Biologia Molecolare - Appunti 7 Novembre 2023 PDF

7.2 biologia molecolare 7 novembre 2023 IL MEDIATORE Nel momento della trascrizione, si è visto come determinate sequenze di nucleotidi sono responsabili, in parte, dell’espressione genica negli eucarioti. L’attività della polimerasi è...

7.2 biologia molecolare 7 novembre 2023 IL MEDIATORE Nel momento della trascrizione, si è visto come determinate sequenze di nucleotidi sono responsabili, in parte, dell’espressione genica negli eucarioti. L’attività della polimerasi è controllata dal mediatore, un complesso multiproteico di circa 20 subunità con un’altissima affinità per l’RNA polimerasi II. La superficie esterna del mediatore prende contatto con le molecole attivatrici/repressori che legano le regioni di regolazione distali e trasmettono l’effetto pro-trascrizionale o di repressione della trascrizione all’RNA polimerasi. Il messaggio composto da stimoli negativi e positivi verrà poi trasferito all’enzima, per mezzo della RNA polimerasi III, che provvederà a fare una media dei suddetti stimoli FUNZIONAMENTO DEL PROMOTORE NEGLI EUCARIOTI Nelle cellule eucariote il promotore minimo si trova a cavallo del sito di inizio della trascrizione, comprende la TATA box (nel lievito è presente, a monte del promotore, un elemento noto come UAS, riconosciuto da attivatori specifici), siti di legame dei fattori della trascrizione al DNA a monte o a valle del nucleotide +1 e il sito di legame dell’RNA POL. Sono poi presenti degli elementi regolatori prossimali lunghi qualche centinaio di nucleotidi a monte del sito di inizio della trascrizione, essi sono legati dai fattori di trascrizione specifici e da fattori proteici che influenzano direttamente la trascrizione della polimerasi. Infine sono presenti gli elementi di regolazione distali, distanti anche decine di kb, legati da molecole attivatrici o repressori che sfruttano il mediatore per prendere contatto con la polimerasi. PROMOTORI PRIVI DI TATABOX I geni definiti “house keeping”, geni costitutivi che vengono sempre espressi all’interno delle cellule degli eucarioti, presentano promotori che non hanno la TATA box. In questo caso sono le CPG islands a fungere da promotori, regioni caratterizzate dalle ripetizioni ridondanti a monte del sito di inizio della trascrizione di sequenze definite GC box (sequenze ricche di citosine e con una guanina). Come detto in precedenza queste regioni sono trascritte in maniera sostenuta, questo perché ogni Sbobinatore: Andrea Katundi Revisore: Leonardo Stefani 7.2 biologia molecolare 7 novembre 2023 singolo GC box è legato da una proteina denominata fattore di trascrizione SP1 che riconosce le CPG islands e riesce a stimolare ad alti livelli l’attività dell’RNA polimerasi II. Altra caratteristica fondamentale delle CPG islands riguarda la loro regolazione epigenetica: uno dei meccanismi di silenziamento della cromatina, e quindi dell’espressione genica, prevede la metilazione delle citosine attraverso enzimi specifici. Queste regioni però, riescono a violare questo meccanismo proprio perché essendo promotori di geni “house keeping” non devono essere silenziate. FATTORI DI TRASCRIZIONE A parità di sequenza del DNA in tutte le cellule di un organismo, come si spiega la tessuto- specificità di espressione di alcuni geni? La polimerasi necessita di fattori generali di trascrizione, oltre che un gene bersaglio. La loro importanza sta nel riconoscimento della regione del promotore, nel loro contributo alla denaturazione e svolgimento della doppia elica e infine permettono il distacco della polimerasi dal promotore. L’immagine sottostante schematizza l’organizzazione del promotore del gene umano dell’insulina, uno dei promotori più studiati con fini terapeutici e traslazionali. Osservando la struttura del promotore si possono riconoscere diverse consensus che sono mantenute in tutte le cellule, come per esempio la TATA box. Le sequenze in nero sono sequenze che vengono riconosciute da fattori di trascrizione ubiquitari, molecole proteiche che si legano a sequenze presenti nei promotori di tutti i geni. Questi fattori sono in grado di riconoscere delle sequenze proprie; tuttavia, loro legami non sempre sono specifici. Questa degenerazione consente di far fronte a mutazioni. I fattori ubiquitari stimolano positivamente l’RNA polimerasi II. Viceversa le sequenze rosse sono legate da fattori di trascrizione tessuto specifici, per esempio il fattore proteico PDX1 è trascritto solo nelle cellule β del pancreas. Abbiamo dunque un’attività di trascrizione unica e specifica per un tipo cellulare. La trascrizione del gene dell’insulina avviene solo se tutti i siti di legame sono occupati dalle proteine corrispondenti. Un segnale ambientale induce la sintesi di una proteina regolatrice della trascrizione, implicando il coinvolgimento di diversi geni. Il motivo per cui sono le isole di Langerhans a produrre l’insulina, è da ricondurre all’attività di “guida” apportata dai fattori di trascrizione sull’RNA pol. Tutte queste proteine mantengono la stessa struttura perché il loro fine è quello di prendere contatto con le proprie regioni di riconoscimento sul DNA e di andare a lavorare su entrambi i filamenti per far sì che l’intera regione venga attivata o inibita. La maggior parte lavora in forma dimerica con moduli ben precisi che interagiscono con i solchi maggiori o minori del DNA in maniera tale da legarsi con l’intorno cromatidio e influenzare l’attività di trascrizione della polimerasi. Sbobinatore: Andrea Katundi Revisore: Leonardo Stefani 7.2 biologia molecolare 7 novembre 2023 ANALISI INTERAZIONE DNA-PROTEINE Le sequenze di legame possono essere visualizzate tramite la tecnica denominata “footprinting” grazie alla quale si possono analizzare le “impronte” lasciate dai fattori di trascrizione sul DNA. Il genoma veniva marcato radioattivamente, nell’immagine corrisponde alle linee nere mentre in corrispondenza delle aree bianche sono presenti fattori di trascrizione che hanno preso contatto col genoma. Sbobinatore: Andrea Katundi Revisore: Leonardo Stefani