Mikroorganizmaların İzolasyonu ve İdentifikasyonu PDF

MİKROORGANİZMALARIN İZOLASYON VE İDENTİFİKASYONLARI Öğr. Gör. Dr. Hamiyet ECİROĞLU Sağlık Hizmetleri MYO Tıbbi Laboratuvar Teknikleri Programı Mikrobiyoloji Dersi Konu başlıkları; İnfeksiyon teşhisi 1. Anamnez 2. Klinik bulgular...

MİKROORGANİZMALARIN İZOLASYON VE İDENTİFİKASYONLARI Öğr. Gör. Dr. Hamiyet ECİROĞLU Sağlık Hizmetleri MYO Tıbbi Laboratuvar Teknikleri Programı Mikrobiyoloji Dersi Konu başlıkları; İnfeksiyon teşhisi 1. Anamnez 2. Klinik bulgular 3. Muayene örneği alınması 4. Mikrobiyolojik muayeneler 5. İdentifikasyon a) İzolasyon b) Besiyeri c) Koloni özellikleri İnfeksiyonların Teşhisi İnfeksiyonların teşhisinde aşağıdaki yollar sırasıyla izlenmelidir: 1. Anamnez(hasta öyküsü) 2. Klinik Bulgular 3. Muayene maddesinin alınması 4. Mikrobiyolojik muayeneler 5. İdentifikasyon 1.Anamnez (hasta öyküsü): Anamnez, doktorun ve diğer sağlık çalışanlarının hastaya teşhis koymak ya da mevcut hastalığının durumunu belirlemek için sorular sorarak bilgi almasıdır. Klinik öykü hastaların incelenmesinin en önemli kısmıdır. Örneğin; öksürük öyküsü solunum sistemi infeksiyonuna işaret eder. Az gelişmiş ülkelere yolculuk öyküsü ekzotik mikroorganizmaların etken olabileceğini akla getirir. Hastanın mesleği bazı patojenleri akla getirebilir. Örneğin; kasapta brucelloz, yün eğirende şarbon.. 2.Klinik bulgular Genel semptomlar Klinik semptomlar Özel semptomlar 3.Mikrobiyolojik Muayene Maddesinin Alınması: Maddeler hasta canlı iken (biyopsi) alınabilir. Öldükten sonra (otopsi) alınabilir. Muayene maddesi alınma kriterleri şunlardır: Muayene maddeleri çok taze olmalı ve yeteri miktarda alınmalıdır. Hastadan,ateşli dönemde materyal alınması tercih Ölüm olgularında hemen ve zaman geçirmeden şüphelenilen veya lezyonlu doku ve organlardan aseptik koşullarda ve yeterince materyal alınır. 3.Muayene Maddesinin Alınması Materyaller Antibiyotik veya kemoterapötik maddeler verilmeden ya da Antibiyotik tatbikinden önce alınmalıdır. Muayene maddeleri aseptik koşullarda alınmalı ve steril kaplara konarak hemen soğukta muhafaza edilmelidirler. Alınacak materyalin türü hastalığın karakterine göre değişir. 3.Muayene Maddesinin Alınması Materyaller alındıktan sonra, laboratuar yakınsa vakit kaybetmeden laboratuara göndermelidir. Eğer laboratuvar uzaksa dondurulduktan sonra termoslar içinde en seri vasıta ile sevk edilmelidirler. Bakteriyolojik, mikolojik ve virolojik yoklamalar için kullanılan muhafaza kaplarının steril olması gerekir. Boğaz kültürü örneği; Hemokültür/Kan Kültürü; Eküvyon; arka farinks, küçük dil, Bakteriyemi, septisemi tonsillalar, lezyonlu bölgeye şüphelerinde ateş yükselmeye sürülür. başladığı dönemde alınır. Alınan örnek hemen ekilir. Ekilemeyecekse SF ya da %1 Eldiven giyilmeli glukozlu buyyon içine alınır. (Oda ısısı ya da +4 0C ) Koldan 10 ml kan (pediatrik 1- 5 ml) En çok ; Akut farenjit (A gr. Β hemolitik strep.) Bactec 13A kültür şişesi Membranöz farenjit (C. Diphtherieae) Tonsiller apse (S. aureus) Epiglodit (H. İnfluenza) Pediatrik-aerop-anaerop Gaita Örneği; Yara Örneği; Makroskobik, mikroskobik Makroskobik, mikroskobik ve ve besiyerine ekim yapılarak besiyerine ekim yapılarak incelenir. incelenir. Steril, geniş ağızlı sızdırmaz Vezikül, bül, lezyonlardan kaplara alınır. iğne ile aspirasyonla örnek alınır. BOS örneği; Menenjit ve ensefalitte Lomber Ponksiyon (LP) BOS steril tüplere alınır. Direkt preperat, hücre sayımı, pereperat, kültür Balgam Örneği; Kulak Kültürü; Genelde M. tuberculosis aranır. Önce lezyon antiseptikle Makroskobik, mikroskobik ve steril edilir. besiyerine ekim yapılarak Lezyon iğne ya da lansetle incelenir. açılır, eküvyonla örnek alınır. Hasta bilgilendirilir, Bol sıvı alması sağlanır. Örnek vermeden önce ağzı bol su ile çalkalanmalıdır. Burun Kültürü; Mümkünse sabah aç karna Steril eküvyon burun alınmalıdır. deliğinden 2-2,5 cm içeriye 3 ml balgam, steril santrifüj tüpü sürülerek örnek alınır. En uygunu3 gün üst üste alınmasıdır. Vajen ve meni örneği; İdrar örneği; Makroskobik, mikroskobik ve Kültür için sabah ilk idrar ya da besiyerine ekim yapılarak en az 3 saat bekletilmiş idrar incelenir. uygundur. Genital yol enfeksiyonlarında Örnek kontamine olmamalıdır!! gerekli inceleme materyali ilgili Hastalar bilgilendirilmeli: önce uzman hekim tarafından idrar çıkışı sağlanmalı, ardından alınmalıdır. idrar kabına 5-10 ml idrar Hemen ekim yapılmalıdır. alınmalıdır. Ekim yapılamayacaksa, en fazla oda ısısında 24 saat bekleyebilir. 4. Mikrobiyolojik Muayeneler Mikrobiyolojik tanı yöntemleri 8 kısımda incelenir. Bunlar: 1. Bakteriyolojik tanı yöntemleri 2. Mikolojik tanı yöntemleri 3. Virolojik tanı yöntemleri 4. Parazitolojik tanı yöntemleri 5. İmmunolojik ve serolojik yoklamalar 6. Faj testleri 7. Deney hayvanlarına inokulasyon 8. Biyoteknolojik tanı yöntemleri Bakteriyolojik Tanı Yöntemleri 1. Makroskobik inceleme: Hasta materyalinin direkt muayenesi 2. Direkt mikroskobik inceleme: Boyalı/boyasız inceleme Kültür sonucunu beklemeden tedaviye başlama imkanı Hızlı ve ucuz bir yöntem Tanı koymanın ilk basamağıdır 3. İzolasyon ve identifikasyon Kültür Gram boyama Bakteri tiplendirmesi Antibiyotik duyarlılık testi Dezavantaj; Karışık örneklerde etkeni ayırmak güçtür..  Klinik örneklerin mikrobiyoloji tanı laboratuvarında bakteriyolojik tanı amacıyla işlenme algoritması: Bakteriyel tanı Numunenin makroskobik/ mikroskobik incelenmesi izolasyon İdentifikasyon  İZOLASYON İzolasyon: Ayırmak Mikrobiyolojide izolasyon: Bir mikroorganizmayı saf olarak elde etmek. İn Vivo: Canlı organizma içinde ve üzerinde yapılan çalışmalarda kullanılan bir terimdir. İn vitro: Laboratuvar ortamında yada yapay koşullarda yapılan çalışmalarda kullanılan bir terimdir. İzolasyon Kültür: Besleyici ortamlarda üretilmiş olan mikroorganizmaların tümüne denir. Kültür yapmak:Mikroorganizmalar uygun çevre koşulları sağlanarak in vivo veya in vitro ortamlarda üretilirler.Bu işleme kültür yapmak denir. Saf Kültür:Tek bir mikroorganizmanın üremesi sonucu oluşan kültüre denir. Suş: Tüm özellikleri belirlenmiş saf kültüre suş (köken) denir.  İzolasyon İnokulum: Besiyerine ekimi yapılan örneğe inokulum, bu işleme inokulasyon denir. İnkübasyon: Bir mikroorganizmanın gelişmesini tamamlaması için belirli sıcaklık ve belirli atmosfer ortamında tutulma işlemi. Besiyeri: Mikroorganizmaların gelişmesi ve çoğalması için gerekli maddeleri içeren in vitro ortamlardır. Bakterilerin Besiyerinde Üretilmesi: Kültür Kesin mikrobiyolojik tanı: kültür Gönderilen muayene maddelerinden araştırılması istenen hastalık yönünden normal veya özel katı ve sıvı besiyerlerine ekim yapılır. Kültürler optimal ısı derecesinde ve araştırılan hastalık etkeninin karakterine göre; *Aerobik, mikroaerofilik veya anaerobik koşullarda uygun bir süre inkübasyonda bırakılır.  Besiyeri bileşimine giren maddeler Pepton: Parçalanmış, sindirilmiş proteinlerdir. Enerji, C, N kaynağı. Na,K,Cl, Mg,Fe,Zn,Mn,Cu gibi elementler İndikatörler:Fenol kırmızısı, fuksin, metil kırmızısı Kan: Hem besiyerini zenginleştirmek,hem de mikroorganizmaların hemolitik aktivitesini belirlemek amacıyla besiyerine ilave edilir. Agar,: glikozid yapıda, 420C donma, 950C de erime Maya ekstraktı Su Besiyeri her zaman +40C , +80C de saklanır.  Besiyerleri steril koşullarda ve dikkatli bir şekilde hazırlanmalıdır. Besiyeri saklama ve tesliminde dikkat edilmesi gerekenler: Son kullanma tarihi Bozulmuş bir yapı olup olmadığı Kırılmış-akmış ürün Kontamine olmuş ürün kontrol edilmelidir. Besiyeri her zaman +40C , +80C de saklanır.  Besiyeri çeşitleri A.Fiziksel özelliklerine göre besiyerleri: 1.Sıvı besiyeri 2. Yarı-katı besiyeri 3. Katı besiyeri olarak sınıflandırılır. Besiyeri çeşitleri: Sıvı Besiyeri Sıvı besiyerindeki kaynakların tümünden yararlanabildiklerinden mikroorganizmalar sıvı besiyerlerinde daha yoğun ürerler. Sıvı besiyerinde üreme; tortu, zar oluşturma, bulanıklık , renk değişimi şeklinde gözlenir.  Besiyeri çeşitleri: Katı besiyeri Katı besiyerlerinde bakterilerin üretilmesinin amacının ötesinde türlerinin ayırt edilmesi, saf kültür elde etme olanaklarını sağlar. Bir bakterinin katı besiyerinde çoğalarak oluşturduğu topluluğa koloni denir. Düşük agar yoğunluğu içeren yarı katı besiyerleri mikroaerofillerin üretilmeleri, mikroorganizmaların hareket özelliklerinin araştırılması gibi amaçlarla kullanılır. B. Kullanım amaçlarına göre besiyerleri 1. Temel(genel-basit) besiyerleri 2. Seçici (selektif) besiyerleri 3. Zenginleştirici besiyerleri 4. Ayırt edici besiyerleri 5. Transport besiyerleri 6. Saklama besiyerleri 7. Özgül Besiyeri  1.Temel (genel,basit) besiyerleri Çok sayıda mikroorganizma grubunun üremesini sağlar. Örn: Buyyon İçerik: Pepton + Tuz + Su ya da Et suyu + Pepton + Tuz + Su Buyyona agar eklersek, katı besiyeri elde ederiz. 2. Seçici besiyerleri Birden fazla mikroorganizma türü içeren klinik örneklerde, gelişmesi istenmeyenleri baskılayan çeşitli inhibitör maddeler içerir. Belli MO’ların seçilerek üremesini sağlar. Seçicilik özelliği: Özel enerji ve karbon kaynaklarının ilavesi, ph ve oksijen yoğunluğunun ayarlanması , bazı boyalar ve antibiyotiklerin ilavesi ile.. Örneğin, MacConkey agar (Gram (-) bakteriler için seçicidir), Selenit-F (Dışkı örneklerinde Salmonella ve Shigella)… Dışkı, idrar, yara, atık su ve gıda örneklerinden koliform bakteriler yanında Salmonella ve Shigella izolasyonu için de kullanılır.  MacConkey Agar Laktoz içerir Safra tuzları ve Kristal viyole seçicilik sağlar( Gr + leri baskılar). PH indikatörü: Nötral kırmızısı (pH'sı 7,1±0,2'dir.) Laktoz pozitifler: Kırmızı koloni Laktoz negatifler:Renksiz ve/veya saydam koloni Gram-negatif ve enterik bakterileri seçici olarak izole etmek ve bunları laktoz fermentasyonuna göre ayırt etmek için tasarlanmıştır.  MacConcey Agar Besiyeri Koloni Görünümü Mikroorganizmalar Renksiz, yarısaydam Salmonella, Shigella ve diğerleri Büyük, kırmızı, etrafı bulanık zon ile çevrili Escherichia coli Büyük, pembe, mukoz Enterobacter, Klebsiella Çok küçük, opak, tek koloniler Enterococci, Staphylococci ve diğerleri 3. Zenginleştirici Besiyerleri Zenginleştirici besiyerleri çok zor üreyen MO’ları üretmek için kullanılır. Besi ortamına eklenen kan, serum, glikoz, beyin, kalp ektratı gibi maddelerle besiyeri zenginleşir. Brusella spp. Stretococcus spp. Haemophilus spp. Naisseria spp. gibi bakteriler için çeşitli zenginleştirici besiyerleri kullanılır. Örneğin, Haemophilus influenza koyun kanlı ya da çikolata agarda ürer. 4. Ayırt edici(diferansiyel) besiyerleri İçerdikleri ayıraçlar sayesinde, benzer bakterilerin farklı koloniler oluşturmasını sağlayan besiyerleridir. Örneğin koyun kanlı agar, EMB agar gibi..Üreyen bakterilerin oluşturduğu kolonilerin aldıkları renge göre organizmaları ayırt etmek mümkündür. EMB agar  EMB(Eozin Metilen Blue) Agar İçerik: Peptone, Lactose, K2HPO4, Eosin , Methylene blue, Agar. Laktoz ve boyalar ile Gr+ bakt baskılar. Eozin ve metilen mavisi seçiciliği sağlar. PH indikatörü: Eozin ve Metilen mavisi Laktoz pozitifler: Mor-Siyah koloniler Laktoz negatifler: Şeffaf koloniler. Koloni görüntüsü Mikroorganizma 2-3 mm çaplı, metalik yeşil parıltılı, Escherichia coli koyu ve siyah merkezli 4-6 mm çaplı, gri-kahverengi merkezli Enterobacter Saydam, amber renkli Salmonella ve Shigella Renksiz, toplu iğne başı büyüklüğünde Koagülaz pozitif stafilokoklar  Koyun Kanlı Agar Zor üreyen mikroorganizmaların geliştirilmesi ve hemoliz reaksiyonlarının belirlenmesi amacıyla. İçerik: Pepton, NaCl, koyun kanı pH'nın 6,8 olması hemoliz reaksiyonunun belirgin olmasını sağlar. Patojenler Hemolitik ve non hemolitik özellikleri ile değerlendirilir. salmonella Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes 5. Transport (taşıma) besiyerleri Klinik numunelerin incelenecek laboratuar ortamına ulaştırılırken içerdiği bakterilerin canlı kalmasını sağlayan yarı katı besiyerlerdir. Amies transport agar örnek verilebilir. 6. Saklama Besiyerleri İzole edilen mikroorganizmaların uzun süre saklanabilmesi için saklama besiyerleri kullanılır. Örneğin, gliserollü brusella sıvı besiyerine ekimi yapılan bakteriler -20◦C’de uzun süre saklanabilir.  7. Özgül Besiyeri Yalnız bir tür veya bir cins ya da sınırlı sayıda MO üretilebilmesi için hazırlanan besiyerleridir. Mycobacterium tüberculosis- Löwenstein-Jensen Besiyeri Örneklerin Besiyerine Ekim Yöntemleri Tüpte sıvı besiyerine ekim: tüp eğik tutulur, öze ile yavaşça karıştırılır. Materyal katı ise önce duvarda dairesel hareketlerle materyal bırakılır. Tüpte Yatık Katı besiyeri: İğne uçlu öze kullanılır. Alınan materyal dikkatli bir şekilde dipten uca doğru zikzak içerek çekilir. Tüpte dik hazırlanan katı besiyeri: iğne uçlu öze ile besiyerine batırılıp çekilir.  Plak(katı) besiyerine ekim seyrelterek BAKTERİLERİN KOLONİ ÖZELLİKLERİ Büyüklük:Genelde 1-4 mm çapında olur. Ama bazı bakteriler Üroplazma örneğinde olduğu gibi gözle görülemeyecek denli küçük koloniler oluşturur. Bakterilerin Koloni Özellikleri Renk:Hücre içi pigment oluşturan bakterilerin kolonileri bu pigmentin renginde olur. Örneğin Staphylococcus aureus konileri altın sarısı renktedir.  Bakterilerin Koloni Özellikleri Koku: Bazı bakteri kolonileri kokuludur. Örneğin Proteus kültürleri oluşturdukları ürünler nedeni ile lağım kokusu gibi kokar. Pseudomonas aeruginosa ise sabun kokusu oluşturur. Bakterilerin Koloni Özellikleri Hemoliz özelliği:Kan içeren besiyerlerinde bu özellik araştırılır. Bazı bakteriler eritrositleri hücre dışı enzimleriyle parçalayarak koloni çevresinde şeffaf bir zon oluştururlar (beta hemoliz). Bazı bakteriler ise hemoglobini tam olarak parçalayamadıklarından tam olmayan hemoliz yada alfa hemoliz yaparlar.Koloni etrafında yeşil bir renk değişimine sebep olurlar. Hemoglobin üzerine etkisi olmayan bakterilerse hemoliz oluşturmazlar (gamma hemoliz). Alfa-beta-gamma hemoliz Koloni tipleri S (Smooth) koloni: Düzgün, kenarlı, yuvarlak, homojen görünümlü hafif kabarık kolonilerdir. Klinik önemi olan bakterilerin çoğu S tipi koloni oluşturur. Çünkü koloniye S tipi özelliğini veren bakteri hücresinin yüzey elemanlarıdır. Gram (-) lerde dış membrandaki polisakkarid zincirler, Gram (+) lerde kapsül bu özelliği sağlar. Koloni tipleri R (Rough) koloni: Düzgün olmayan, kenarları girintili çıkıntılı,yüzeyleri buruşuk veya granüllü kolonilerdir. Bacillus anthracis ve Mycobacterium tuberculosis kolonileri bu tiptir. Normal koşullarda S ve M tipi koloni oluşturan türler uygun olmayan veya eskimiş kültürlerde R tipi koloni yaparlar. R şekline geçen kolonilerdeki bakterilerde genelde virülansta azalma söz konusudur. Bacillus antracis Koloni tipleri M (Mukoid) koloni: Polisakkarit kapsülü olan bakteriler Örneğin Klebsiella pneumoniae, uygun koşullarda yapışkan, düzgün, parlak koloniler oluşturarak ürer. Kapsüler materyalden dolayı öze ile dokunulduğunda koloni iplik gibi uzar. Koloni tipleri L tipi koloni:Hücre duvarı bulunmayan bakteriler Örneğin Mycoplasma, Üreoplazma türleri çok küçük ancak büyüteç ile görülebilen koloniler oluşturur. Yüzeyleri kabarık, granüllü, besiyeri içerisine uzantı yapan bu kolonilerin görünümü sahanda yumurta olarak tanımlanır. Koloni tipleri S R L M