE: Si può scegliere come selezionare per i lieviti che si sono trasformati, il gene istidina per la sopravvivenza oppure gene per LacZ, sono validi entrambi. Le proteine X e Y si legano alla DNA polimerasi ma le componenti del complesso di pre-inizio. UTILIZZI SISTEMA A DUE IBRIDI 1. Si può utilizzare conoscendo due proteine che si crede, si ipotizza, interagiscano in vivo ma di cui non si conoscono i domini proteici che intervengono direttamente; 2. Per costruire una rete d’interazione tra le proteine; 3. Identificare dei nuovi interattori di una proteina scoperta; SUBUNITÀ CHE INTERAGISCONO Si sta analizzando una proteina con vari domini proteici. Dominio proteico= parte della proteina con una specifica funzione, cci sono database che permettono di capire come domini con una certa struttura abbiano determinante funzioni. Nella proteina X che si vuole analizzare ci sono. una porzione alla ammino-terminale, denominata A; una porzione centrale, denominata B; una porzione al carbossi-terminale, denominata C; Come si capisce quali sono domini proteici della proteina X interagiscono con Y? Si generano delle proteine ibride che non contengono tutta la proteina ma un solo pezzo di essa. Attraverso la PCR, si possono generare delle proteine ibride partendo dal DNA ricombinate. La proteina X ibrida con il dominio A ottenuta non esiste in natura e contiene: ATG; il dominio A; Qui si ferma ed entra in frame: il DNA bonding domain. Con la proteina X ibrida con il dominio B si fa lo stesso, con la differenza che al cDNA che si clona, si aggiunge: una sequenza ATG che viene inserita in un contesto di Kozak; Non c’è il codone di STOP il tutto è messo in frame con il DNA bonding domain; L’ultimo esempio è quello della proteina ibrida X con il dominio C carbossi-terminale che va modificata di più: non presenta ATG per cui deve essere inserito con il primer della PCR; ha un codone di STOP e per toglierlo si disegna il primer della PCR che si lega prima dell’ultimo codone per farlo entrare in frame con il dominio di legame; Si ottiene così una proteina ibrida, ricombinante. Illustrazione dei passaggi: a. Si passa dal DNA ricombinante; b. Si fa il clonaggio; c. Avviene la ligazione nei batteri; d. I batteri sono bioreattori e producono molte molecole di DNA; e. Il DNA ottenuto lo si trasforma nei lieviti; Il plasmide dei lieviti ha all’interno l’origine di replicazione dei batteri e il gene per la resistenza all’ampicillina. Trasformando i lieviti separatamente con i 3 plasmidi e il plasmide che contiene la proteina Y ibrida con activation domain, si ottengono 3 tipi di lieviti trasformanti. Si testano i lieviti ricombinanti per capire quali domini della proteina ibrida X interagiscono con Y. Se in natura ad esempio Y interagisce con dominio C, in vitro ci si aspetta di trovare una situazione per cui solo quando Y è in presenza di C, si hanno i domini per i fattori per la trascrizione dei geni per sopravvivenza dei lieviti o per il colore blu. L’interazione solamente dei domini A e B con la proteina Y porta alla morte dei lieviti o alla crescita di colonie bianche, a seconda del metodo di selezione In questo modo confermo che Y 1 interagisce con X attraverso il dominio C. 2 3 COSTRUZIONE RETE DI INTERAZIONE PROTEINE Nella cellula spesso una proteina non interagisce solamente con una altra ma con un complesso proteico: si possono avere 4 proteine che formano un complesso, di queste si vorrebbe capire quali proteine interagiscono specificatamente con una proteina dello stesso, e capre come è conformato. È una domanda importante che può spiegare il funzionamento di un complesso proteico. Tecnicamente A dovrebbe interagire sempre con B e con D, ma non con C, perchè C interagisce solo con B; L’analisi dell’interazioni di una singola proteina con le altre sarebbe molto lunga, sarebbero molte analisi una alla volta, per cui si è sviluppato un sistema a due ibridi che permette di svolgerla in un unico esperimento. Si basa sul fatto che il leivito può essere cresciuto in vitro, è diploide ma forma un apolide. Si possono così fondere i due gameti a formare lo zigote. Dunque si generano nel replicare a, le proteine A-BD, B- BD, C-BD, D-BD. Si clonano tutte le proteine si un ceppo a, ottenendo 4 ibridi in cui tutti hanno un BD e le trasformo una ad una nel ceppo a. Ognuna andrà a produrre le proteine con il BD. Dall’altra parte si prende alpha e le proteine si trasformano fuse con AD, tutte quante. Si effettua un clonaggio di tutte e quattro le proteine che di cui si voleva studiare l’interazione con mating type α ed a. Si utilizza una piastra di Agar e si tracciano delle strisce orizzontali: ognuna con le cellule dell’aplotipo a con bounding domain. Successivamente si tracciano delle strisce verticali: ognuna con un tipo di mating type α con l’activation domain. Nei punti in cui le due righe si incontrano crescono i lieviti diploidi. Si piastra su un terreno in cui può sopravvivere solo il diploide, con la doppia selezione. Si può anche fare una selezione bianca-blu fornendo X- Gal, un analogo del galattosio che viene scisso dalla α- galattosidasi in un idolo blu. Si confrontano risultati con l’interazione pianificata, fornendo i due mating-type α ed a: Interazione aA-αA= il lievito non cresce e non è blu => la proteina A non interagisce con sé stessa; Interazione aB-αA= il lievito cresce ed è blu=> le due proteine interagiscono; Interazione aC-αA= il lievito non cresce e non è blu=> le due proteine non interagiscono; Interazione aD-αA= il lievito crecse ed è blu=> le due proteine interagiscono; Si può procedere in questo modo per l’analisi di tutti le altre interazioni possibili. Ci vogliono 2 gg per far crescere i lieviti. È in questo modo che si testa l’interazione delle proteine anche con sé stesse ma dentro aplotipi diverse, si può vedere se la proteina forma un dimero interagendo con se stessa. Le proteine ibride clonate nell’aplotipo a o nell’aplotipo α sono state tutte conservate: deposito con tantissime proteine su cui si sono testare interazioni. C’è stata una grande collaborazione fra i ricercatori, ottenendo un deposito per avere sempre le proteine da poter utilizzare e testare un’interazione.  RICERCA NUOVI INTERATTORI La differenza con gli altri metodi è che questa analisi non è volta alla conferma di un’ipotesi iniziale, ma serve per capire le interazioni stabilite da una proteina nuova di cui non si sa nulla. PROBLEMA : si è scoperta una nuova proteina e si vuole sapere con che cosa interagisce e come interagisce. Si deve generare una GENOTECA o library: Si utilizza la proteina trovata come esca, si clona il cdna con il DNA bounding domain di GAL 4 Si genera così l’esca il cui plasmide ha la proteina di interesse e GAL 4 , e si vanno a cercare le prede. Ci si può chiedere se la proteina d’interesse nel cervello interagisce con alcune proteine, ad esempio, dei neuroni; si prendono delle cellule celebrali e si estrae mRNA, mettendolo a contatto con una soluzione di guanidinio che denatura RNAsi. Successivamente si purifica RNA toto e tramite una colonna di separosio. Per il clonaggio è importante avere il cDNA perché si può maneggiare meglio, è una molecola molto stabile. Per ottenere il cDNA si effettua una retrotrascrizione, molecola ibrida di RNA e DNA. Si può utilizzare un primer con sequenza di tante T e si usa l’enzima trascrittasi inversa, una DNA polimerasi di origini retrovirale che utilizza come stampo RNA. Questa replica. Si degrada poi con gli alcali o con l’enzima RNAsi H, l’ RNA associato al DNA e si ottiene un cDNA a singolo filamento che è la copia del messaggero originale. Si utilizzano i geni delle proteine del cervello come preda. Si ha un miscuglio di tutti i cDNA dei geni espressi nel cervello che viene clonato a valle della GAL activation domain. Queste sono le prede. È un clonaggio un po’ causale perché non tutte le molecole entreranno in frame, alcune lo perderanno, ma poiché se ne generano milioni di molecole per 20000 geni, si ottiene comunque una genoteca. In questo modo si clona l’esca. Si controlla con SDS-PAGE, analisi proteine con elettroforesi. Si trasformano i lieviti che esprimono con la genoteca mettendoli in una piastra di selezione senza leucina. Si guarda quali sono sopravvissuti e poi si fa una replica plating sulla piastra contenente X-Gal, facendo la doppia selezione. Si conferma che c’è una possibile interazione tra le proteine. Come si fa a capire quale era il cDNA derivante dal cervello che produce le proteine con l’esca? Come è possibile purificare il DNA plasmidico episomico nei batteri è possibile farlo anche per i lieviti, dunque in modo semplice. Non si integra il DNA esogeno nell’ospite. Amplificando e sequenziandolo si capisce quale è la preda.