Biomarcatori Proteomici PDF

Lezione 5 BIOMARCATORI PROTEOMICI A.A. 2023-2024 Biomarcatori Proteomici Proteine del Plasma Le proteine del plasma costituiscono un gruppo eterogeneo di proteine, con funzione specifica o diverse funzioni e la cui concentrazione (da pochi microgramm...

Lezione 5 BIOMARCATORI PROTEOMICI A.A. 2023-2024 Biomarcatori Proteomici Proteine del Plasma Le proteine del plasma costituiscono un gruppo eterogeneo di proteine, con funzione specifica o diverse funzioni e la cui concentrazione (da pochi microgrammi ad alcuni grammi per litro) è soggetta a specifiche variazioni in diverse condizioni fisiologiche e patologiche. Gli intervalli di riferimento normali per le PROTEINE TOTALI PLASMATICHE sono tra 63 e 84g/L. Tali valori non sono costanti ma differiscono per età, sesso, momento della giornata, stato di veglia o di sonno, esercizio fisico, stagioni calde e stagioni fredde. I livelli plasmatici fisiologici dipendono dalla sintesi, dal catabolismo, dalla diminuzione delle proteine nei vari compartimenti corporei e da perdite esterne. Le plasmaproteine vengono sintetizzate principalmente dal fegato, in particolare l’albumina, il fibrinogeno e le globuline, ad eccezione delle immunoglobuline che vengono prodotte dal sistema immunitario (plasmacellule). Contribuiscono alla sintesi anche l’intestino per le lipoproteine ed il sistema monocito/macrofagico per alcuni fattori del complemento. Il metabolismo delle proteine è rapido ed intenso: viene giornalmente rinnovato, in condizioni fisiologiche, il 9% di tutte le proteine sintetizzate dal fegato ed il 10-25% di quelle circolanti. Anche nel catabolismo gioca un ruolo fondamentale il fegato. In condizioni fisiologiche, le perdite (esterne) avvengono attraverso l’apparato gastroenterico (tutte le proteine), il rene (selettivo), le ghiandole esocrine, l’apparato respiratorio e gli organi genitali. Biomarcatori Proteomici Classificazione In base alla funzione Trasporto  di nutrienti: albumina, lipoproteine;  di ioni metallici: trasferrina, ceruloplasmina;  di ormoni (TBG, transcortina);  altro… (aptoglobina). Difesa: complemento, immunoglobuline, inibitori enzimatici, proteine della fase acuta; Emostasi e coagulazione: fibrinogeno, plasmina. In base alla migrazione elettroforetica Pre-albumina, albumina, alfa1-, alfa2-, beta1-,beta2-, gamma-globuline globuline Biomarcatori Proteomici Analisi delle Proteine del Plasma Caratteristiche chimiche: proteine semplici, glicoproteine, lipoproteine Caratteristiche chimico-fisiche: solubilità, sedimentazione, carica elettrica Metodi quantitativi Metodi qualitativi Frazionamento (precipitazione frazionata con sali o solventi organici) Tecniche immunochimiche (nef-turb) Immunofissazione Per ultracentrifugazione Migrazione elettroforetica (massa, forma, densità, Immunoelettroforesi coefficiente di frizione) e. bidimensionale Biomarcatori Proteomici Metodi Qualitativi: elettroforesi zonale Le proteine sono sostanze anfotere, cioè si possono comportare da acido, liberando ioni H+, o da base liberando anioni OH-. Inoltre modificano le cariche elettriche dei loro residui chimici ionizzabili a seconda del mezzo in cui sono sciolte. In soluzione sono facilmente ionizzabili e si dissociano in ioni R- COO- (Asp, Glu) o ioni R-NH3+ (Lys, Arg). + - le proteine sono evidenziate mediante una colorazione specifica e la loro composizione percentuale è misurata mediante densitometria (protigramma). Biomarcatori Proteomici Metodi Qualitativi: elettroforesi zonale Su GEL di AGAROSIO Soluzione 0,8% di agarosio in tampone a pH 8.7; Campione diluito 1:1 con il tampone contenente 0,1% di blu di bromofenolo (indicatore della corsa); Post corsa: Fissazione e colorazione (0,1% Blue Comassie in metanolo – acqua – acido acetico (45:45:10 in volume). Su ACETATO DI CELLULOSA Tampone veronal-acetato pH 8.7 Post corsa: Fissazione: TCA 10% Colorazione: Rosso Ponceau o Amido Black 0.5% per 10-20 min. Biomarcatori Proteomici CLASSIFICAZIONE DELLE PROTEINE SELEZIONATE IN BASE ALLA MOBILITA’ ELETTROFORETICA 1. banda della prealbumina prealbumina 2. banda dell’albumina albumina 3. banda 1 1-antitripsina 1-glicoproteina acida 1-antichimotripsina 1-lipoproteina (HDL) 1-fetoproteina. 4. banda 2 Mobilità anodica 2-macroglobulina (anodica) aptoglobina (catodica) ceruloplasmina proteina legante la vit.D (globulina GC) 5. banda 1 transferrina 1-lipoproteine (LDL) 6. banda 2 C3 2-microglobulina emopessina fibrinogeno (talvolta in zona ) 7. zona  immunoglobuline (IgM ed IgA talvolta in zona 2) Biomarcatori Proteomici Biomarcatori Proteomici Uso clinico delle proteine plasmatiche Gli intervalli di riferimento normali per le proteine del siero sono: 63 e 84g/L: Iperproteinemia > 90 Ipoproteinemia < 60 Aumento:  emoconcentrazione,  gammopatie mono e policlonali. Diminuzione:  Insufficiente apporto: digiuno prolungato, dieta ipoproteica;  Ridotto assorbimento: vomito, diarrea, sindromi da malassorbimento;  Perdita: sindrome nefrosica, enteropatie, ustioni estese, emorragie;  Ridotta sintesi: epatopatie acute e croniche;  Ipercatabolismo: ipertiroidismo, febbre, infezioni acute, traumi, interventi chirurgici, neoplasie;  Emodiluizione: emorragie profuse, scompenso cardiaco congestizio, terapie idratanti; Emoconcentrazione: Aumento della concentrazione del sangue per accrescimento numerico, assoluto o relativo, dei globuli rossi. Può verificarsi per eccessiva produzione dei corpuscoli del sangue della serie rossa (morbo di Vaquez, eritremie), in seguito a fuoriuscita di plasma dai vasi (come nello shock), oppure a forte disidratazione dell’organismo. Biomarcatori Proteomici Uso clinico delle proteine del siero Biomarcatori Proteomici Proteine della fase acuta Le Proteine di fase acuta sono proteine presenti nel plasma sanguigno la cui concentrazione aumenta (proteine positive di fase acuta) o diminuisce (proteine negative di fase acuta) in presenza di infiammazione. Insieme alla febbre, alla leucocitosi e ad altre manifestazioni quali tachicardia, ipertensione, brividi, anoressia e malessere costituiscono la cosiddetta reazione di fase acuta. AUMENTO DIMINUZIONE Proteina C reattiva Albumina Α1-antitripsina, Transferrina chimotripsina, Pre‐albumina GP acida Ceruloplasmina Aptoglobina C3 e C4, Antitrombina III, Indicazioni cliniche: Immunoglobuline Presenza di malattie infiammatorie Diagnosi differenziale tra patologie infiammatorie croniche Follow-up post-chirurgico nei pazienti a rischio Post operatorio infettivo Follow-up dei pazienti oncologici Biomarcatori Proteomici Singole frazioni proteiche PREALBUMINA o TRANSTIRETINA: sintesi in parte nel fegato, in parte anche nella retina ed in altri tessuti. E’ il vettore sia per la tiroxina che per la proteina legante il retinolo. E’ una proteina negativa della fase acuta. ALBUMINA: MW 66,5 kDa. Il dosaggio dell’albumina è un ottimo indice della funzionalità epatica. E’ una proteina di trasporto (bassa specificità ed affinità, farmaci, bilirubina, acidi grassi, metalli ed ormoni). Contribuisce alla pressione oncotica/osmotica. La concentrazione plasmatica dell’albumina diminuisce nei processi infiammatori, ustioni, epatopatie e nefropatie, malassorbimento, enteropatie protido‐dispersive. Biomarcatori Proteomici BANDA  11-ANTITRIPSINA: GP*. In circolo costituisce la maggiore componente delle proteasi circolanti. E’ sintetizzata dagli epatociti in forma immatura, dai macrofagi ma anche in altri tessuti (rene, pancreas, stomaco, intestino, milza, surrene). 1-ANTICHIMOTRIPSINA: GP. Inibisce la chimotripsina pancreatica. Protegge l’organismo dai processi infiammatori (polmoni e bronchi) e dai danni tessutali, modula la risposta immune proteggendo da reazioni allergiche. Uno sdoppiamento raro della banda può essere dovuto ad elevati livelli di 1- fetoproteina, i quali, dopo il secondo anno di vita, sono indicatori di epatiti evolutive, carcinoma epatico BANDA  2 2 MACROGLOBULINA: GP. Sintetizzata dal fegato. Modulatore delle attività delle citochine. Aumenta fisiologicamente nel III trimestre della gravidanza, nell’infanzia e nell’età avanzata. Aumenti patologici si hanno nell’infiammazione acuta, nelle epatopatie, nel diabete. APTOGLOBINA: GP. Lega l’emoglobina libera (in modo forte ed irreversibile). La sua concentrazione aumenta dalla nascita fino all’età adulta. Diminuisce per iperconsumo in tutti i casi di emolisi intravascolare e per difetto di sintesi in condizione di riduzione del numero di epatociti. Può diminuire anche in seguito a sport prolungati, che comportano distruzione di eritrociti. E’ una proteina della fase acuta. CERULOPLASMINA: GP. Maggiore proteina di trasporto plasmatico del rame. La sua sintesi avviene nel fegato. Diminuisce nel morbo di Wilson. PROTEINA TRASPORTATRICE DELLA VITAMINA D *GP: globuline Biomarcatori Proteomici BANDA 1 TRANSFERRINA: GP. Lega e trasporta in modo reversibile lo ione ferrico. Aumenta nelle sideropenie e diminuisce negli accumuli di ferro. Le funzioni principali della transferrina sono:  trasporto di ferro assorbito dall’intestino alle cellule che lo richiedono;  fattore protettivo contro cellule batteriche e neoplastiche in quanto compete con esse per l’utilizzo di ferro. BANDA 2 C3: proteina della fase acuta che si eleva molto lentamente e richiede 2-10 giorni per raggiungere il massimo livello dopo un’infiammazione. EMOPESSINA: GP. Lega il gruppo eme libero in rapporto 1:1 e lo trasporta al fegato, dove l’eme entra nella cellula e libera il ferro riutilizzato. 2-MICROGLOBULINA: costituisce la catena leggera degli antigeni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e si trova sulla superficie di tutte le cellule che esprimono questo antigene. Biomarcatori Proteomici ZONA  E’ costituita dalle diverse classi delle immunoglobuline. A causa della loro eterogeneità, le immunoglobuline si estendono dalla regione  a quella  e talvolta occupano anche la zona . Le Ig sono l’espressione dell’attività secretoria di diversi cloni plasmacellulari Le immunoglobuline sono IgG IgA Le catene leggere di ogni classe di Ig sintetizzate dalle plasmacellule. possono essere tipo  (65%) e di tipo  In ordine di frequenza nel siero IgM IgD (35%) si hanno: IgE Biomarcatori Proteomici ZONA  AGAMMAGLOBULINEMIA IPOGAMMAGLOBULINEMIA Malattia genetica legata al sesso Più frequenti quelle acquisite. Negli adulti e negli anziani deve far sospettare una malattia immunoproliferativa Colpisce i soggetti maschi in età (linfoma) infantile Biomarcatori Proteomici ZONA  Ipergammopatia Policlonale L’aumento policlonale di una classe di Ig si manifesta come un incremento di colore in zona -  rilevato come slargamento del picco nel  protidogramma. Ipergammopatia Monoclonale La presenza di una componente monoclonale si evidenzia con la comparsa in zona -  di una banda stretta, la quale può essere rilevata come picco al densitogramma quando presente al di sopra di 1g/L. Albumina Globuline α1 α2 β1 β2 γ Biomarcatori Proteomici Ipergammaglobulinemie Policlonali Infezioni Virali Tumori Solidi: neoplasie ovariche, tumore polmonare, HCV, HBC, HIV, mononucleosi, varicella epatocarcinomi,tumori renali, neoplasie gastriche Infezioni batteriche Malattie Ematologiche Endocarditi, osteomieliti, batteriemia, Leucemie, Linfomi Tubercolosi Talassemia, Anemia Falciforme Malattie autoimmuni Malattie Polmonari Lupus eritematoso sistemico (LES) Bronchiectasie, Fibrosi Cistica, nbronchiti croniche, Artrite Reumatoide Sarcoidosi polmoniti Colite Ulcerosa/Morbo di Crohn’s Malattie Epatiche Endocrinopatie Epatiti croniche post virali Malattia di Graves, Tiroidite di Hashimoto Cirrosi Epatica post-virale, alcolica, primitiva biliare Colangite primitiva sclerosante Biomarcatori Proteomici Ipergammaglobulinemie Monoclonali La proliferazione di un singolo clone plasmacellulare con produzione di un’unica classe, sottoclasse, idiotipo di immunoglobulina, detta monoclonale. La presenza di Ig patologiche si mette in evidenza all’elettroforesi del siero come una banda netta che nella maggior parte dei casi si trova in zona , da qui il nome di gammopatia monoclonale alla malattia e di componente monoclonale della proteina (CM). Il termine CM si riferisce quindi a qualunque banda immunoglobulinica che presenti le caratteristiche d’una mobilità elettroforetica e sia costituita da un solo tipo di catena pesante e da un solo tipo di catena leggera. Nella popolazione generale la presenza di CM ha frequenza di 1-2% >25 anni e 3-7% > 70 anni. Il rischio di progressione in mieloma è dell’1% all’anno. Biomarcatori Proteomici Ipergammaglobulinemie Monoclonali: diagnosi differenziale Gammopatia monoclonale di significato indeterminato (MGUS):  primitiva  secondaria Mieloma Multiplo  Smoldering myeloma  Plasma cell leukemia  Mieloma micromolecolare  Mieloma non-secernente  Mieloma osteosclerotico (POEMS: polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, M protein, skin changes) Plasmocitoma solitario  osseo  extraosseo Biomarcatori Proteomici Ipergammaglobulinemie Monoclonali: diagnosi differenziale Macroglobulinemia di Waldenström Amiloidosi  primitiva (AL)  secondaria Malattia da catene pesanti (HCD)   HCD   HCD   HCD Crioglobulinemie Linfoma maligno Biomarcatori Proteomici Ipergammaglobulinemie Monoclonali: caratterizzazione della componente monoclonale Per il DOSAGGIO IN FASE LIQUIDA si possono usare la nefelometria (reazione Ag-Ab con deviazione del fascio di luce del nefelometro (scatter) tanto maggiore quanto più numerosi e più grandi sono i complessi e quindi la concentrazione della proteina) o la turbidimetria (tecnica in assorbimento che utilizza un normale spettrofotometro). Per il DOSAGGIO IN SITU si utilizza l’immunofissazione. Consiste nel fissare le CM (catene pesanti e leggere) in situ (lastrine di agarosio) mediante specifici antisieri e poi colorarle dopo aver rimosso tutte le altre bande non fissate, permettendo l’identificazione di una banda. Biomarcatori Proteomici MIELOMA MULTIPLO Il mieloma multiplo è la forma più comune di neoplasia plasmacellulare nell’uomo. Produce in genere un’immunoglobulina monoclonale ed un eccesso di catene leggere libere (proteinuria Bence Jones). Le Ig possono appartenere a tutte le classi di Ig con frequenza corrispondente al loro normale contenuto serico. Biomarcatori Proteomici