Bakterilerde Üreme - Kopya PDF

Bakterilerde Üreme 1  Bakteriler ortadan ikiye bölünerek çoğalırlar. Basit bir aseksüel üreme şekli görülür. Bakteriler uygun koşullarda türlerine özgü bir hızla ürerler. Örneğin; E. coli ~20 dakikada bir ikiye bölünür....

Bakterilerde Üreme 1  Bakteriler ortadan ikiye bölünerek çoğalırlar. Basit bir aseksüel üreme şekli görülür. Bakteriler uygun koşullarda türlerine özgü bir hızla ürerler. Örneğin; E. coli ~20 dakikada bir ikiye bölünür. 2 Koşulların uygunluğu devam ettikçe çoğalma da sürekli olur. 80 saat  7 x 1036 m3 (> dünya) Ancak laboratuvarlarda bakterilerin üretilmesi için kullanılan besiyerlerinde gıda maddeleri sınırlı olduğu için bakterilerin üremeleri de kısıtlanır. 3  İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan bakteriler kısa eksen boyunca ortadan ikiye bölünmek suretiyle ürerler. Bölünme çomak ve sarmal şekilli bakterilerde kısa eksen boyunca yuvarlak şekilli bakterilerde ise herhangi bir çap boyunca olmaktadır. Bölünen hücre birbirinden ayrılarak tam bağımsız hale gelirler veya birbirlerine bitişik olarak kalırlar. Örneğin; Streptokoklar, Stafilokoklar vb. Shiomi D, Niki H (2013). A mutation in the promoter region of zipA, a component of the divisome, suppresses the shape defect of RodZ-deficient cells. Microbiologyopen 2(5):798-810. 4  Bölünme başlamadan önce bakteri iki kardeş hücreye yetecek kadar enzimleri, organik ve inorganik maddeleri hazırlar ve biriktirir. Çomak ve sarmal şekilli bakterilerde hücrenin boyu uzayarak, hücre içindeki DNA ve bölünmesi gerekli kısımlar ikiye ayrılır. Kokların üreme sırasında boyları uzamaz. Bu sırada nükleoid mezozomlara bağlanarak replikasyona başlar. https://biologyreader.com/growth-curve-of-bacteria.html 5  Replikasyon tamamlanınca hücre duvarından içeri doğru ve karşılıklı olarak septum oluşur. Buna sitoplazmik zarda katılır ve septumlar uzayarak hücreyi ortadan ikiye böler. 6  Bakteriler in vitro koşullarda; Sıvı ortamda, Katı ortamda üretilirler. http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit2/control/mutate.html 7 https://blog.biomall.in/preparation-of-culture-media/ Sıvı Ortamda Üretme Bakteriler sıvı besiyerlerinde katı besiyerlerine oranla daha çabuk ürerler. Üreme hızı bakteri türüne özgü genetik bir karakter ancak besiyerinin bileşimi ve çevresel koşullarda etkilidir. Kendileri için uygun koşullar sağlanmış olan Antibiotic and chemotherapeutic enhanced three-dimensional printer filaments and constructs for bakteri topluluğundaki her hücre önce biomedical applications - Scientific Figure on ResearchGate. Available https://www.researchgate.net/figure/Bacterial-broth-cultures-containing-control-oil-coated-and- gentamicinladen-PLA_fig8_270703822 [accessed 12 Mar, 2020] from: beslenmeye başlar, belirli bir gelişme aşamasına ulaştıktan sonrada bölünerek çoğalır. 8  Bakteri topluluğunda oluşan her bölünmeye jenerasyon, İki generasyon arasında geçen süreye jenerasyon süresi denir. Her jenerasyon sonunda topluluktaki birey sayısı iki katı artar. Bakteriler, ikiye bölünmek suretiyle logaritmik bir üreme tarzı gösterirler. Örneğin; bir jenerasyon sonra 2, iki jenerasyon sonra 4, üç jenerasyon sonra 8, …….. n jenerasyon sonra 2n bakteri hücresi olur. Bakterilerde jenerasyon süresi değişiktir. Örneğin; E.coli’de 18-20 dakika S.aureus’da 27-30 dakika M.tuberculosis’de 14-15 saat 9 Jenerasyon Süresinin Hesaplanması G = jenerasyon süresi, T = saat veya dakika olarak zaman aralığı, A = başlangıçtaki bakteri sayısı, B = son bakteri sayısı N = jenerasyon sayısı, N = (logB-logA) / log2, N = T/G 10 Örnek Başlangıç inokülümü 1 x 103 CFU/mL bakteri, 12 saat, 37°C’de, 220 rpm’de inkübasyon, Süre sonunda bakteri sayısı 1 x 109 CFU/mL, Jenerasyon sayısı ve süresi kaçtır? (log2 = 0.3) N = (logB-logA) / log2 N = (9-3) / 0.3 N = 20 N = T/G, 20 = 12/G, G = 0.6 saat (36 dak) https://www.fishersci.com/shop/products/maxq-4450-benchtop- 11 orbital-shakers/p-4531143 Üreme dört dönemde (evrede) gerçekleşir. 12 Lag (Latent-Gizli) Fazı Bakterilerin besiyerine alışma dönemidir. Üreme olmadığı için sayıca artma olmadığı gibi uyum sağlayamayanların ölmesi nedeniyle sayıda azalmalar görülebilir. Bakteri metabolizması (enzimler, proteinler, RNA, vb üretilerek hacim veya kütle olarak büyüme ve metabolik aktivite artışı) hızlanır. 13 Lag (Latent-Gizli) Fazı (devam) Bu dönemin süresi; Bakteri türü, Besiyerinin bileşimine, Ekim yapılan hücre sayısına (aynı tür bir bakteriden uygun besiyerlerine ne kadar çok ekim yapılırsa latent dönem kısalır), Ekim yapılan kültürün eskiliğine (eski bir kültürden ekim yapılmışsa yaşlı hücrelerin metabolik aktiviteleri yavaş olacağı için bu dönem uzun sürer), Çevresel koşullara (pH, ısı, osmotik basınç, yüzey gerilimi, oksijen vs.) bağlı olarak değişir. Bakteriler bir önceki kültürün üreme döneminde alınmışsa ve koşullar aynıysa latent dönem oluşmaz. Bakteriler normal üremelerini sürdürürler. 14 Log (Logaritmik-Üreme) Fazı Bulundukları ortama alışan ve gerekli gıdaları yeterince alan bakteriler, hızlanan metabolizmaları sayesinde bölünerek çoğalmaya başlarlar. Üreme dönemi çok uzun sürmez. Birkaç saat sonra üreme yavaşlar. Neden yavaşlar?  Besiyerinde gıda ve enerjinin harcanarak azalmaya başlaması,  Metabolizma artıklarının ve toksik maddelerin birikmesi,  Ozmotik basınç ve yüzey geriliminin değişmesi,  O2 azalması,  pH’ın düşmesi, 15 Log (Logaritmik-Üreme) Fazı (devam) Bu fazda fizyolojik olarak çok aktif olan bakteriler, fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı çok duyarlıdırlar. 16 Durma (Plato) Fazı Bakterilerin ürediği sınırlı miktardaki sıvı ortamdaki bozulan optimal koşullar değişmediği veya düzeltilmediği takdirde, üreme giderek yavaşlar. Hücrelerin bölünmesi yavaşlamaya başlar, jenerayon süresi uzar. Ancak bölünme durmaz. Bakterinin üremesi için uygun koşullar değişmedikçe böyle devam eder. Bakteri topluluğu bir süre sayıca değişmeden kalır, sonra azalmaya başlar. Durma dönemi uzadıkça bakterilerin morfolojilerinde, kültürel özelliklerinde ve fizyolojik karakterlerinde bazı değişmeler meydana gelir. 17 Ölme Dönemi Durma dönemi değişmedikçe ortam koşulları çok uygunsuz hale geldiği için bakteriler ölmeye başlarlar. Ancak düşük düzeyde bölünen bakteriler de olduğu için canlılık eğrisi sıfıra ulaşmaz. 18 Katı Ortamda Üretme EFT 19 EFT 20  Uygun besiyeri, inkubasyon, koloni oluşumu, Kolonilerin rengi, kokusu, yapısı, şekli, büyüklüğü, parlaklığı, besi yerine yapışma durumu, hemoliz yapma özelliği, vb birçok özellikleri mikroorganizmalar arasında değişiklik EFT göstermekte olup bu özellikler mikroorganizmanın cinsine ve türüne bağlı olduğu gibi çeşitli çevresel koşullara da bağlı olabilir. EFT 21  Katı besiyerlerinde üreme sıvı besiyerlerine göre daha sınırlıdır. Neden?  Gıda diffüzyonunun güç olması,  Hücre içinde oluşan metabolik artıkların ve toksinlerin atılamayarak hücre içinde birikimi (dolayısıyla metabolizma bozulur ve üreme kısıtlanır),  Basınç nedeniyle koloninin alt yüzünde bulunan bakterilerde dejenerasyon görülebilir.  Çevrede gelişen koloniler nedeniyle beslenme alanı daralır.  Bakteriler birbirine bitişik durumda oldukları içinde üreme kısıtlanır. Ancak kenardakiler üreme şansına sahiptir.  İnkubasyon ısısı nedeniyle besiyerlerinden sürekli su kaybı, ortamın kurumasına ve diffuzyonun daha da zorlaşmasına neden olur. 22 Üremenin Ölçülmesi 23  1. Hacmin ölçülmesi; Belli bir süre sıvı besiyerinde üreyen m.o’lar, dibi konik ve taksimatlı santrifüj tüplerine alınarak kuvvetlice santrifüj edilir. Üstteki sıvı atıldıktan sonra, dipte kalan tortunun miktarı cm3 olarak değerlendirilir ve hacim olarak ölçüsü bulunur. 24 https://handling-solutions.eppendorf.com/sample-handling/centrifugation/safe-use-of-centrifuges/basics-in-centrifugation/ http://www.cureffi.org/2014/07/30/recombinant-prion-protein-rocky-mountain-style/ 2. Kuru ağırlık tayini; Santrifüj yardımı ile çöktürülen ve distile su ile birkaç kez yıkanan belli miktardaki kültürde bulunan m.o’lar, ısıya dayanıklı belli ağırlıktaki kaba konarak 120°C’de, 3 saat ısıtılır. Soğuduktan sonra tartılır. Ağırlığı sabit kalıncaya kadar ısıtma ve soğutma işlemine devam edilir. Böylece elde edilen ve değişmeyen ağırlık, mikropların kuru ağırlığını verir. Kuru ağırlığın miktarı, üremenin çokluğu veya popülasyonun miktarı ile ilişkilidir. 25 3. Yaş ağırlık tayini; Santrifüj yardımı ile çöktürülen ve distile su ile birkaç kez yıkanan tortu, ya tüple birlikte veya ayrı olarak tartılır. Bu suretle belli bir süre ve miktardaki kültürdeki bakteri ağırlığı saptanmış olur. 4. Total azot tayini; Bakteri içinde bulunan maddelerdeki nitrojen miktarının tayini duyarlı yöntemler arasında bulunmaktadır. Bu tür nitrojen miktarının bulunmasında mikro-Kjeldahl tekniğinden yararlanılır. 26  5. Bulanıklık (türbidite) tayini (Spektrofotometrik yöntem) https://www.laboratory-equipment.com/lambda-bio-spectrophotometers-perkinelmer.html 27 https://www.henryschein.com/us-en/Global.aspx (12.03.2020) Üremenin ölçülmesi (devam) 5. Sayma Yöntemi; Hücre sayımı 28 Üremenin ölçülmesi (devam) 5. Sayma Yöntemi (devam); Koloni Sayımı o Bir bakteri hücresi = bir koloni 29 30 31 Bakterilerin Üremelerine Etkili Faktörler 32  Bakteriler uygun koşullarda gelişirler. Koşulların değişmesi durumunda üreme yavaşlar ve durur. Düzeltilmediği sürece bakteri topluluğunda ölümler olur. 33 1. Sıcaklığın Etkisi Bakteriler beslenmeleri ve üremeleri sırasında, enzimlerin çalışması için, gerekli bir çevre sıcaklığına gereksinim duyarlar. Bu sıcaklık bakteri türüne özgü maksimal ve minimal sınırlar içindedir. Üremenin en iyi olduğu sıcaklık optimal sıcaklıktır. Patojen bakteriler için; optimal sıcaklık üzerinde yaşadıkları konakçının vücut ısısıdır. Ortalama sıcaklıkların altındaki ya da üstündeki sıcaklıklarda enzim çalışmaları azalır ve durur. 34 Psikrofil Bakteriler -5 ile +15°C arasında ürerler Bazı toprak ve deniz bakterileri, balıklar için patojen olan bazı bakteriler bu grupta yer alır. Gıda endüstrisi yönünden önemlidir. Buzdolabı ısısında (4°C) üreyerek gıdaların bozulmasına neden olurlar. 35 http://webbuild.knu.ac.kr/~app-mic/resources/lecture/functional%20biotechnology/chap3-microbial%20growth%20and%20metabolism.pdf Mezofil Bakteriler 20 ile 45°C arasında ürerler. İnsan ve hayvanlarda hastalık oluşturan bakteriler bu grupta yer alır. Termofil Bakteriler 50 ile 75°C arasında ürerler. Sıcak kükürtlü su kaynaklarının çevresinde, sütte, gübrede bulunurlar. Özel protein yapıları ve enzim mekanizmaları sayesinde yüksek ısıya karşın denatüre olmadan yaşayabilirler. 36 Sıcaklığın bakterilerin üremesi üzerine etkisi, YÜKSEK SICAKLIK ve DÜŞÜK SICAKLIK etkileri olarak 2 şekilde incelenir ; Yüksek Sıcaklık; Maksimal sınırı aşan sıcaklık, bakterilerin karakterine göre kısa ya da uzun bir sürede ölümlere neden olur. Örn; psikrofil bakteriler 30-35°C‘de, mezofil bakterilerin geneli 65°C‘de 20-30 dakikada, termofil bakteriler 80-90°C‘de ölürler. Sporlar da dahil tüm m.o’lar 121°C’de, 1.5 atm basınç altında 15-20 dak içinde ölürler (otoklav ile sterilizasyon aşaması). 37  Yüksek ısıda ölümler birçok faktörün etkisiyle olmaktadır; Bakteri türü; Vejetatif bakteriler, kapsüllü ve sporlu bakterilerden daha kısa sürede ölürler. Vejetatif bakteriler 60-65 °C ‘de 20-30 dakikada ölürler. Sporlu ve kapsüllü bakteriler daha dayanıklıdır. Bakteri sayısı: Kültürdeki yada ortamdaki bakteri sayısı artıkça, ölmeleri için geçen sürede artar. Sıcaklığın yüksek olması gerekir. 38 Besiyerinin bileşimi: Yağ, protein, mukoid sıvılar vs. içeren besiyerlerinde bakteriler daha geç ölürler. Besiyerinin viskozitesi arttıkça ısı iletme yeteneği azalır. pH: Bakteriler optimal pH’da ısıya dayanıklıdırlar. Üst ve alt pH sınırlarına yaklaştıkça ısıya dayanıklılık azalır. Nem: Nemli ısı, kuru ısıdan daha etkilidir. Otoklavda 121°C ölen bakteri sporları, Pasteur fırınında 150°C ‘de 1 saatte ölürler. 39 Düşük Sıcaklık; Bakteriler düşük sıcaklığa yüksek sıcaklıktan daha dayanıklıdırlar. Birçok bakteriler -80°C‘lerde uzun süre saklanabilirler. Bazıları -196°C‘de bile canlılıklarını sürdürürler. Bu sıcaklıklarda bir kısım bakteriler ölse bile bir kısmı canlı kalırlar ve yeniden uygun sıcaklık dereceleri sağlandığında üremelerini sürdürürler. Bakterileri daha iyi saklayabilmek için liyofilizasyon yapılır. Önce uygun bir sıvı ortama alınarak üretilir, küçük miktarlarda ampullere dağıtılır. Ampuller -40°C ‘de dondurulur, sonrada vakumda bırakılarak kurutulurlar. 40 2. Radyasyonun Etkisi UV, X ve Gama ışınları mutasyonlara yol açarlar ve bakteriler üzerine öldürücü etkileri vardır. Mikrobiyolojide bu ışınlardan sterilizasyon ve dezenfeksiyon amacıyla yararlanılmaktadır. UV ışınları; daha çok hastane odaları, doku kültürü odaları, aşı üretim odaları ve ilaç fabrikalarının laboratuvarları gibi oda atmosferlerinin ve bazı aletlerin sterilizasyonu için, 41 https://www.phonesoap.com/blogs/news/how-does-uv-light-kill-bacteria 2. Radyasyonun Etkisi X ve gama ışınları; yapay kalp kapakçıkları, katgüt, ipek dikiş iplikleri, kateter, plastik protezlerin sterilizasyonu için kullanılırlar. Pişmiş ya da çiğ halde ve uygun şekilde ambalajlanmış et ve et ürünlerinin uzun süre saklanması amacıyla da yararlanılır. Bu tip gıda maddeleri X veya gama ışınlarıyla sterilize edildikten sonra oda ısısında bile uzun süre saklanabilirler. 42 3. Yüzey Geriliminin Etkisi Besiyerlerinde bulunan gıda maddelerinin bakteriye girmesi ve bakteri içinde oluşan metabolitlerin dışarı atılması sitoplazmik membranın yarıgeçirgenlik özelliği ile olur. Metabolizmanın düzgün çalışması için bakterilerin içinde bulunduğu sıvı ile bakteri yüzeyi arasındaki gerilimin dengede bulunması gerekir. Bu denge bakteriye madde giriş çıkışını kolaylaştırır. Yüzey geriliminin artması durumunda; kuvvetli bir moleküler zar oluşması nedeniyle sıvı ortamdan bakteriye gıda maddesi girişi zor olur ve bakteri beslenemez. Yüzey geriliminin düşmesi durumunda; sıvı ile bakteri yüzeyinin birbirine teması sonucunda bakteri üzerine birçok madde yapışır ve buna bağlı olarak gıda alışverişi güçleşir. Sonuçta yine bakteri beslenemez. 43 4. Osmotik Basıncın Etkisi Ozmoz; aralarında yarı-geçirgen bir zar bulunan farklı yoğunluktaki iki sıvının bu zardan birbirine geçişidir. Bu geçiş her iki tarafın yoğunluğu eşit oluncaya kadar devam eder. Bakterilerin içinde üredikleri sıvı besiyerinin ozmotik basıncıyla kendi hücre içi ozmotik basınçları arasında bir denge vardır. Bu denge yarı-geçirgen bir zar olan sitoplazmik zar yardımıyla sağlanır. İzotonik ortam; bakterilerin iç basıncıyla üredikleri ortamda bulunan basınç arasında fark yoktur yada çok az farklılık vardır. 44  4. Osmotik Basıncın Etkisi Hipotonik ortam; bakteri ozmotik basıncı düşük bir ortamda bulunuyorsa-dışarıdan bakteri içerisine fazla miktarda su girer, hücre duvarı ve sitoplazmik zarın buna bağlı olarak çatlaması sonucu bakteri ölür (plazmoptiz). Bu olayda geri dönüş yoktur. Hipertonik ortam; bakteri ozmotik basıncı yüksek bir ortamda bulunuyorsa, bu kez bakteri içinden dış ortama fazla miktarda su çıkar, sitoplazmik zar hücre duvarından ayrılır ve sitoplazma ile birlikte büzülerek ortada toplanır (plazmoliz). Bu olayda bakteri hücresi ölmez ve koşullar normale dönerse bakteri de eski haline döner. 45 http://biologydiva.pbworks.com/w/page/24716699/Botany%20Chapter%203%20and%204 4. Osmotik Basıncın Etkisi Bazı halofil (tuz seven, halofilik) bakteriler ve deniz bakterileri yüksek ozmotik basınç ortamında yaşarlar. Böyle bakterilere ozmofilik bakteri de denir. 46 5. Nem Su, ortamdaki gıdaların bakteri içine girmesinde ve bakteri içinde oluşan metabolitlerin dışarı atılmasında önemli role sahiptir. Kültürlerdeki su kaybı bakterinin beslenmesi ve üremesini olumsuz yönde etkiler. Ayrıca bakteri içinde ozmotik basıncın artması sonucunda bulunan su miktarının (%70-90) azalması ölümlere yol açar. Bu nedenle bakterilerin üretildiği ortamlarda yeterli nem sağlanmalıdır. Etüvlere ağzı açık kaplarla su konularak besiyerlerindeki suyun eksilmesi önlenir. Buzdolaplarında uzun süre saklanacak bakteri kültürleri için de buharlaşmaya karşı önlem alınmalıdır. Bunun için kültürlerin bulunduğu kapların (tüp, petri) ağız yada kenarları parafinle kapatılarak, kültürlerdeki suyun buharlaşması önlenir. 47 6. pH Ortamın pH’ sı özellikle enzimatik etkinlikler için önemlidir. Her enzimin çalışabilmesi için ortalama pH sınırı vardır. Bakterilerin çoğu için en uygun pH: 7.0±0.2 Asidofilik bakteriler için pH: 1 – 3 Maya, küf ve laktobasiller için pH: 4 – 6 Vibrio cholerae, Mycoplasma pneumoniae pH: 8 – 9. pH ortamın sıcaklığının azalması ya da artmasına bağlı olarak değişir. Sıcaklık arttıkça aside, azaldıkça alkaliye doğru değişir. 48 7. Oksidasyon-Redüksiyon Potansiyeli (Eh) Eh; bakterilerin beslendikleri ortamda bulunan, elektron akımına bağlı güçtür. Elektronların bir maddeden diğerine geçişi, iki madde arasında potansiyel fark yaratır. Oksitleyici maddeler fazla e- verme gücünde olduğu için elektriksel potansiyelleri yüksek, İndirgeyici maddelerin elektriksel potansiyelleri düşüktür. Bir ortamda okside olan madde ile redükte olan maddelerin e- yoğunlukları eşitse o ortamda Eh sıfırdır. Oksidan maddelerin fazlalığında potansiyel yüksek; azlığında ise potansiyel düşüktür. 49  Anaerop bakteriler, oksidasyon-redüksiyon potansiyeli yükseldiği taktirde üreyemezler. Negatif oksidasyon-redüksiyon potansiyeline sahip (-0.2 volt gibi) yani fazla redükleyici dolayısıyla oksijen tutucu besiyerlerinde ürerler. Besiyerleri dışındaki ortamlar içinde aynı durum geçerlidir. Ör; Sağlam dokunun Eh’sı +12’dir. Bu nedenle sağlam doku anaerob bakterilerin üremesi için uygun değildir. Ancak parçalanmış ve içinde yabancı cisim, kan pıhtısı, nekrotik dokular bulunan yaralarda Eh düştüğü için anaerob bakterilerin üremesi için uygun koşullar oluşur. 50 8. Sonik ve Ultrasonik Titreşimler İnsan kulağının duyabileceği titreşimler 100-10.000 frekanslı titreşimlerdir. 100-10.000 frekanslar arası titreşimler sonik, 30.000-140.000 frekanslar arası titreşimler ultrasonik’tir. Bir sıvı içine konulan nikel levha elektromanyetik mekanizma ile titreştirilir ve elde edilen titreşimlere bakteriler değişik tepki gösterirler. Bazı bakteriler 9.000-10.000 sonik titreşimle birkaç dakikada parçalanır bazılarının ise parçalanması için daha yüksek titreşim gereklidir. Bu titreşimler sonucu hücre parçalanır, enzimatik işlevler durur, proteinler koagule olur. Bu titreşimlerden genellikle antijen elde etmek için yararlanılmaktadır. 51 9. Elektrik ve Elektroforez Sıvı kültürlerde uzun süreli elektrik akımı geçirilirse, ısının artması, pH değişikliği, gıda maddelerinin ayrışması sonucu bakteriler ölebilir. Sıvı ortamlarda bulunan bakteriler (süspansiyon halinde) NEGATİF elektrik yüklüdür. Bu sıvı ortamda sürekli elektrik akımı geçirilirse, bakteriler anota doğru göç ederler. Elektriğe bağlı bu göç olayına elektroforez denir. Elektroforezin bakterilere zarar verici önemli bir etkisi yoktur. 52 9. Oksijen Bakterilerin O2‘e olan gereksinimleri farklıdır. Bu nedenle bakteri türlerinin üremeleri için gerekli olan O2 ortamı sağlanmazsa üreme de olmaz. O2‘e olan gereksinimlerine göre bakteriler; 53