Microbiologie alimentaire: Milieu et tests - PDF

Microbiologie alimentaire Milieu et tests Théorie 2021-2022 Gélose au sang Anti Gram – → Ne pousse que des Gram + GS / GS + AN Milieu Monomicrobien / Milieu Polymicrobien (milieu sélectif) Composition : Gélose nutritive ou TSA → milieu polyvalent...

Microbiologie alimentaire Milieu et tests Théorie 2021-2022 Gélose au sang Anti Gram – → Ne pousse que des Gram + GS / GS + AN Milieu Monomicrobien / Milieu Polymicrobien (milieu sélectif) Composition : Gélose nutritive ou TSA → milieu polyvalent Hémolyse = dégradation Matière Fonction des globules rouges Hydrolysat de caséine Nutritif Peptone de soja Nutritif Hémolyse α : ✓ Hémolyse partielle NaCl Élément osmotique Acide nalidixique et Colistine Antibiotiques → aspect sélectif Hémolyse β : 5 % de sang Dégradation des GR ✓ Hémolyse complète Agar Gélifiant Hémolyse γ : ✓ Pas d’hémolyse Incubation : 24H/37°C/aérobiose ChromID CPS Elite Milieu polyvalent et chromogène Substrat enzymatique chromogène incolore Si enzyme « adaptée » → clivage et libération du groupement chromogène → couleur de la colonie Identification si urine Mise en évidence de 4 caractéristiques biochimiques β – galactosidase → colonies rose pâle β – glucosidase (~ esculinase) → colonies bleues β – glucuronidase → colonies bordeaux Tryptophane désaminase → milieu brun orangé Escherichia coli Klebsiella sp. + Enterobacter sp. β – galactosidase β – galactosidase β – glucuronidase → Colonies bordeaux β – glucosidase → Colonies vert/bleus  XLD 1G/L 10G/L 10G/L Xylose – Lysine – Désoxycholate Mise en évidence de BG – résistants aux sels biliaires F. sucre(s) → Lactose, Saccharose, Xylose Décarboxylation de la lysine (lysine décarboxylase) Matière Fonction Production d’H2S (Thiosulfate réductase) Extrait de levure Nutritif Lecture : NaCl Régulateur osmotique Si croissance → BG – « intestinaux » Thiosulfate de Na Production d’H2S Sucre(s) → production d’acides → pH ↘ Citrate de Fe Indicateur Production d’H2S → colonies jaunes (+ précipitation jaune) Lysine (Lysine décarboxylase) Nutritif et spécifique (LDC) Aucun sucre fermenté → colonies incolores Sucre (Lactose, Xylose, Saccharose) Nutritif et spécifique Fermentation LDC + → production de « base » → pH ↗ Rouge de phénol Indicateur de pH (couleur milieu) ▪ Xylose + et LDC + → colonies incolores ▪ Lactose et/ou saccharose → colonies jaunes Désoxycholate de Na BG – « intestinaux » Agar Gélifiant H2S + → réaction avec citrate de Fe → centre noir  Kliger Milieu polyvalent Mise en évidence de 4 caractéristiques biochimiques : F. glucose F. lactose (β – galactosidase) Production de gaz lors de la/des fermentation(s) Production d’H2S (Thiosulfate réductase) pH ~ 7,4 Lecture : Matière Fonction Fermentation de glucose → culot Extrait de levure et viande Nutritif ▪ Oui : acide + → pH ↘ → jaune ▪ Non : culot inchangé → rouge = croissance → aérobie stricte ! NaCl Nutritif Fermentation du lactose → culot Peptone Nutritif ▪ Oui : acide ++ → culot et pente jaune Thiosulfate de Na Production d’H2S ▪ Non : pente → pH ↗ → pente rouge Citrate de Fe Indicateur Production d’H2S Production de gaz lors des fermentations → culot ▪ Oui : bulle ou gélose « éclatée » Lactose et glucose β – galactosidase + pro. de gaz Réduction du thiosulfate → culot Rouge de phénol β – galactosidase + pro. de gaz ▪ Oui : H2S + → précipité de FeS → culot noir (→ culot jaune !) ▪ Non : culot jaune ou rouge Agar Gélifiant CIN Cefsulodine – Irgasan – Novobiocine Lecture : M + → acides → petites colonies à centre rose fuchsia Yersinia enterocolitica → + halo pâle (œil de bœuf) Incubation : 24H/29°C/aérobiose Matière Fonction Peptone / extrait de levure Nutritif NaCl Osmorégulateur Pyruvate de Na Protecteur et stimulateur pour Yersinia Mannitol Nutritif → M + → colonies à centre rose Rouge neutre Indicateur Cristal violet Inhibiteur de Gram + Désoxycholate de Na Inhibiteur de non-intestinaux Cefsulodine – Irgasan – Novobiocine Antibiotiques Agar Gélifiant  Mac Conkey Mise en évidence de BG – « intestinaux » fermentant ou pas le lactose Milieu polymicrobien (plusieurs µorganismes) Lecture : Non BG – « intestinaux » inhibés BG – intestinales lactose + → acidification → colonies fuchsia (+ halo de précipitation) BG – intestinaux lactose - → acidification → colonies incolores Incubation : 24H/37°C/aérobiose Matière Fonction Peptone Nutritif Extrait de levure Nutritif NaCl Osmorégulateur Sels biliaires Anti non « intestinaux » Cristal violet Inhibiteur (anti) de Gram + Lactose Nutritif + différentielle → β – galactosidase Rouge neutre Indicateur → pH Agar Gélifiant  Cytochrome oxydase Enzyme respiratoire : dernier accepteur d’e- de la chaîne respiratoire chez les aérobies strictes O2 Absence chez les entérobactéries Présente chez les BG – non fermentant (ex: Pseudomonas) Caractère distinctif Mode opératoire Sur papier filtre : dépôt d’un disque de substrat (pince en plastique ! ) Déposer 2-3 gouttes d’eau de ville sur le disque → diffusion du réactif Avec Öse en plastique → prélever une colonie isolée de BG - / L- Faire une strie perpendiculaire au disque Apparition d’une trace bleue/violette → Oxydase + → Lecture immédiate Catalase Enzyme du métabolisme respiratoire aérobie H2O2 → H2O + ½ O2 Sur lame : 1 goutte d’eau oxygénée Émulsionner 1 colonie Tous les Staphylococcus sont catalase +  Coagulase libre Staphylocoagulase = vraie coagulase Enzyme se liant à la prothrombine → Changement de conformation = staphylothrombine (~ thrombine) → Fibrinogène transformé en fibrine Protection contre les neutrophiles (1ère ligne de défense de l’organisme + Ȼ tueuses et anti-infectieuses) Propagation dans le flux sanguin sous forme de µ-thrombi Capacité d’adhésion + aux corps étrangers intravasculaires → biofilms En tube de 0,5 ml de plasma de lapin : Emulsionner 1 colonie Incuber 2h-4h à 37°C → coagulase + si pise de masse (coagulase libre = caillot) Coagulase liée = Staph-Latex Triple test = billes de latex Clumping factor (facteur d’agglutination) = fausse coagulase Enzyme mais récepteur au niveau de la paroi → virulence Ag d’affinité pour le fibrinogène → Fibrinogène sur les billes Agglutination Ac/Ag Protéine A → IgG sur les billes Ajout d’un Ac A dans le test qui va se fixer sur la protéine A Capsule → Ac anti-polysaccharides capsulaire sur les billes Ac qui vont se fixer sur la capsule Sur lame : Sur support cartonné : 1 goutte de plasma de lapin Bille de latex + fibinogène Emulsionner 1 colonie → + si grumeaux Emulsionner 1 colonie → + si agglutination Typage Groupe → Pour les Streptococcus Classification de Lancefield Basée sur polysaccharide C dans la paroi → Groupe (A → G) Mode opératoire Suspension dans 300 µL enzyme de Maxted → incuber → Ag décelables Suspension de billes de latex avec Ac spécifique du groupe suspecté Ajouter suspension Maxted Agglutination si correspondance Ac/Ag Incubation de la suspension Maxted : 37°C/15’ BEA Dégradation de l’esculine (esculinase) → Esculétine Esculétine + citrate de Fe → Précipité marron à noir Str. bovis ou Enterococcus Incubation : 24H/37°C/aérobiose Matière Fonction Tryptone Nutritif Extrait de levure Nutritif Chlorure de sodium (NaCl) Élément osmotique Citrate de Na Stimulateur Esculine Nutritif et différentiel Citrate de Fe ammoniacal Indicateur → dégrade l’esculine Azoture de sodium (Na) Inhibiteur (anti) de Gram - Bile (sels biliaires) Inhibiteur (anti) non « intestinaux » Agar Gélifiant PYRR Pyrrolidonyl arylamidase Sur Streptococcus α/γ – hémolytique En tube (0,25 ml de sérum physiologique) Ensemencement « milky » Dépôt du comprimé Incubation Rose → Pyrr + (ETC) Incubation : 4h/37°C/aérobiose VP test Fermentation butane diolique Glucose → acétoïne → butane-diol Mode opératoire Ensemencer un bouillon Clark & Lubs Glucose, peptone, tampon Incuber Ajouter KOH & α-naphtol Chauffer 15’/37°C VP + → coloration rose Indole Tryptophane → indole grâce à la tryphanase Mode opératoire Ensemencer un milieu avec tryptophane (SIM) Incuber Ajouter du réactif de Griess Indole + → anneau rose en surface TDA Tryptophane désamine → mise en évidence Substrat = Tryptophane → acide indole pyruvique Mode opératoire Ensemencer un milieu avec tryptophane (SIM) Incuber Ajouter FeCI3 (chlorure de Fe) → Donne un produit marron foncé en présence d’acide indol pyruvique TDA + → coloration orange/brun Production de Pyocyanine Pigment bleuté Mode opératoire Ensemencer la pente d’un milieu pseudomonas agar visser le bouchon partiellement Incuber Incubation : 24h/37°C/aérobiose Pseudomonas aeruginosa → pigment bleu/vert R/S antibiotique Sur gélose au sang Incubation : 24h/37°C/aérobiose Ensemencement massif Dépôt du comprimé → 5 µg Novobiocine Optochine Staphylococcus Streptococcus Sur Staph. γ-hémolytique Sur α-hémolytique non groupable Si Ø > 12 mm → R R → Str. uberis, Str. Viridans Tous sensible S → Str. pneumoniae Galerie Api Série de substrats + indicateur Ensemencement d’une suspension Ajout éventuel de paraffine Incubation Ajout éventuel de réactifs Lecture → tests + ou – Détermination du code → Identité de la souche Incubation : 24h/37°C/aérobiose Incubation Yersinia sp : 24h/29°C/aérobiose Galerie Api 20E → Enterococcus Galerie Api 20NE → Non ETC BG – résistants aux sels biliaires et Ox - Plusieurs substrats pour plusieurs enzymes  Maldi-Tof Technique rapide d’identification À partir d’une colonie isolée et fraîche Analyte (colonie) associé à une matrice protectrice (MA) Ionisation des protéines bactériennes par rayon laser → émissions d’ion +/- lourds (LDI) Ions accélérés dans un champ électrique → migration ▪ Vitesse de migration en fonction de masse/charge (m/Z) ▪ Temps de vol propre à chacun (TOF) Détection du passage des ions en fin de parcours ▪ par un spectromètre de masse ▪ Mesure du temps de vol → spectre spécifique  Sérotypage Caractérisation des souches via leurs Ag O : LPS H : flagelles K : capsule Mode opératoire Utilisation de billes de latex recouvertes d’Ac connus Mélange avec la source à tester (Ag inconnus) Agglutination → +  SIM Soufre Indole Mobilité Mise en évidence de 3 caractéristiques biochimiques ▪ H2S (thiosulfate réductase) ▪ Indole (tryptophanase) ▪ Mobilité à 29°C Mode opératoire Composition ▪ Strie verticale aller-retour même chemin Peptone ▪ Incubation à 37°C/24h/aérobiose Tryptophane Trouble = mobile + Thiosulfate de Na ✓ Listeria monocytogenes Citrate de Fe ▪ Ajout de Griess Agar (demi-cc) Indole + → anneau rose  Camp test Camp Inverse Camp test Camp Inverse Recherche du Camp factor Synergie β-hémolytique Synergie β-hémolytique Sur gélose au sang de mouton Strie verticale de Staphylococcus aureus ATCC Strie verticale de Streptococcus agalactiae ATCC (2 hémolyses β) (2 hémolyses β) Strie verticale du BG – , catalase + à identifier Strie verticale du BG + , anaérobie à identifier Incubation = 24h/37°C/aérobiose Incubation = 24h/37°C/anaérobiose Synergie hémolytique → hémolyse β en forme de Synergie hémolytique → hémolyse β en forme de « marteau » à l’intersection des 2 stries « chapeau de gendarme » à l’intersection des 2 stries ✓= Amplification de la 2ème hémolyse du Staph.