Aula Teórica 5 Microbiologia - Métodos de Controlo - PDF

MICROBIOLOGIA Aula teórica 5 Licenciatura em Farmácia 2024/2025 Sumário Métodos de controlo de crescimento de MO: Controlo físico Controlo de crescimento microbiano Os processo de esterilização e desinfeção permitem o controlo do desenvolvimento dos MO Métodos essenciais no...

MICROBIOLOGIA Aula teórica 5 Licenciatura em Farmácia 2024/2025 Sumário Métodos de controlo de crescimento de MO: Controlo físico Controlo de crescimento microbiano Os processo de esterilização e desinfeção permitem o controlo do desenvolvimento dos MO Métodos essenciais no tratamento e prevenção de infeções, na prevenção da contaminação de culturas microbianas puras e são componentes essenciais dos processos de produção nas indústrias farmacêutica e alimentar Controlo de crescimento microbiano Esterilização vs desinfeção Esterilização: completa destruição ou remoção total de todos os MO, quer patogénicos quer não patogénicos. Um objeto estéril está totalmente isento de MO viáveis, como bactérias, fungos e vírus, e esporos. Desinfeção: processo de diminuição ou eliminação de MO potencialmente patogénicos (exceto esporos) através do uso de um desinfetante para tratar uma superfície inerte ou uma substância – não há esterilidade completa Antissepsia: destruição, redução ou inibição de MO diretamente em tecidos vivos (pele e mucosas), prevenindo infeção ou sépsis – desinfetantes aplicados nos tecidos são designado antissépticos (geralmente menos agressivos e tóxicos do que os desinfetantes usados em superfícies inanimadas)  Controlo de crescimento microbiano 206 Fundamentals of Microbiology TABLE 7.1 Terminology Relating to the Control of Microbial Growth Definition Comments Sterilization Commercial Clostridium Sterilization botulinum Disinfection Antisepsis Degerming Sanitization The Rate of Microbial Death The presence of organic matter often inhibits the action of chemical antimicrobials. In hospitals, the presence of organic  The Rate of Microbial Death The presence of organic matter ofte chemical antimicrobials. In hospitals, LEARNING OBJECTIVE matter in blood, vomitus, or feces in Taxa de morte microbiana 7-2 of disinfectants. Microbes in surface b encased in the mucoid matrix (see pag biocides to reach effectively. Because When bacterial populations are heated or treated with anti- temperature-dependent chemical reacti Uma população microbiana não é morta instantaneamente quando exposta a um agente letal microbial chemicals, they usually die at a constant rate. For example, suppose a population of 1 million microbes has been somewhat better under warm condition The nature of the suspending med treated for 1 minute, and 90% of the population has died. We are Quando as populações bacterianas são sujeitas a temperatura ou tratadas com produtos químicos now left with 100,000 microbes. If the population is treated for heat treatment. Fats and proteins are es a medium rich in these substances pr antimicrobianos, geralmente morrem a um ritmo constante. another minute, 90% of those microbes die, and we are left with will then have a higher survival rate. H 10,000 survivors. In other words, for each minute the treatment more effective under acidic conditions. Por exemplo, se uma população de 1 milhão de MO for tratada durante 1 minuto e 90% da população is applied, 90% of the remaining population is killed (Table 7.2). Time of exposure. Chemical antimicrobia If the death curve is plotted logarithmically, the death rate is morrer, restam 100.000 MO. Se a população for tratada por mais um minuto, 90% destes MOexposure morrem e to affect more-resistant constant, as shown by the straight line in Figure 7.1a. microb restam 10 mil sobreviventes. Ou seja, a cada minuto de aplicação do tratamento, 90% da restante the discussion of equivalent treatments Several factors influence the effectiveness of antimicrobial treatments: Microbial characteristics. The concludin população morre. The number of microbes. The more microbes there are to begin chapter discusses how microbial char choice of chemical and physical contr Tempo de redução decimal (D) é o tempo necessáriowith, parathe longer it takes to eliminate the entire population matar 90% dos MO ou esporos numa amostra (Figure 7.1b). sob condições específicas – ajuda a determinar o Environmental tempo necessário para work influences. Most disinfectants eliminar somewhat uma quantidade CHECK YOUR UNDERSTANDING ✓ 7-2 significativa de um agente patogénico específicobetter e inawarm solutions. desenvolver diretrizes para processos de desinfeção em ambientes clínicos e laboratoriais TABLE 7.2 Microbial Exponential Death Rate: An Example Time (min) Deaths per Minute Number of Survivors Actions of Microbial C Agents 2 LEARNING OBJECTIVE 7-3 4 In this section, we examine the ways kill or inhibit microbes. 6 9 Agentes antimicrobianos Os agentes utilizados para destruir ou inibir o crescimento de MO podem ser de natureza física, química ou biológica. Vários fatores influenciam a eficácia dos tratamentos antimicrobianos: Número de MO na população – quanto mais MO existirem numa população, mais difícil será eliminá-los – requer uma dose maior ou uma exposição prolongada do agente microbiano para eliminar toda a população Temperatura – a maioria dos agentes antimicrobianos é mais eficaz a temperaturas mais elevadas, o aumento da temperatura acelera as reações químicas, promovendo a ação dos antimicrobianos Concentração ou dose do agente – geralmente doses mais elevadas resultam em ação mais rápida, um pequeno aumento da concentração leva a um aumento exponencial da eficácia, mas a partir de um certo ponto, os aumentos podem não aumentar muito a taxa de mortalidade; por vezes, um agente é mais eficaz em concentrações mais baixas. Por exemplo, o etanol a 70% é mais bactericida do que o etanol a 95% porque a atividade do etanol é aumentada pela presença de água; doses muito elevadas podem ser tóxicas para o paciente ou danificar superfícies Tempo de exposição – tempo insuficiente pode não permitir que o agente penetre adequadamente nas células ou material a ser esterilizado; os antimicrobianos químicos requerem frequentemente uma exposição prolongada para afetar alguns tipos de MO ou esporos mais resistentes; autoclave necessita de um tempo mínimo para garantir a esterilização eficaz Natureza do agente – o modo como um antimicrobiano ataca o MO e a especificidade (certos MO alvo como antibióticos específicos para bactérias ou com alvos mais amplos como desinfetantes) Agentes antimicrobianos Natureza do material a descontaminar e ambiente local – a atividade de alguns desinfetantes (ex. hipoclorito de sódio) é mais eficaz em pH ácido; a presença de matéria orgânica (ex. sangue, pus, fezes) pode proteger os MO dos agentes antimicrobianos, bloqueando o contato direto (acontece em biofilmes); ambiente rico em gorduras e proteínas protege os MO, que terão uma maior taxa de sobrevivência; viscosidade Mecanismos de resistência dos MO – adquiridos ou intrínsecos que lhes permitem sobreviver na presença de antimicrobianos (ex. produção de enzimas como as b-lactamases que inativam antibióticos b-lactâmicos) Composição da população e características específicas dos MO – a resistência natural de diferentes tipos e estádios de crescimento de MO varia consideravelmente: Esporos – extremamente resistentes ao calor, radiação UV e a muitos desinfetantes. A sua camada externa é composta por queratina, o que oferece proteção adicional, tornando-os particularmente difíceis de eliminar. Micobactérias – possuem uma parede celular rica em lípidos, incluindo ácidos micólicos, que formam uma barreira resistente à penetração de muitos agentes antimicrobianos e desinfetantes. Vírus – com invólucro são mais fáceis de inativar porque o invólucro lipídico é vulnerável à ação de detergentes e desinfetantes, os vírus sem invólucro são mais resistentes, pois a sua cápside proteica é mais difícil de penetrar. Fungos e protozoários podem ter níveis variados de resistência. Certas formas, como os cistos de protozoários, têm estruturas que aumentam a resistência a tratamentos químicos. Agentes antimicrobianos Composição da população e características específicas dos MO – a resistência natural de diferentes tipos e estádios de crescimento de MO varia consideravelmente: Biofilmes – comunidades organizadas dentro de uma matriz extracelular são muito mais resistentes, biofilme atua como uma barreira protetora dificultando o acesso do agente antimicrobiano As comunidades microbianas em biofilmes estão envoltas numa matriz extracelular protetora, composta por polissacarídeos, proteínas e ácidos nucleicos, que impede a penetração eficaz dos agentes antimicrobianos, dificultando a eliminação completa. Esta matriz torna os microrganismos até 1000 vezes mais resistentes aos desinfetantes. Fases de crescimento – MO na fase exponencial de crescimento são geralmente mais suscetíveis aos agentes antimicrobianos, uma vez que as suas funções metabólicas, como a síntese de proteínas e de DNA, estão mais ativas. Agentes que interferem com a síntese da parede celular ou com a replicação do DNA são mais eficazes nesta fase. Por outro lado, MO na fase estacionária ou latente têm um metabolismo mais lento e, por isso, apresentam maior resistência, tornando-se menos afetados por muitos antimicrobianos. Modos de ação dos agentes de controlo microbiano Alteração da permeabilidade da membrana A membrana plasmática é alvo de muitos agentes antimicrobianos – danos nos lípidos ou proteínas da membrana fazem com que o conteúdo celular seja libertado e interferem no crescimento da célula Lesão dos ácidos nucleicos Danos nos ácidos nucleicos por calor, radiação ou produtos químicos são frequentemente letais, a célula já não consegue replicar-se nem desempenhar funções metabólicas normais, como a síntese de proteínas Desnaturação das proteínas A quebra das ligações por pontes de hidrogénio ou das ligações covalentes por calor ou determinados químicos resulta na desnaturação da proteína Controlo físico antimicrobiano Calor O calor é o método físico mais utilizado para controlar o crescimento microbiano e esterilizar um objeto ou substância. A eficácia do calor como esterilizante é avaliada pelo tempo necessário para reduzir a população de MO em 90% sob condições específicas de temperatura - tempo de redução decimal (D). A resistência ao calor varia entre os diferentes MO; estas diferenças podem ser expressas através do conceito de ponto de morte térmica (TDP) – é a temperatura mais baixa à qual todos os MO de uma suspensão líquida específica serão mortos em 10 minutos. Tempo de morte térmica (TDT) – período mínimo de tempo para que todas as bactérias de uma cultura líquida específica sejam mortas a uma determinada temperatura. A morte pelo calor prossegue mais rapidamente à medida que a temperatura aumenta. O tipo de calor também é importante: o calor húmido tem um melhor poder de penetração do que o calor seco e, a uma determinada temperatura, inibe o crescimento ou mata as células mais rapidamente do que o calor seco. Controlo físico antimicrobiano Esterilização pelo calor seco Mata pelos efeitos da oxidação dos constituintes orgânicos da célula (lesões oxidativas) e a desnaturação e coagulação proteica Esterilização por ar quente – artigos a esterilizar por este procedimento são colocados no forno durante 1-2h a 180ºC; período mais longo e temperatura mais elevada (em relação ao calor húmido) são necessários porque o calor da água é mais facilmente transferido para um corpo frio do que o calor do ar. Utilizada na esterilização de material de vidro, objetos de metal e produtos não passíveis de esterilizar na autoclave como vaselina, gorduras, óleos e substâncias em póem que a % de água é muito pequena e não se deixam penetrar pela humidade Controlo físico antimicrobiano Esterilização pelo calor húmido O calor húmido mata os MO principalmente pela desnaturação e coagulação das proteínas, que é provocada pela quebra das ligações de hidrogénio que mantêm as proteínas na sua estrutura tridimensional e também causa a rutura das membranas celulares Fervura Mata formas vegetativas de agentes patogénicos bacterianos, muitos vírus e fungos e os seus esporos em cerca de 10 minutos a 100ºC Não é suficiente para destruir esporos bacterianos e alguns vírus. Por exemplo, alguns esporos bacterianos podem resistir à fervura durante mais de 20 horas. A maioria dos agentes patogénicos é eliminada – o uso da fervura para higienizar biberões de vidro é um exemplo familiar. Controlo físico antimicrobiano Esterilização pelo calor húmido A esterilização fiável com calor húmido requer temperaturas acima da água a ferver – são mais comummente atingidas por vapor sob pressão numa autoclave (121ºC, 15-30 min, 1 atm/15psi) – equipamento que utiliza vapor de água saturado a uma pressão e temperatura elevadas para matar MO O vapor é um agente eficaz para a transferência de calor e é capaz de penetrar nos materiais, atingindo as superfícies que precisam ser esterilizadas. O calor do vapor a altas temperaturas desnatura as proteínas e enzimas, resultando na alteração da estrutura e perda de função celular, levando à morte do MO. A pressão elevada aumenta a temperatura do vapor, tornando-o mais eficaz na esterilização, e impede a evaporação do vapor, permitindo que ele permaneça em contato com as superfícies dos materiais por mais tempo. Controlo físico antimicrobiano Esterilização pelo calor húmido O tempo de exposição ao vapor é crucial Autoclave para garantir a eficácia da esterilização. Um tempo de exposição comum é de 15 a 30 minutos a 121°C, dependendo do tipo e volume do material a ser esterilizado. O tempo suficiente permite que o calor penetre completamente nos materiais, alcançando todas as áreas. A autoclave é eficaz na eliminação de esporos bacterianos. A combinação de calor, pressão e tempo é suficiente para matar até mesmo os esporos mais resistentes, como os da Bacillus e Clostridium. Não é a pressão no interior da autoclave que mata os MO, mas sim as altas temperaturas atingidas quando o vapor é colocado sob pressão! Controlo físico antimicrobiano Pasteurização A pasteurização utiliza o calor húmido para reduzir significativamente, em vez de eliminar totalmente, os MO que se encontram nos líquidos, como o leite, cerveja, vinho, sem alteração das características organolépticas e/ou nutricionais Às temperaturas e tempos padronizados para a pasteurização dos produtos alimentares, todas as bactérias patogénicas conhecidas são mortas. 71ºC durante 15 seg. – processo HTST (high temperature short time) seguido de um rápido arrefecimento - Apesar de não esterilizar, diminui a carga microbiana global incluindo os MO não patogénicos que causam deterioração dos alimentos – a pasteurização aumenta a vida útil dos líquidos perecíveis. Muitas bactérias relativamente resistentes ao calor (termodúricas) sobrevivem à pasteurização, mas é pouco provável que causem doenças ou estraguem o leite refrigerado. 141ºC durante 2 seg. – processo UHT (ultra high temperature) seguido de rápido arrefecimento que esteriliza de facto os líquidos, de forma a que possam ser armazenados à temperatura ambiente em embalagens herméticas durante longos períodos de tempo sem haver deterioração Controlo físico antimicrobiano Frio O efeito das baixas temperaturas nos MO depende do MO específico e da intensidade da aplicação – mais utilizado para inibir o seu crescimento e metabolismo, não mata a maioria dos MO. Às temperaturas dos frigoríficos comuns (0–7°C), a taxa metabólica da maioria dos MO é tão reduzida que não conseguem reproduzir-se nem sintetizar toxinas – efeito bacteriostático da refrigeração Os psicrotróficos crescem lentamente a temperaturas de refrigeração e alteram a aparência e o sabor dos alimentos com o tempo – ex. um único MO que se reproduzisse apenas três vezes por dia atingiria uma população de mais de 2 milhões numa semana. As bactérias patogénicas geralmente não crescem a temperaturas de refrigeração – Listeria monocytogenes é uma exceção importante Congelar de forma lenta é mais prejudicial para as bactérias – pode interromper o crescimento microbiano ao cristalizar a água no interior das células dos MO, danificando as suas membranas e estruturas internas. Muitos MO, incluindo bactérias e fungos, podem sobreviver à congelação em estado latente e voltar a crescer quando são descongelados, desde que as condições sejam favoráveis. Muitos parasitas eucarióticos, como as lombrigas que causam a triquinelose humana, são mortos se mantidos durante vários dias a temperaturas de congelação. Controlo físico antimicrobiano Radiação A radiação tem vários efeitos nas células, dependendo do comprimento de onda, intensidade e duração. Podem utilizar-se, com ação esterilizante, dois tipos de radiação: ionizante e não ionizante Radiação ultravioleta (UV) Raios gama e raios X CHAPTER 7 The Control of Microbial Growth 213 1m 10–5 nm 10–3 nm 1 nm 103 nm 106 nm (109 nm) 103 m Gamma X rays UV Infrared Microwaves Radio waves rays Ultraviolet (UV) light Visible light UV in sunlight Tanning Bactericidal 200 nm 250 nm 300 nm 350 nm 400 nm 450 nm 500 nm 550 nm 600 nm 650 nm 700 nm 750 nm 280 nm 295 nm 330 nm Wavelength increases Energy increases  Controlo físico antimicrobiano Radiação A radiação ionizante – raios gama, raios-X e feixes de eletrões de alta energia – penetra profundamente nos objetos, tem um comprimento de onda inferior ao da radiação não ionizante e, por isso, carrega muito mais energia. Pode causar danos diretos no DNA dos MO, como quebra das cadeias de DNA e mutações, e gerar radicais livres altamente reativos que podem reagir com proteínas, lípidos e ácidos nucleicos, resultando em mais destruição celular Destruir os esporos bacterianos é mais difícil do que matar as células vegetativas; nem sempre é eficaz contra os vírus, são mais difíceis de eliminar do que as bactérias. Esterilização de fármacos, soro, vacinas, material médico e superfícies, alguns alimentos Controlo físico antimicrobiano Radiação A radiação não ionizante – radiação ultravioleta (UV) de cerca de 260 nm é bastante letal – comprimento de onda absorvido pelo DNA Causa dano no DNA das células expostas ao formar dímeros de timina (ligações anormais entre duas bases de timina adjacentes no DNA), que interferem com a replicação do DNA durante a divisão celular O efeito é mais superficial, atingindo apenas superfícies expostas diretamente à radiação UV – pouca ou nenhuma penetração em materiais densos ou líquidos MO têm que estar diretamente expostos aos raios Desinfeção de superfícies, ar, água, ambientes hospitalares ou laboratórios e injetáveis Controlo físico antimicrobiano Filtração A filtração é uma forma de reduzir a população microbiana em soluções de materiais sensíveis ao calor, como vitaminas, soro, plasma, etc., que podem ser danificadas por temperaturas elevadas como as usadas na autoclave Baseia-se na separação física, em vez de utilizar calor ou agentes químicos. Utiliza filtros com poros suficientemente pequenos (desde 0,01 a 0,45 μm) para reter MO, como bactérias, e, em alguns casos, até vírus, permitindo que o líquido passe através do filtro Pode ser utilizada para esterilizar vários líquidos e gases (incluindo o ar), como meios de cultura, enzimas, vacinas, antibióticos Filtros de membrana compostos por acetato de celulose Filtros HEPA – filtração do ar ambiental, retêm 99,9% das partículas contidas no ar que os atravessa Este processo difere dos outros métodos de esterilização porque não envolve a destruição de microrganismos, mas sim a sua remoção através da passagem por filtros sintéticos, granulares ou fibrosos. TABLE 7.5 Physical Methods Used to Control Microbial Growth Methods Mechanism of Action Comment Heat Filtration Cold High Pressure Desiccation Osmotic Pressure Radiation