Identification and Antimicrobial Chemotherapy PDF

İDENTİFİKASYON VE ANTİMİKROBİYAL KEMOTERAPİ Öğr. Gör. Dr. Hamiyet ECİROĞLU SARBAN Sağlık Hizmetleri MYO Tıbbi Laboratuvar Teknikleri Programı Mikrobiyoloji Dersi Konu Başlıkları: İzolasyon ve İdentifikasyonun Basamakları İde...

İDENTİFİKASYON VE ANTİMİKROBİYAL KEMOTERAPİ Öğr. Gör. Dr. Hamiyet ECİROĞLU SARBAN Sağlık Hizmetleri MYO Tıbbi Laboratuvar Teknikleri Programı Mikrobiyoloji Dersi Konu Başlıkları: İzolasyon ve İdentifikasyonun Basamakları İdentifikasyon testleri Antimikrobiyal kemotarapi Antibiyotiklerin etki mekanizması İzolasyon ve İdentifikasyonun Basamakları Örnek laboratuvara geldi Makroskobik inceleme Mikroskobik inceleme Besiyerine ekim(kültür) İdentifikasyon testleri  İzolasyon ve İdentifikasyonun Basamakları Kültürde üreme görüldükten sonra; 1. Aşama: Kültür plaklarının değerlendirilmesi; inkübasyon sonrası kolonilerin oluşumu (örn 24 sa); boyut, yapı, renk, hemoliz özelliği, oksijen ihtiyacı 2. Aşama: Kolonilerin Gram ile boyanması; MO ları mikroskopik incelenmesi 3. Aşama: İzole edilen bakterinin tiplendirilmesi ; genellikle fizyolojik testler kullanılır. Duruma göre genotipik testler de tercih edilebilir. 4. Aşama: Antibiyotik duyarlılık testleri İdentifikasyon=Tanımlama Mikrobiyolojide, izole edilmiş bir mikroorganizmanın cins ve türünün belirlenmesi anlamında kullanılır. Zor Deneyim isteyen Pahalı!!! Yüzlerce identifikasyon testi arasından belirli bir sistematik yaklaşım ile en basit ve en çabuk sonuç verecek olanlar seçilmelidir. İdentifikasyon testleri; ▪ Genetik testler (genotipik testler) ▪ Basit biyokimyasal testler (fenotipik testler) ▪ İmmunolojik testler (fenotipik testler) olabilir. İdentifikasyon İdentifikasyon için sıklıkla kullanılan fenotipik özellikler ve yapılan testler: 1. Mikroskopik morfoloji ve boyanma özellikleri 2. Makroskopik (koloni) morfolojileri 3. Üreme için gerekli çevresel faktörler 4. Antimikrobiyal direnç paternleri 5. Besin ihtiyacı ve metabolik kapasiteleri İdentifikasyon 1. Mikroskopik morfoloji ve boyanma özellikleri Gram boyama en sık kullanılan boyama yöntemidir. Bakteri morfolojisini ve duvar yapısını değerlendirmemizi sağlar. Bazı durumlarda boyanma özelliği tek başına kesin identifikasyonda kullanılır. Örn, floresan işaretli spesifik antikorlar ve floresan mikroskopi ile; Legionella pneumophila ve Bordetella pertussis tanısı konulabilir. 2. Makroskopik (koloni) morfolojisi Koloninin büyüklüğü, şekli, rengi, yüzey görünümü, agar yüzeyinde koloni çevresinde izlenen her türlü renk değişimini (hemoliz gibi) içerir. Kesin tanı koydurmaz; ön bilgi sağlar. İdentifikasyon 3. Üreme için gerekli çevresel ihtiyaçlar Oksijen, karbondioksit, ısı gibi üreme için gerekli identifikasyonda; Klinik ön tanıyı biliyorsak uygun besiyeri ve inkubasyon koşullarını seçebiliriz. Birkaç farklı besiyeri ve inkubasyon koşuluna ekim yapıp; hangisinde üreme görüyorsak; mikrobiyolojik ön tanıya gidebiliriz! Örn; Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae yüksek miktarda karbondioksit ister. Campylobacter jejuni 42oC’da ürer. Yersinia enterocolitica 0oC’de canlı kalır. İdentifikasyon 4. Antimikrobiyal direnç / duyarlılık: Ön tanı sağlar. Örn; Gram pozitif bakteriler “vankomisin”e duyarlı, Gram negatif bakteriler “vankomisin”e dirençlidir. Dolayısıyla vankomisin diski etrafındaki inhibisyon zonu Gram pozitif bakteri olduğunu gösterir. Benzer şekilde colistin ya da polymixin’e Gram pozitifler dirençli, Gram negatifler duyarlıdır. (Bazı istisnalar bulunabilir, ön tanı sağlar) İdentifikasyon 5. Besin ihtiyacı ve metabolik kapasite Bir bakteri izolatının; besin ihtiyacı & metabolik kapasitesinin ortaya konulması genellikle cins ve tür düzeyinde tanım yapmak için kullanılan en yaygın yaklaşımdır. Bakterinin enzimatik yeteneklerinin ortaya konulması ya da Tuzlar, antimikrobiyaller, toksinler gibi çeşitli inhibitörlerin varlığında bakterinin üreyebilmesi ya da yaşamını devam ettirebilmesi özelliklerinin saptanmasına dayanır.  İdentifikasyon Enzim testleri Katalaz test Oksidaz İndol Üreaz Koagülaz PYR Serolojik testler Moleküler testler Antibiyotik duyarlılık testleri Otomatize sistemler  Katalaz testi Katalaz enzimi, aerobik karbonhidrat metabolizmasının son ürünü olan hidrojen peroksidi H2O ve O2 ye parçalar. Katalaz deneyi pek çok Gram (+) bakteriyi birbirinden ayırt etmede anahtar rolü oynar. Tüpte ya da lamda uygulanabilir. %3 lük H2O2 çözeltisine bakteri eklenir. Örneğin; Staphylococlar katalaz (+) iken, Streptococlar ve enterokoklar katalaz (-)’dir. %20 O2 %1-5 O2 < %1 O2 %0-20 O2 Aerop Mikroaerofil Anaerop Fakültatif SOD+ SOD+ (az) Aerop Kat+ Kat+ (az) SOD+ SOD+ SOD- Kat+ Kat- Kat- Aerotoleran Mutlak anaerop anaerop SOD: süperoksit dizmutaz KAT: Katalaz 13  Oksidaz deneyi Sitokrom oksidaz enzimi bazı bakterilerde besin maddelerinden elektronları alır siyah oksitlenmiş bir ürün oluşturur. Bu deney Gram (-) bakteriler içindeki grupları birbirinden ayırmada yardımcıdır. Tetrametil-p-fenilendiamin dihidroklorür içeren α-naftol çözeltisi kullanılarak mavi renk oluşumu gözlenir.  İndol Testi Triptofan bulunan bir besiyerinde üretilen bakteriler, triptofanı enzimatik olarak hidrolize uğratarak indol oluşturup oluşturmadıklarını belirlemek amacı ile yapılır. 24h (en az)-3 gün inkübasyondan sonra Kovacs ayıracı eklenir, değerlendirilir. E. Coli indol (+)  Üreaz testi Üreaz enzimi üreyi hidrolize ederek amonyak ve CO2’ye parçalanmasına yol açar. Açığa çıkan amonyak ortamda pH’ın artmasına ve ortamın alkalileşmesine neden olur. Bu değişim pH indikatörlerindeki (fenol kırmızısı) renk değişimi ile saptanır. Enterobacteriacea ailesi üyelerinin ve Helicobacter pylori ‘nin tanısında  PYR Testi Gram pozitif kokları; özellikle A grubu beta hemolitik streptokoklar (Streptococcus pyogenes) ve enterokokları ayırmada kullanılan bir testtir. L-pyrrolidonyl arylamidase enziminin varlığı esasına dayanır. Substrat emdirilmiş disk su ile ıslatılır. Üzerine bir-iki koloni bakteri sürülür. Oda ısısında 2 dk beklenir. Reagent damlatılır. Kırmızı renk oluşumu gözlenir.  Koagülaz Testi Koagülaz, bakteriler plazma içinde inkübe edildiklerinde pıhtılaşmaya Koagülaz (-) neden olan bir enzimdir. Staphylococcus aureus’u (koagülaz pozitif) koagülaz negatif staphylococlardan ayırt etmede kullanılır. Koagülaz (+) İdentifikasyon Metabolik yol izlerinin gösterilmesinde kullanılan testler 10S APİ YÖNTEMİ: 10S APİ YÖNTEMİ  İdentifikasyon OTOMATİZE SİSTEMLER Vitex sistemi İdentifikasyon Mikroorganizmaların İmmunolojik Olarak Saptanması(seroloji) Antijen-antikor bağlanmasının spesifikliği avantajdır. Neden tercih edilir? 1. İnfeksiyon etkeninin izolasyonu güç veya olanaksızsa (örneğin sifiliz) 2. Derin bir infeksiyonsa ve kültür zorsa (örneğin hamile bir kadında toksoplazmoz taraması) 3. Önceden geçirilmiş bir infeksiyonun saptanması gerekiyorsa (örneğin ateşli romatizma veya akut glomerulonefrit nedeni olarak geçirilmiş bir streptokok infeksiyonunun saptanması) İdentifikasyon Mikroorganizmaların DNA veya RNA’larının saptanması Temel prensip : DNA veya RNA’e ait hayli kısa ve etken için spesifik bir nükleotid baz dizisinin saptanmasıdır. PCR, sekanslama gibi moleküler teknikler kullanılır. Antibiyotiklere Duyarlılık Deneyleri a. DİSK DİFÜZYON YÖNTEMİ: Kirby-Bauer yöntemi Genelde Mueller Hinton agar (besiyeri) kullanılır. Besiyerine ekim yapılır. Hastalık materyaline göre ve soyutlanan MO ya göre(Gr(+/-)) antibiyotik diskleri yerleştirilir. Etüve kaldırılır. Bir gece inkübasyon. sonuçlar, dirençli (R=Resistant ), duyarlı(S=Sensitive) ya da orta dirençli olarak değerlendirilir.  Antibiyotiklere Duyarlılık Deneyleri b. Minimal İnhibitör Konsantrasyon Minimal inhibitör konsantrasyon (MİK), bir antibiyotiğin bakterinin üremesini inhibe eden en düşük konsantrasyonudur. En etkili antimikrobiyal tedavinin sağlanabilmesi için vücut sıvılarında klinik olarak elde edilen antibiyotik konsantrasyonunun MIK’den büyük olması gerekir.  Antimikrobiyal ilaç direnci nedir? Antimikrobiyal direnç (AMD) herhangi bir mikroorganizmanın, onu ortadan kaldıracak antimikrobiyal tedaviye karşı direnmesi, varlığını sürdürmesi ya da duyarsız hale gelmesi olarak tanımlanabilir. Antifungal(antimikotik) direnç Antiviral direnç Antiprotozoal direnç Antibakteriyel direnç (antibiyotik direnci) Birden fazla ilaca dirençli mikroorganizma oluşmuşsa bu durum multidrug resistance (MDR), yani çoklu ilaç direnci(ÇİD) dir. Antibiyotikler Bakteriyostatik ve Bakterisidal İlaçlar: Bakteriyostatik ilaçlar: Bakterilerin üremesini durdururlar. Bağışıklık sistemi patojeni tümüyle bertaraf etmeden ilaç tedavisi son bulursa yeterli sayıdaki canlı organizma enfeksiyonu yeniden başlatabilir. Bakteriosidal ilaçlar: Bakteriyi öldüren ilaçlardır. Bir antibiyotik bir bakteri için bakteriyostatik, bir diğer bakteri içinse bakteriosidal olabilir. Örneğin; kloramfenikol Gram (-) çomaklar için bakteriyostatik, pnömokoklar içinse bakterisidaldir. ANTİMİKROBİYAL KEMOTERAPİ  ANTİMİKROBİYAL KEMOTERAPİ 1920’lerde penisilinin keşfiyle başladı (Sir Alexandr Flaming). Penicillium notatum küfünün salgıladığı maddeler, stafilokok mikroplarının çözülmesini sağlıyordu. İlerleyen çalışmalar ve araştırmalar ile hastaların tedavisinde kullanılmaya başlandı. Bu buluş 1945 yılında Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü’nü kazandırdı. Antimikrobiyal; mikroorganizmalardan elde edilen, küçük dozlarda diğer mikroorganizmaları öldüren ve insan organizmasına zararlı etkisi görülmeyen doğal veya sentetik maddelerdir. Antibiyotik üreten bakteriler: Streptomyces ve Bacillus sp. Antibiyotik üreten mantarlar: Penicillum,Cephalosporium vs.. Antimikrobiyal Kemoterapi SEÇİCİ TOKSİK ETKİ Bir antimikrobiyaldeki en önemli özellik!! Konağa zarar vermeden mikroorganizmanın inhibe edilmesidir. Penisilinlerin etki mekanizması peptidoglikan tabaka üzerindedir. İnsan hücresinde peptidoglikan bulunmayışı, peptidoglikan sentezini inhibe eden penisilinleri insana zararsız kılar.. Antimikrobiyal Kemoterapi Bakteri hücrelerinde insan hücrelerinden önemli farklara sahip dört bölge vardır. Bunlar: 1.Hücre duvarı 2.Hücre membranı 3.Ribozomlar 4.Nükleik asit  Antimikrobiyal Kemoterapi Antimikrobiyal ilaçların da etki mekanizmaları temel olarak bu bölgelere yöneliktir ve 4 türlü etki mekanizması olduğu kabul edilmektedir: 1.Hücre duvarı sentezi inhibisyonu 2. Hücre membran fonksiyonu inhibisyonu 3. Protein sentezinin inhibisyonu 4. Nükleik asit sentezinin inhibisyonu.  ANTİBAKTERİYEL İLAÇLAR A-Hücre duvarı sentezini inhibe edenler: A.1.Beta-laktam antibiyotikler A.2.Glikopeptid antibiyotikler Penisilinler Vankomycin Sefalosporinler Teikoplanin Karbapenemler Monobaktamlar A.3.Sikloserin Beta-laktamaz inhibitörleri A.4.Bacitrasin A-Hücre Duvar Sentezini İnhibe eden Antibiyotikler: Beta-laktam Antibiyotikler Penisilinler: Doğal penisilinler Penicillum türlerinden elde edilir. Semisentetik penisilinler de bulunmaktadır. Etki mekanizması: Penisilinler, bakteri hücre duvarındaki peptidoglikan sentezini inhibe ederler. Hücre duvarında penisilin bağlayan protein (PBP) reseptörlerine bağlanırlar. Penisilin etkisi ile bakteri hücrelerinde mürein (peptidoglikan) hidrolaz denilen otolitik enzimler de aktive olurlar ve peptidoglikanı parçalarlar. A-Hücre Duvar Sentezini İnhibe edenler Etki spektrumu: Penisilinler bakteriosidal etkilidirler. Ancak etki göstermeleri için bakterilerin çoğalma döneminde olmaları gerekir. Penisilinler, gram pozitif mikroorganizmaların çoğuna,bazı gram negatif ve anaerobik mikroorganizmalara etkilidir. Penisilin G, bilinen en doğal penisilindir.  A-Hücre Duvar Sentezini İnhibe edenler Sefalosporinler: Sefalosporinler Cephalosporium acremonium dan elde edilirler. Ancak sefoksitin, Streptomyces türlerinden elde edilir. A-Hücre Duvar Sentezini İnhibe edenler Sefalosporinler: Etki mekanizması: Penisilinler gibi bakteri hücre duvarının peptidoglikan sentezini inhibe ederler. Etki spektrumu: Bakterisidal etkilidir. Sefalosporinlerin birinci jenerasyon (dar spektrumlu),ikinci (genişletilmiş spektrumlu), üçüncü (geniş spektrumlu) ve dördüncü jenerasyon gibi çeşitleri vardır. Karbapenemler ve Monobaktamlar da hücre duvar sentezini inhibe eden beta-laktam antibiyotiklerdendir. A-Hücre Duvar Sentezini İnhibe Edenler Glikopeptidler: Vankomycin ve Teicoplanin bu gruba dahildir. Glikopeptid antibiyotikler aerob ve anaerob gram pozitiflere etkilidirler. Metisiline dirençli S.aureus ve koagülaz negatif stafilokokların yol açtığı infeksiyonlarda etkilidirler. Ayrıca penisilin ve sefalosporinlere alerjisi olanlarda kullanılırlar. ANTİBAKTERİYEL İLAÇLAR B-Protein sentezini inhibe edenler: Aminoglikozidler Tetrasiklinler Kloramfenikol Makrolidler B-Protein Sentezini İnhibe Eden Antibakteriyel ilaçlar: Pekçok ilaç, bakterilerdeki protein sentezini insan hücrelerindeki protein sentezine zarar vermeden inhibe edebilmektedir. Bu seçicilik bakterilerdeki ve insanlardaki ribozomal proteinlerin, RNA’nın ve ilgili enzimlerin farklı olmasına bağlıdır. Bakteriler 70S ribozomlara sahiptirler.İnsanlarda ise 80S ribozomlar bulunur. Kloramfenikol, eritromisin,klindamisin,tetrasiklinler ve aminoglikozidler ribozomların alt ünitelerine bağlanarak protein sentezini inhibe ederler.  ANTİBAKTERİYEL İLAÇLAR C-Nükleik asit Sentezini İnhibe eden antibakteriyel ilaçlar Sulfonamidler ve trimetoprim Kinolonlar Rifampin D-Hücre membran sentezini inhibe edenler Polimiksinler E-Etki mekanizması bilinmeyenler İzoniazid Metronidazol C-Nükleik asit Sentezini İnhibe eden antibakteriyel ilaçlar Sulfonamidler,Kinolonlar ve Rifampin bu gruba girer Bu Antibiyotikler bakterilerde DNA’nın sarmal oluşturması için gerekli olan DNA giraz enzimini inhibe ederler. Böylece nükleik asit sentezini engellemiş olurlar. D- Hücre membran fonksiyonunu değiştiren antibiyotikler: Polimiksinler bu gruptadır. Bacillus polymyxa ‘dan elde edilen polipeptid antibiyotiklerdir. Deterjanlara benzer bir şekilde bakteri hücre membranındaki fosfolipidlerle ilişkiye girerek permeabiliteyi arttırırlar ve hücresel bütünlüğü bozarlar. Sonuçta hücre ölümü olur. Gram negatif basillere, özellikle P.aeruginosa’ya etkilidirler E-Etki mekanizmaları bilinmeyen antibakteriyel ilaçlar: İzoniazid: Mycobacterium tuberculosis ve diğer mikobakterilere çok etkili olan bakterisidal bir ilaçtır. Yaklaşık 30 yıldır bilinmesine ve yaygın kullanılmasına karşın etki mekanizması bilinmemektedir. Mikobakterilere etkili olması ve insan organizmasına toksik olmaması nedeniyle muhtemelen mikolik asit sentezini inhibe ettiği düşünülmektedir. Metronidazol:Bakterisidal etkilidir. Anaerobik bakterilere ve protozoonlara etkilidir. ANTİBİYOTİKLER VE DİRENÇ Antibiyotik direnci bakterilerin antibiyotik varlığında dahi üreyebilmeleri ve hastalık yapabilmeleri durumudur. Direnç doğal mutasyonla Antibiyotik Direnci Nasıl Düşürülür Antibiyotikler grip ya da nezlede işe yaramaz, sadece bakteriyel enfeksiyonlarda işe yarar. Grip ya da nezlede iyileşme sürecini kısaltmaz, viruslerin diğer insanlara yayılmasını engellemez. Grip ve diğer viral enfeksiyonlar sırasında alınan antibiyotikler daha sonra gelişebilecek olan bakteriyel enfeksiyonların tedavisini güçleştirebilirir. Antibiyotik almadan önce mutlaka hekime danışılmalıdır. Hasta kendini daha iyi hissetti diye antibiyotik kesilmemelidir. Aksi takdirde bakterilerin hepsi ölmemiş olabilir ve hastalık tekrarlayabilir. ANTİBİYOTİK DİRENÇ MEKANİZMALARI: Antibiyotik modifikasyonu: Bazı bakteriler antibiyotiği kesen veya modifiye eden enzimlere sahiptirler. Örneğin;penisilinaz.. Girişin engellenmesi: Membran antibiyotiğe geçirgen değildir. Antibiyotik girişinden daha hızlı dışarı atılır. Hedefte değişiklik: Hedef yapısındaki değişiklikten dolayı antibiyotik istediği hedefe bağlanamaz. Antimikrobiyal Direnç Gelişimine Neden olan Bazı Faktörler 1. Antimikrobiyalin optimum dozunun altındaki dozlara maruz kalma 2. Gereksiz kullanım 3. Direnç geni taşıyan mikroorganizmalara maruz kalma 4. Konjugasyona uğrayarak direnç özelliği kazanmış mikroorganizmalara maruz kalma  VİRÜS İNFEKSİYONLARINDA ETKİLİ MADDELER Viruslar çoğalmak için konağın pek çok metabolik mekanizmasını kullanırlar. Bu nedenle antimikrobiyal maddeler içinde pek azı konağa zarar vermeksizin viral replikasyonu önleyecek denli seçici etkilidir. Viruslar, antibakteriyel maddelere duyarlı değildirler. Viral enfeksiyonların tedavisinde virusun genomuna,organizasyon simetrilerine ve zarflı olup olmamalarına bağlı olarak kullanılan ilaçlar değişkenlik gösterir. Örneğin;AIDS tedavisinde antiretroviral ilaç kokteylleri kullanılır.Viral hepatitlerin tedavisinde aylarca interferon alfa önerilmektedir.