FC修饰的KLK1规模化生产步骤详解 PDF

**FC修饰的KLK1规模化生产步骤详解** **1. 基因构建与宿主细胞选择** - **基因设计**：\ 将KLK1基因与Fc段（如IgG1的Fc）通过柔性连接肽（如(G4S)3）融合，确保正确折叠和功能性。启动子选择（如CMV）、信号肽（如Igκ前导肽）需优化以增强分泌效率。 - **宿主系统**：\ 主要采用CHO（中国仓鼠卵巢）细胞，因...

**FC修饰的KLK1规模化生产步骤详解** **1. 基因构建与宿主细胞选择** - **基因设计**：\ 将KLK1基因与Fc段（如IgG1的Fc）通过柔性连接肽（如(G4S)3）融合，确保正确折叠和功能性。启动子选择（如CMV）、信号肽（如Igκ前导肽）需优化以增强分泌效率。 - **宿主系统**：\ 主要采用CHO（中国仓鼠卵巢）细胞，因其具备完善的糖基化能力，确保Fc段功能及蛋白稳定性。工程化CHO细胞株（如CHO-K1或CHO-S）通过基因编辑（如CRISPR）提高表达量和克隆稳定性。 **2. 细胞培养与表达优化** - **种子扩增**：\ 从冻存的主细胞库（MCB）复苏，逐步扩增至摇瓶、滚瓶或小型生物反应器（50-200 L），使用无血清培养基减少杂质。 - **大规模生产**：\ 在2000-20000 L生物反应器中，通过流加或灌流培养优化参数： - **温度**：37°C（生长期）→32°C（生产期，延长细胞存活）。 - **pH**：6.8-7.2，通过CO₂或碱液调控。 - **溶氧（DO）**：30%-60%，通过搅拌速率和纯氧补充控制。 - **补料策略**：精准添加葡萄糖、氨基酸及专用补料（如Cell Boost™），抑制乳酸/氨积累，提升蛋白滴度至5-15 g/L。 **3. 下游纯化工艺** - **收获与澄清**：\ 离心或深层过滤（0.2 µm）去除细胞碎片，收集含KLK1-Fc的上清液。 - **亲和层析（Protein A/G）**：\ Fc段特异性结合Protein A树脂，一步捕获目标蛋白，洗脱条件（pH 3.0-3.5）需快速中和以防止变性，收率达80%-90%。 - **精纯步骤**： - **阴离子交换层析（AEX）**：在pH 8.0下结合宿主蛋白、DNA等杂质，流穿模式下回收目标蛋白。 - **疏水层析（HIC）**：利用疏水性差异去除聚体和降解产物，常用苯基琼脂糖树脂。 - **分子筛层析（SEC）**：Superdex 200柱分离单体与聚体，确保终产品单体含量≥95%。 - **病毒灭活与清除**：\ 强制步骤包括低pH孵育（pH 3.8，1小时）和纳米过滤（20 nm滤膜），确保病毒滴度降低≥4 log。 **4. 制剂与质量控制** - **缓冲液置换**：\ 超滤/透析至终制剂缓冲液（如10 mM组氨酸、pH 6.0，含5%蔗糖），优化长期稳定性。 - **无菌灌装**：\ 0.22 µm过滤后分装至预充式注射器或西林瓶，冻干工艺（如-40°C冷冻、真空干燥）用于提升储存稳定性。 - **关键质量属性（CQA）检测**： - **纯度**：SDS-PAGE（\>95%）、SEC-HPLC（聚体\