Aula 03 - Análises Laboratoriais em Marcadores Moleculares PDF

ANÁLISES LABORATORIAIS UTILIZADAS NO ESTUDO DOS MARCADORES MOLECULARES Curso: Agronomia Disciplina: Biotecnologia Profa. Dra. Jaqueline Malagutti Corsato OBJETIVO Apresentar as técnicas: Extração do DNA; Amplificação do DNA; Fonte: Google Im...

ANÁLISES LABORATORIAIS UTILIZADAS NO ESTUDO DOS MARCADORES MOLECULARES Curso: Agronomia Disciplina: Biotecnologia Profa. Dra. Jaqueline Malagutti Corsato OBJETIVO Apresentar as técnicas: Extração do DNA; Amplificação do DNA; Fonte: Google Imagens Quantificação do DNA. EXTRAÇÃO DO DNA  EXTRAÇÃO DO DNA Protocolo de extração: Baseado no uso de detergente CTAB (1987). Utiliza toda e qualquer parte da planta; Escolha do material: facilitar o trabalho; Material mais indicado: folhas.  ETAPAS DA EXTRAÇÃO DNA Selecionar material; Macerar o material: almofariz e pistilo; Adicionar tampão de lise CTAB: Pré aquecido 65°C; Função: lise de membranas que envolvem a molécula de DNA; Mantêm a integridade do DNA.  TAMPÃO CTAB Definição CTAB: detergente que realiza a quebra química das membranas lipoproteicas e forma um complexo com o DNA que o precipita; EDTA: quelante de cátions divalentes, cofatores de DNAses, captura cálcio e magnésio e evita a ação das DNAses; Tris: tamponante, mantêm o pH constante; NaCl: complexa ao DNA e auxilia na sua precipitação, seprando o material durante a extração;  TAMPÃO CTAB PVP: antioxidante; 2-Mercaptoetanol: degrada as proteínas e ajuda a combater a oxidação, altamente tóxico com enxofre na sua composição o que dá um cheiro característico próprio; pH 8,0: desnatura as DNAses; Temperatura de 65°C: desnatura enzimas DNAses e auxilia na quebra das moléculas lipoprotéicas.  APÓS ADICIONAR CTAB Obtenção: DNA + açúcares + proteínas Adicionar clorofórmio e álcool isoamílico (CIA) 24:1; Processo repetido 2 a 3 vezes; Resultado: na fase aquosa que fica na parte de cima do tubo eppendorf fica o DNA e na parte de baixo fica a fase orgânica com os compostos indesejáveis. A fase aquosa pode ser retirada facilmente com uma pipeta.  EXTRAÇÃO DE DNA Após purificação: adicionar isopropanol e séries de álcool 70% gelado (-20°C) para precipitar o DNA; O álcool por estar gelado e entrar em contato com a água que está em contato com o DNA começa a se congelar e a se separar da molécula de DNA; O álcool também tem mais afinidade com a molécula de água que o DNA o que facilita o processo; Assim, o DNA começa a se precipitar, formando no fundo do tubo um precipitado com o aspecto esbranquiçado; Por fim descarta-se o sobrenadante e temos o DNA extraído. AVALIAÇÃO DA QUANTIDADE E QUALIDADE DNA  AVALIAÇÃO QUANTIDADE E QUALIDADE DO DNA Espectrofotometria: uma curva de quantificação, que tem o comportamento que desce, sobe e desce novamente; Gel de eletroforese: ver a qualidade do DNA conforme a degradação do DNA, manchas esbranquiçadas demonstram baixa qualidade e grande degradação. ANPLIFICAÇÃO DO DNA  AMPLIFICAÇÃO DO DNA Reação em Cadeia da polimerase PCR; Desenvolvida por Kary Mullis em 1984; Função: reproduzir in vitro a replicação do DNA; Resultado: milhões de cópias do DNA utilizando a enzima DNA polimerase e de um par de primers.  COMPONENTES PCR Amostra de DNA: nanogramas; Água: meio onde ocorre as reações de amplificação; Tampão 10x: mantêm o pH e concentrações iônicas ideais para que ocorram as reações; MgCl2: cofator enzimático da enzima Taq Polimerase; dNTPS: nucleotídeos utilizados para amplificar o fragmento (A, T, G, C).  COMPONENTES PCR Taq DNA polimerase: enzima responsável por adicionar os nucleotídeos complementares à sequência alvo, retirada de uma bactéria Thermus aquaticus que é uma bactéria que vive em temperaturas de 177°C e essa enzima atua em uma temperatura ótima de 72°C; Primers: identificam a região alvo no genoma que será amplificada, mostrando para a DNA polimerase onde ela deve começar o seu trabalho.  ETAPAS DA PCR: 30 A 40 CICLOS Denaturação do DNA: 1 minuto a 94 °C; Anelamento: 45 segundos a 54°C, para possibilitar o anelamento dos primers; Extensão: 2 minutos 72 °C, que é a temperatura ideal para a Taq Polimerase; Termociclador: faz uma amplificação exponencial de um determinado fragmento de DNA resultando em 68 bilhões de cópias do segmento de DNA de interesse. RESOLUÇÃO DOS MARCADORES  ELETROFORESE Técnica utilizada para a separação de moléculas; Partículas migram em uma matriz, que pode ser um gel de agarose ou acrilamida, devido a uma diferença de um potencial elétrico entre os polos opostos do gel; Pode ser horizontal ou vertical; Gel de agarose: utilizado para separar moléculas de alto peso molecular (>100 pb); Poliacrilamida: indicada para a separação de moléculas de baixo peso molecular (