Aula Teórica 4 Microbiologia - Pesquisa e Identificação - Licenciatura em Farmácia 2024/2025 PDF

MICROBIOLOGIA Aula teórica 4 Licenciatura em Farmácia 2024/2025 Sumário Pesquisa e identificação de MO: Testes bioquímicos Testes serológicos Métodos de Biologia Molecular Testes bioquímicos Recorre-se a uma série de provas bioquímicas que avaliam as propriedades metab...

MICROBIOLOGIA Aula teórica 4 Licenciatura em Farmácia 2024/2025 Sumário Pesquisa e identificação de MO: Testes bioquímicos Testes serológicos Métodos de Biologia Molecular Testes bioquímicos Recorre-se a uma série de provas bioquímicas que avaliam as propriedades metabólicas do MO. Baseia-se no reconhecimento da presença de algumas enzimas e/ou produtos de MO Devem ser utilizadas apenas culturas puras e jovens (24-48h). Deve ser avaliada a presença ou ausência de crescimento antes de classificar uma reação como positiva ou negativa. Algumas enzimas ou produtos podem ser Observados diretamente no meio primário de cultura ou Pesquisados por testes rápidos executados em colónias selecionadas Testes bioquímicos Propriedades avaliadas diretamente no meio Agar sangue – atividade hemolítica α-hemólise, hemólise incompleta: halo de cor esverdeada em agar de sangue (glóbulos vermelhos permanecem intactos, mas ocorre Agar MacConkey – fermentação da lactose conversão de hemoglobina em biliverdina), p.e. S. pneumoniae β-hemólise, hemólise completa: halo transparente em redor da colónia em meio agar de sangue, p.e. Streptococcus pyogenes γ-hemólise, sem hemólise: sem halo, p.e. Streptococcus viridans ou Enterococcus spp Testes bioquímicos Propriedades avaliadas diretamente no meio Meio TSI – Triple Sugar Iron A B C D E Utilizados para averiguar as capacidades metabólicas individuais: - Fermentação de açúcares - Produção de H2S (ácido sulfídrico) - Produção de gás Possui glicose, lactose e sacarose, peptonas Tem sulfato de ferro, que reage com o H2S formando um precipitado negro A – Sem fermentação ou produção de H2S B – Apenas fermentação da glicose Indicador de pH: vermelho fenol C – Fermentação da glicose e produção H2S D – Fermentação da glicose e lactose/sacarose - Amarelo em pH ácido E – Fermentação da glicose e lactose/sacarose e produção H2S - Vermelho escuro em pH alcalino Testes bioquímicos Propriedades avaliadas diretamente no meio Meio SIM – Sulfeto-Indol-Motilidade Utilizado para a diferenciação de microrganismos com base na produção de H2S e indol e avaliação da motilidade. Móvel Imóvel A natureza semi-sólida deste meio facilita a O crescimento centrífugo em relação à movimentação das bactérias e permite uma fácil picada é típico de organismos móveis determinação visual da motilidade que aparece como um crescimento que se prolonga a partir do ponto original de inoculação. A B C D E Produção de indol – cor rosa (ex. E.coli, Proteus spp. mas não P. mirabilis e P penneri) A. Escherichia coli – móvel, indol positivo, H2S negativo B. Staphylococcus aureus – imóvel indol negativo, H2S negativo C. Salmonella arizonae – móvel, indol negativo, H2S positivo D. Enterobacter aerogenes – móvel, indol negativo, H2S negativo E. Proteus vulgaris – móvel, indol positivo, H2S positivo Testes bioquímicos Propriedades avaliadas diretamente no meio Staphylococcus aureus Teste da DNase Staphylococcus aureus produz DNase, diferenciando-se dos restantes. Presença de DNase avaliada através do crescimento em meio de cultura contendo DNA (DNase Agar) e posterior reação com HCl 1N: - DNA precipita formando zonas opacas - DNA degradado origina um halo transparente à volta da zona de inóculo  Testes bioquímicos Propriedades avaliadas em colónias isoladas Teste da catalase: pesquisa da enzima catalase Positivos ➜ Staphylococcus spp. e a maioria dos aeróbios Negativos ➜ Géneros Streptococcus, Enterococcus e microrganismos anaeróbios Durante a respiração aeróbia os MO reduzem o oxigénio com formação de peróxido de hidrogénio (H2O2) ou superóxido (O2-) Caso este se acumule na célula, terá uma ação oxidativa fatal – agentes oxidantes muito tóxicos que destroem os constituintes celulares muito rapidamente Algumas bactérias possuem a enzima catalase, que degrada o peróxido em água + oxigénio: Staphylococcus A maioria dos aeróbios Bactérias desprovidas de catalase possuem superóxido dismutase Os géneros Streptococcus, Enterococcus e organismos anaeróbios são catalase-negativos Testes bioquímicos Propriedades avaliadas em colónias isoladas Teste da oxidase Os organismos oxidase-positivos possuem as enzimas Citocromo Oxidase Indofenol Oxidase Ambas catalisam o transporte de eletrões de um dador (NADH) para um recetor (geralmente O2) O teste utiliza um recetor artificial para os eletrões Dihidrocloreto de tetrametil-p-fenilalanin A oxidação do reagente origina o aparecimento da coloração azul-arroxeada A prova da oxidase pode ser utilizada para distinguir, entre outras: Enterobactereaceae (O-) Pseudomonaceae (O+) A – Pseudomonas aeruginosa B – E.coli Testes bioquímicos Propriedades avaliadas em colónias isoladas Teste da Coagulase A coagulase converte o fibrinogénio em fibrina A formação da rede de fibrina envolve as bactérias, favorecendo a sua permanência no meio e protegendo-as da ação fagolítica dos macrófagos A prova da coagulase é utilizada para identificar microrganismos do género Staphylococcus, nomeadamente para distinguir entre estirpes patogénicas (S.aureus, S. intermedius, S. pseudointermedius e S. hyicus) de não patogénicas (S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, etc). Teste da coagulase em lâmina As espécies coagulase negativa são geralmente consideradas de menor importância, embora possam funcionar como patogénicos oportunistas Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Negativo Positivo Testes bioquímicos Metodologia API – automatic profile index Método eficaz para a identificação de diversos tipos de bactérias, com base nas suas capacidades bioquímicas Existem vários espectros de identificação possível O API 20E compõe-se de uma série de 20 reações que permitem a identificação, após inoculação e incubação, da maioria das entreobactereaceae e organismos relacionados (outros bacilos Gram- negativos) Apresenta-se na forma de uma tira com 20 pocilhos, no interior dos quais se encontram meios liofilizados, que serão re-hidratados com a suspensão bacteriana Mudanças de coloração indicam reações positivas Os resultados dos pocilhos são convertidos numa chave numérica  Testes bioquímicos Biochemical Testing The presence Metodologia API – automatic profileofindex various enzymes is used in identifying microorganisms. Chaves dicotómicas Uma chave dicotómica pode incorporar informações de uma variedade de métodos de identificação para identificar bactérias. Chaves dicotómicas Uma chave dicotómica pode incorporar informações de uma variedade de métodos de identificação para identificar bactérias.  Serological Tests Testes serológicos Caracterização antigénica Reações de MO com anticorpos específicos, isto é, anticorpos que reagem especificamente com o antigénio que se pesquisa – podem diferenciar espécies microbianas e variantes dentro da mesma espécie Estirpes com diferentes antigénios são designadas como serovares ou serótipos Reactions of microorganisms with specific antibodies Testes serológicos Aglutinação Reação entre anticorpo e antigénio que resulta na formação de aglomerados visíveis Pode ser realizada em tubo, placas ou lâminas Serological Tests: Agglutination Método rápido, altamente específico e razoavelmente sensível Identificação de isolados clínicos de Staphylococcus aureus através de partículas (beads) de latex revestidas com anticorpos para a proteína A e para factor de aglutinação – duas proteínas encontradas exclusivamente na superfície de Staphylococcus aureus Outros ensaios disponíveis comercialmente para identificar Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae, E. coli O157:H7 e Candida albicans Testes serológicos ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Enzimas ligadas a antigénios ou anticorpos incluem peroxidases, fosfatase alcalina, b-galactosidase que interagem com substratos específicos para formar produtos coloridos que podem ser detetados até em pequenas quantidades ELISA direta – deteta antigénios de MO em amostras de pacientes ELISA indireta – deteta anticorpos contra MO em amostras de pacientes  Testes serológicos Testes rápidos Imunoensaios rápidos, utilizam reagentes adsorvidos a uma matriz, como tiras de papel ou membranas Por ação capilar, a amostra difunde-se na matriz Para detetar antigénios de MO, a matriz está impregnada com anticorpos conjugados com um cromóforo Se a amostra contiver o MO, vai haver uma mudança de cor rapidamente Menos específicos e sensíveis do que ELISAs  Testes serológicos Western blot Requer a separação de proteínas num gel de poliacrilamida, a transferência (blotting) das proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose e finalmente a identificação de proteínas usando anticorpos específicos Menos sensível, mais demorado e mais caro do que ELISAs Mais específico, podendo ser utilizado para confirmar resultados positivos de ELISA (p.e. HIV)  Microscopia de fluorescência Imunofluorescência Anticorpos conjugados com marcadores fluorescentes podem ser usados para detetar antigénios em células com um microscópio de fluorescência Métodos direto e indireto Métodos de biologia molecular Caracterização genotípica Técnicas de biologia molecular são utilizadas tanto no diagnóstico direto como em MO isolados após cultura Métodos mais caros mas com resultados rápidos e precisos, particularmente úteis na deteção de MO de difícil cultura Sequências de nucleótidos específicas dos MO distinguem-nos uns dos outros Pesquisa de sequências genómicas pode ser feita por técnicas de hibridação, amplificação de ácidos nucleicos e sequenciação de DNA  Métodos de biologia molecular PCR (Polimerase chain reaction) Técnica muito sensível e não depende do isolamento ou crescimento do MO nem de resposta imune por parte do hospedeiro Sequências de nucleótidos específicas são rapidamente amplificadas, usando primers apropriados, gerando quantidade suficiente para análise Deteção e identificação direta de bactérias, vírus, parasitas e fungos – útil em diagnóstico com o uso de primers para genes específicos de agentes patogénicos, principalmente para identificar MO que são difíceis ou impossíveis de cultivar (ex. Mycobacterium tuberculosis, HIV, giardia). Deteção e caracterização de genes responsáveis pela resistência antimicrobiana Várias modificações da técnica: PCR em tempo real, PCR multiplex, RT-PCR, etc.  Métodos de biologia molecular 312 PART TWO A Survey of the Microbial World 1 2 3 4 5 6 7 S stran An DNA fingerprinting DNA izat belo and São usadas enzimas de restrição que permitem comparar fragmentos de DNA de diferentes organismos Nuc Whe O DNA de dois MO é sujeito a digestão com a mesma met enzima de restrição e os fragmentos gerados (RFLP) são not (NA separados por eletroforese originando DNA fingerprinting DN A comparação do número e tamanho dos fragmentos de use Cha restrição gerados dos diferentes MO fornece informações ism sobre as semelhanças e diferenças genéticas – quanto mic Figure 10.15 DNA fingerprints. DNA from seven different bacteria mais semelhantes forem os padrões (ou DNA was digested with the same restriction enzyme. Each digest was put I agen fingerprinting), mais próxima a relação entre os MO in a different well (origin) in the agarose gel. An electrical current was bact then applied to the gel to separate the fragments by size and electrical charge. The DNA was made visible by staining with a dye that fluoresces WH under ultraviolet light. Comparison of the lanes shows that DNA samples Geo (and therefore the bacteria) in lanes 2 and 3; 4 and 5; and 1 and 6 are orde identical. Métodos de biologia molecular Microarrays Utilizam sondas de DNA correspondentes a segmentos de genes que estão fixadas e dispostas espacialmente num padrão conhecido em chips Estas sondas são desenhadas para hibridar com sequências complementares presentes numa amostra As amostras de DNA alvo (em cadeia simples) são marcado com fluorescência A hibridação da sonda de DNA com DNA alvo é detetada por fluorescência A intensidade de fluorescência é medida para determinar a quantidade de hibridação e, assim, quantificar a expressão génica ou detetar a presença de sequências específicas de DNA Podem ser usados para detetar e identificar múltiplos MO através de sondas específicas para diferentes genes de MO Permitem analisar a presença de múltiplos genes responsáveis pela resistência a antibióticos em bactérias através de sondas específicas para estes genes  DNA sequences. Assume specific signature sequen that each DNA sequence sequently cut with one o was unique to a different gene. rated by electrophoresis. 314 PART TWO A Survey of the Microbial World be compared. The rRNA be sequenced to determi Métodos DNA Chips de biologia molecular A sample containing DNA from an unknown organism is organisms. This techniqu covered organism to dom An exciting new technology is the DNA chip, or microarray, labeled with a fluorescent dye and added to the chip. Hybrid- general types of organism which can quickly detect a pathogen in a host or the environ- ization between the probe DNA and DNA in the sample is specific probes (see page ment by identifying a gene that is unique to that pathogen detected by (b)fluorescence. Unknown DNA from a sample is separated into single strands, species, however. enzymatically cut, and labeled with a fluorescent dye. Microarrays (Figure 10.18). The DNA chip is composed of DNA probes. Ribotyping and Ribosomal RNA Sequencing Ribotyping is Fluorescent In Situ Hybrid currently being used to determine the phylogenetic relation- RNA or DNA probes a ships among organisms. There are several advantages to using place, or in situ. This te rRNA. First, all cells contain ribosomes. Second, RNA genes hybridization, or FISH. have undergone few changes over time, so all members of a the cells and reacts with t domain, phylum—and, in some cases, a genus—have the same used to determine the ide of microorganisms in an “signature” sequences in their rRNA. Theunknown (c) The rRNA DNA used most into is inserted bacteria that have not yet often is a component of the smaller portion of ribosomes. with the chip and allowed to hybridize the DNA on the chip. discovered a tiny bacteriu A third advantage of rRNA sequencing is that cells don’t have (a) A DNA chip can be in the ocean and determ manufactured to contain to be cultured in the laboratory. (d) The tagged DNA will bind only to (page 323). As probes are hundreds of thousands of synthetic single-stranded DNA can be amplified by PCR using an rRNA primer the complementary DNA on theforchip. bacteria in drinking wate The bound DNA will be detected by DNA sequences. Assume specific signature sequences. The amplified fragments its dye and analyzed byare sub- a computer. normal 24-hour or longe that each DNA sequence sequently cut with one or more restriction enzymes and sepa- In this Salmonella was unique to a different (Figure 10.19). antimicrobial-resistance gene gene. rated by electrophoresis. The resultingmicroarray,band patterns Salmonellacan then be compared. The rRNA genes in the amplified fragments can Typhimurium–specific antibiotic-resistance gene probes are Putting Classificat be sequenced to determine evolutionary relationships green, between Salmonella Typhi–specific Morphological character organisms. This technique is useful for resistance gene probes classifying a newly are dis- red, and antibiotic-resistance genes found in chemical testing were th covered organism to domain or phylum or to determine both serovars appear yellow.the just a few years ago. Te Blue indicates absence of the gene. ing it possible to use n general types of organisms present in one environment. More specific probes (see page Figure 10.18 DNA279) chip.are needed This DNA chiptocontains identify individual probes for antibiotic- reserved for classification (b) Unknown DNA from a sample is separated into single strands, tion obtained about mic enzymatically cut, and labeled with a fluorescent dye. species, however. resistance genes. It is used to detect antibiotic-resistant bacteria in samples collected from animals on a farm or in slaughter facilities. the organisms (see Explo Q What methods of using the inf Fluorescent In Situ Hybridization is on (FISH) the chip to make Fluorescent it specific dye–labeled for a particular Métodos de biologia molecular methods: Nucleic acid hybridization Other nucleotide-based Hibridação de ácidos nucleicos Single strands of DNA and Técnica aplicadaRNA from em related estudos de organisms taxonomia molecular will hydrogen- e filogenia para aferir o grau debond to form relação a double- entre MO - utilizada parastranded molecule definir espécies bacterianas. O grau de hibridação indica o quanto as sequências genéticas são semelhantes The percent hybridization entre os doismayMO. Quanto indicate mais relatedness complementaridade betweenhouver, mais organisms. próximo o relacionamento entre eles. Quando dois organismos apresentam 70% ou mais de hibridação DNA-DNA, podem ser considerados da mesma espécie. Métodos de biologia molecular FISH (Fluorescence in situ hybridization) Técnica envolve o uso de sondas de ácidos nucleicos (oligonucleótidos de DNA ou RNA) que se ligam a sequências complementares específicas presentes no MO alvo Na presença da sequência esperada, dá-se a hibridação com a sonda Estas sondas estão marcadas com fluorocromos, permitindo a visualização por microscopia de fluorescência As sondas ligam-se de forma específica com sequências-alvo de DNA ou RNA nas células, permitindo a identificação de organismos específicos ou genes A hibridação ocorre dentro das células ou tecidos (in situ), sem necessidade de extrair DNA ou RNA