Analyse physico-chimique PDF

Analyse physico-chimique Méthode chromatographique Méthodes chromatographiques : CPL, CPG, couche mince et HPLC 1. Définition La chromatographie, méthode d’analyse physico-chimique, sépare les constituants d’un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d’une phase mobile (liquide ou gaz...

Analyse physico-chimique Méthode chromatographique Méthodes chromatographiques : CPL, CPG, couche mince et HPLC 1. Définition La chromatographie, méthode d’analyse physico-chimique, sépare les constituants d’un mélange (les solutés) par entraînement au moyen d’une phase mobile (liquide ou gaz) le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé), grâce à la répartition sélective des solutés entre ces deux phases. Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile). 2. Les différents types de techniques chromatographiques La classification des chromatographies peut se faire en fonction des mécanismes de séparation. Les facteurs qui interviennent dans le partage des molécules à séparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilité dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarité, la charge électrique. 2.2.1. Chromatographies en phase liquide (CPL) Dans ce cas, la phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on distingue : -La chromatographie de partage : C’est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte -La chromatographie d’exclusion : On l’appelle également chromatographie d’exclusion diffusion, tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche, les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel. Chromatographies d’adsorption La chromatographie d’adsorption : C’est une chromatographie liquide- solide. La phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. La chromatographie d’adsorption en phase inverse : C’est une chromatographie liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire. La chromatographie sur échangeurs d’ions : La phase stationnaire est un échangeur d’ions constitué par une résine porteuse de groupements ionisés négativement ou positivement, exerçant des interactions de type électrostatique avec les solutés ioniques du milieu. La chromatographie d’affinité : La phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte, sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologie (bio-affinité) pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité enzyme-substrat, antigène- anticorps). 2.4. Chromatographie Liquide à Haute Pression (HPLC) C’est en fait une chromatographie sur colonne, mais à haute pression, ce qui permet d’éviter toute perte de charge et de maintenir un débit constant. C’est une technique extrêmement intéressante puisqu’elle permet l’étude de mélange dont les composants sont peu volatils ou qui se dégradent à haute température. Instrumentation Pompes La pompe va mettre la phase mobile sous pression. Injecteur Il est constitué d’une vanne haute pression Colonne La colonne est généralement un tube en acier de 5 à 30 cm de longueur et de diamètre de l’ordre de 5 mm. La phase stationnaire est constituée de grains sphériques calibrés de diamètre allant de 5 à 10 μm. La nature de la phase est fonction du type de chromatographie liquide que l’on souhaite réaliser (exclusion, adsorption, Détecteurs Il existe plusieurs types de détections; ex. : UV, radioactivité, etc. Les résultats sont obtenus sous forme de pics (chromatogramme) qui sont comparés par la suite à une base de données. Chomatogramme HPLC (intensité mV en fonction de temps de rétention (min)). 2.5. Chromatographie sur Couche Mince (CCM) La chromatographie planaire, également connue sous le nom de chromatographie sur couche mince (CCM), est une technique complémentaire de la HPLC, ayant sa propre spécificité. Bien que la mise en oeuvre de ces deux techniques soit différente, le principe de la séparation et la nature des phases restent les mêmes. Méthode sensible, de faible coût, pouvant être automatisée, elle est devenue désormais indispensable sachant aussi qu’il est possible de mener plusieurs séparations en parallèle.. 2.5.1.1. Mise en oeuvre de la CCM La séparation par chromatographie planaire des constituants de l’échantillon est réalisée sur une fine couche (100−200 mm) de phase stationnaire, généralement à base de gel de silice, déposée sur une plaque rectangulaire de verre, de plastique ou d’aluminium, de quelques centimètres de côté. Pour maintenir la phase stationnaire sur le support et assurer la cohésion des particules, un liant organique est incorporé au cours de la fabrication de la plaque. Le principe de la séparation entre phases est semblable à celui de la HPLC, mais la conduite de l’expérience de CCM est différente. On distingue trois étapes. a. Dépôt de l’échantillon On commence par déposer un petit volume (compris entre quelques nanolitres et plusieurs microlitres) de l’échantillon en solution diluée, à proximité du bord inférieur de la plaque sous forme d’une tache de 1 à 3 mm de diamètre. La plaque ainsi préparée est introduite dans une cuve spéciale munie d’un couvercle, au fond de laquelle se trouve un peu de la phase mobile servant d’éluant. L’endroit où l’échantillon se trouve doit être situé au-dessus du niveau d’immersion. b. Développement de la plaque La phase mobile migre par capillarité à travers la phase stationnaire sèche, entraînant à des vitesses différentes les constituants à séparer. Le temps de migration (plusieurs minutes) dépend de divers paramètres. Quand le front de solvant a parcouru une distance considérée comme suffisante (quelques centimètres), on retire la plaque de la cuve, on repère la position limite atteinte par la phase mobile c. Révélation post-chromatographique La localisation des composés après migration se fait sur la plaque débarrassée de l’éluant Les composés qui donnent des taches invisibles doivent être « révélés ». À cette fin la phase stationnaire contient un indicateur consistant en un sel de zinc qui émet une fluorescence verte lorsqu’on éclaire la plaque au moyen d’une lampe UV (λ = 254 nm). Tout composé qui absorbe à cette longueur d’onde apparaît sous forme d’une tache sombre (ou quelquefois colorée).  Chaque composé est défini par Rf (le rapport frontal) qui correspond à sa migration relative par rapport au solvant : 2.2.2. Chromatographies en phase gazeuse (CPG) La phase mobile est un gaz appelé gaz vecteur ou encore gaz porteur. On distingue dans ce cas : La chromatographie gaz-liquide : C’est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est un liquide fixé par imbibition d’un support inerte. La chromatographie gaz-solide : C’est une chromatographie d’adsorption. La phase stationnaire est un solide adsorbant. 2.6.3. Instrumentation Un appareil de CPG comporte trois parties : injecteur, colonne et détecteur à travers lesquels un gaz vecteur entraine les substances d’un mélange à séparer. Le gaz le plus utilisé est l’hélium, les autres sont l’hydrogène, l’azote ou l’argon. Il doit être très pur et surtout ne contenir ni oxygène, ni eau. Le débit du gaz est ajusté par un régulateur.