Chapitre 4 : Contrôle qualitatif et quantitatif des médicaments PDF

Chapitre 4 : Contrôle qualitatif et quantitatif des médicaments 4.3. Contrôle de qualité des matières premières : principes actifs conventionnels 4.3.1. Identification Spectrophotométrie IR Rappels théoriques : Dans l’IR lointain (hc/𝜆 très petite), un photon incident sur une molécule n’aura qu’un effet très faible sur celle-ci : on aura des modifications des énergies de rotation de la molécule qui sont quantifiées. Dans l’IR moyen et proche (hc/ 𝜆 un peu plus élevée), un photon incident modifiera les énergies de rotation et en plus de vibration. Ces énergies de vibration sont également quantifiées. - Modification des énergies d’oscillation des longueurs de liaisons = interactions de valence - Modification des énergies d’oscillation des angles entre les liaisons = interactions de déformation. Unités utilisées : 4000 cm–1 à 650 cm–1 en nombre d’onde a) Equipement : Les spectromètres IR les plus courants fonctionnent sur le principe de la transformée de Fourier (FT-IR) ; ils comprennent typiquement : - Une source lumineuse polychromatique appropriée (filament céramique, par exemple), - Un interféromètre, - Un dispositif de présentation de l'échantillon (porte-échantillon, par exemple), - Un détecteur, - Un logiciel approprié assurant le pilotage de l'instrument ainsi que l'évaluation spectrale et le traitement des données. On utilise la spectrophotométrie IR en industrie et en hôpital pour un usage qualitatif (technique pour identifier les matières premières car chaque bande est caractéristique d’un élément donné), c’est donc une empreinte digitale selon la position des bandes. b) Modes de mesure : - Mesure en transmission : Détermination de la transmittance T, c'est-à-dire la capacité de l'échantillon à transmettre le rayonnement IR, à une longueur d'onde (nombre d'ondes) donnée. Le spectre résultant est la représentation de la transmittance T (en ordonnée) en fonction de la longueur d'onde ou du nombre d'ondes (en abscisse). Il peut également porter l'absorbance A en ordonnée, qui est liée à la transmittance T par l'équation suivante : - Mesure en réflexion totale atténuée (ATR) c) Contrôle des performances de l’équipement : Au moyen d’un film de polystyrène - Contrôle de l’exactitude de l’échelle de nombres d’onde : cette vérification est typiquement effectuée au moyen d'un film de polystyrène présentant des bandes d'absorption dans l'IR aux nombres d'ondes indiqués dans le tableau suivant. - Contrôle de la résolution spectrale : spectres enregistrés en mode transmission. La vérification de la résolution spectrale est typiquement effectuée au moyen d'un film de polystyrène d'environ 35 μm d'épaisseur. Critères d'acceptation → la différence d'absorbance entre le minimum d'absorption de 2870 cm-1 (A) et le maximum d'absorption de 2849,5 cm-1 (B) est supérieure à 0,33. La différence d'absorbance entre le minimum d'absorption de 1589 cm-1 (C) et le maximum d'absorption de 1583 cm-1 (D) est supérieure à 0,08. - Contrôle de la résolution spectrale : spectres enregistrés en mode ATR. Il est nécessaire de définir des critères d'acceptation appropriés pour le contrôle de la résolution spectrale en fonction des spécifications de l'instrument utilisé. d) Procédure : préparation de l’échantillon : - Mesures en transmission Solide : pastille (le + souvent) de KBr ou KCl (1-2 mg PE dans 300-400 mg KBr ou KCl) ! Qualité KBr/KCl extra pur pour IR (compression 800 MPa) Contrôle : T (λ = 5 μm ou nbre d’onde = 2000 cm-1) > 60% - Mesures en ATR (préparation bien plus simple, lui qu’on choisit quand on a le choix) Solide : pour assurer un contact étroit et uniforme entre échantillon et cristal sur toute l'interface, on peut soit appliquer une pression, soit dissoudre la substance dans un solvant approprié puis recouvrir le cristal avec la solution obtenue et évaporer à siccité (on veut un échantillon transparent). e) Identification : Par comparaison du spectre de la substance à examiner avec le spectre de la SCR de la Ph.Eur. OU spectre de référence de la Ph.Eur. Pour identifier une matière première par IR, on compare le spectre IR de la substance à examiner avec le spectre IR de la substance chimique de référence ou, si non disponible, par achat du spectre de référence à la pharmacopée (alors faire attention que les conditions expérimentales doivent être aussi appliquées pour l’enregistrement du spectre de la substance à examiner). → Comparaison visuelle de la position et de l'intensité relative des bandes. Sauf indication contraire, les minimums de transmission (maximums d'absorption) du spectre obtenu avec la substance à examiner doivent correspondre en position et en dimensions relatives à ceux du spectre utilisé comme référence pour avoir une identification positive. f) Exemples : ISOTRETINOINE Identification Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (2.2.24). Comparaison : isotrétinoïne SCR. SPIRONOLACTONE Identification A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (2.2.24). Comparaison : spironolactone SCR. Si les spectres obtenus à l’état solide présentent des différences, dissolvez séparément* la substance à examiner et la substance de référence dans un volume minimal de méthanol R, évaporez à siccité et enregistrez de nouveaux spectres à partir des résidus. *!! Différence pour les spectres obtenus à l'état solide : dû au phénomène de polymorphisme, existence de différentes formes cristallines (au moins 2) pour une même molécule donnée. On dissout séparément la substance examinée et de référence dans un solvant pour s’assurer que la substance à examiner et de référence soient sous la même forme cristalline. On obtient des spectres différents. Avant : comparaison bande par bande → position et intensité relatives des bandes sont différentes : pas les mêmes formes cristallines. Après : position et intensité relatives des bandes sont identiques : mêmes formes cristallines. Remarque : cette technique est valable pour les matières premières mais pas pour les produits finis car interactions des bandes du principe actif avec celles des excipients. Spectrophotométrie UV/visible Rappels théoriques : Domaine de longueur d’onde : - UV : 180 nm à 400 nm - Visible : 400 nm à 800 nm Les longueurs d’onde sont plus faibles qu’en IR, donc les photons incidents sont plus énergétiques, les modifications dans les édifices moléculaires vont être plus importantes : les transitions entre niveaux électroniques vont être possibles mais il y a également modification des états vibrationnels et rotationnels qui apparaissent comme structure fine des niveaux électroniques. Un spectre UV se compose : - En Y, de l’absorbance - En X, de la longueur d’onde a) Equipement : ! Ce chapitre s’applique au détecteur UV comme outil de détection dans des systèmes chromatographiques (ex : en fin d’HPLC) et pour la machine UV utilisée comme telle au labo (spectroscopie UV). Les spectrophotomètres utilisés pour les mesures dans le domaine UV-Vis comprennent typiquement : - Une source lumineuse appropriée (par exemple lampe au deutérium pour la région UV, lampe au tungstène-halogène pour la région du visible, ou lampe au xénon pour couvrir la totalité du domaine UV-Vis) ; les spectrophotomètres UV-Vis comportent souvent 2 sources ; - Un monochromateur (à réseau par exemple) ; - D’autres éléments optiques, tels que lentilles ou miroirs, qui acheminent la lumière au sein de l'instrument, et peuvent également servir à générer plusieurs faisceaux lumineux (spectrophotomètres à double faisceau, par opposition aux spectrophotomètres à simple faisceau) ; - Un dispositif de présentation ou d'examen de l'échantillon, qui peut être, par exemple, une cuve à échantillon traditionnelle, une sonde à fibre optique ou une cellule de transmission immergée (à fenêtre transparente au rayonnement UV-Vis, en quartz ou saphir de haute pureté par exemple) ; le choix de l'un ou l'autre dispositif est fonction de l'application envisagée, l'un des critères essentiels étant la compatibilité du dispositif choisi avec le type d'échantillon à analyser ; - Un détecteur monocanal (par exemple, photomultiplicateur ou photodiode) ou un détecteur multicanal (par exemple, à barrette de diodes (= PDA, pour photodiode array) ou à transfert de charge (CCD, pour charge-coupled device)) ; - Des systèmes informatisés appropriés de traitement et d'évaluation des données. Contrôle des cuves. Dans le cas des instruments de laboratoire, des cuves ou cellules de parcours optique (épaisseur) défini sont utilisées, elles peuvent être constituées de différents matériaux tels que du quartz ou du verre. La tolérance pour le parcours optique est de ± 0,5 pour cent (soit, par exemple, ± 0,005 cm pour une cuve de 1 cm). Des cuves en plastique peuvent également être utilisées ; toutefois, comme dans ce cas la tolérance sur l'épaisseur est plus élevée que pour le verre ou le quartz, leur utilisation doit être dûment justifiée, suivant une approche d'analyse du risque. Spectrophotomètre monofaisceau à détecteur multicanal (DAD) : Cellule à circulation : effluent et affluent qui passent dans la cellule dans le cas d’un détecteur de type HPLC. Ce type d’appareil ne comporte pas de monochromateur. La lumière polychromatique de la source est envoyée sur la cuve qui en transmet une partie vers un réseau. Le réseau disperse cette lumière (polychromateur). Chaque photosite (photodiode) du capteur ne reçoit qu’un très petit intervalle de longueur d’onde (1 nm) sur lequel il mesure l’absorbance lorsque la cuve contient la référence ou lorsque la cuve contient l’échantillon. L’intérêt d’un tel dispositif est que la mesure de l’intensité transmise se fait instantanément sur l’ensemble du spectre de longueurs d’onde (à un temps t, on a la valeur d’absorbance sur tout le spectre UV-visible). Spectrophotomètre double faisceau : Double faisceau car un traverse l’échantillon et l’autre la référence. b) Mesures : - Mesures en transmission : Détermination de la transmittance T, c'est-à-dire le rapport caractérisant la transmission du rayonnement UV-Vis, à une longueur d'onde donnée, par un échantillon placé entre la source et le détecteur. Un spectre peut être obtenu en représentant les variations de la transmittance T ou de l'absorbance A en fonction de la longueur d’onde. L’absorbance est définie comme le logarithme décimal de l’inverse de la transmittance pour un rayonnement monochromatique. Il s'agit d'une grandeur sans dimension exprimée en unités d'absorbance (UA), donnée par l'équation : D'après la loi de Beer-Lambert, qui s'applique dans le cas des solutions diluées limpides et en l’absence de facteurs physicochimiques interférents, l’absorbance A est proportionnelle à la longueur du trajet optique l (ou épaisseur de la couche traversée) et à la concentration c de la substance dissoute : La grandeur généralement utilisée dans les monographies est l'absorbance spécifique (A1%1cm ), qui est liée à l’absorbance (A) par la relation : A1%1cm représente l’absorbance spécifique d’une substance en solution, définie comme l’absorbance de la solution rapportée à une concentration de 1 g/100 mL (1 pour cent m/V) sur un parcours optique de 1 cm, et mesurée à une longueur d’onde définie (Abs spécifique = toujours à une longueur d’onde définie). Mise en œuvre de l’équipement. Sauf indication contraire dans la monographie, effectuez la mesure de l'absorbance avec un parcours optique de 1 cm (= cellule de 1 cm), à la longueur d'onde prescrite. Lorsque la monographie spécifie une valeur unique pour la position d'un maximum ou d'un minimum d'absorption, l'utilisateur doit déterminer la valeur de longueur d'onde à laquelle il obtient ce maximum ou minimum. L'écart entre les 2 valeurs ne doit pas dépasser ± 2 nm, sauf indication contraire. Les déterminations quantitatives reposant sur des valeurs d'absorption supérieures à 2,0 sont à éviter. Correction de fond. Sélectionnez un blanc spectroscopique approprié (air, blanc-solvant, solide, etc.), Sauf indication contraire, toutes les mesures sont effectuées par rapport au même solvant ou au même mélange de solvants (blanc). c) Contrôle des performances de l’équipement : Les performances du spectrophotomètre font l'objet de contrôles (automatiques ou manuels) réalisés à intervalles réguliers définis dans le système de management de la qualité et variables selon la fréquence d'utilisation de l'équipement et l'application considérée. Par exemple, un équipement exposé à des variations de température et d'humidité peut nécessiter des contrôles plus fréquents. 5 paramètres à contrôler à retenir : - Contrôle de l’exactitude en longueur d’onde Au moyen soit de matériaux de référence - Contrôle de l'exactitude en absorbance certifiés (filtres solides ou filtres liquides - Contrôle de la linéarité photométrique contenus dans des cellules scellées adaptées au type de mesure prévu), soit de - Contrôle de la lumière parasite solutions préparées au laboratoire - Contrôle de la résolution Exemple : d) Procédure : identification : La spectrophotométrie UV/visible est utilisée en industrie et en hôpital pour un usage qualitatif afin de permettre l’identification d’une substance : - Soit par comparaison au spectre de la SCR - Soit par un maximum/minimum d’absorption (ou plusieurs) - Soit par calcul de A1%1cm (absorbance spécifique) Pour l‘identification : on doit regarder ce qu’il y a dans la monographie spécifique. Si dans la monographie on ne parle pas de SCR, on ne doit pas en parler non plus. e) Exemple : MIANSERINE (CHLORHYDRATE DE) Identification A. Spectrophotométrie d’absorption dans l’ultraviolet et le visible (2.2.25). Solution à examiner. Dissolvez 50,0 mg de chlorhydrate de miansérine dans de l’eau R e complétez à 50,0 mL avec le même solvant. Prélevez 5,0 mL de solution et complétez à 50,0 mL avec de l’eau R. Région spectrale : 230-350 nm. Maximum d’absorption : à 279 nm. Absorbance spécifique au maximum d’absorption : 64 à 72. Exercice : Vous réalisez le contrôle de qualité d’un lot de chlorhydrate de miansérine. Ce lot est-il conforme quant à l’identification A ? Données : - Pesée : 50,3 mg - Maximum d’absorption : 279 nm - Absorbance mesurée au maximum d’absorption : 0,658 Résultat Norme Conformité Maximum d’absorption à 279nm Maximum d’absorption OK à 279nm Absorbance spécifique (A1%1cm) au maximum d’absorption : Absorbance spécifique OK 65 au maximum d’absorption entre 64 et Calcul : 72 Conc. solution à examiner : 0,01006 g / 100 mL (à partir de la pesée de 50,3mg et des dilutions précisées dans la pharmacopée) → Lot conforme quant à Règle de 3 : l’identification A 0,01006 g / 100 mL → abs de 0,658 1 g / 100 mL → 65,408 (abs spécifique) L’absorbance spécifique se mesure pour 1 g / 100 mL Point de fusion → Le point de fusion d’un solide est la température à laquelle les phases solide et liquide sont en équilibre. Le point de fusion peut se retrouver au niveau de la monographie : - Soit au niveau des caractères si la T° de fusion est imprécise (confusion avec la T° de décomposition) - Soit au niveau des réactions d’identification, il s’agit d’un point de fusion vrai (sans décomposition). Le point de fusion d’un produit est un indice de sa pureté. La T° de fusion de la plupart des composés organiques se situe entre 50 et 300°C. Une substance solide pure présente un point de fusion bien net, le passage de l'état solide à l'état liquide se faisant sur un intervalle de température de moins de 1°C. Par contre, un produit impur fond mal, sur un intervalle de température de plusieurs degrés, en passant par un état intermédiaire pâteux. La Ph. Eur. préconise 3 méthodes pour la mesure du point de fusion : (1) Méthode au tube capillaire (retenir que c’est le chapitre 2.2.14 de la Ph. Eur.) - Pour les substances présentant une stabilité thermique - Pour l’identification (2) Méthode au tube capillaire ouvert (2.2.15) - Pour les substances difficiles pulvérisables (cires, graisses...) (3) Méthode de la fusion instantanée (2.2.16) - Pour les substances thermolabiles (fusion + décomposition) - Retrouvé au niveau des caractères le plus souvent (pas pour l’identification) Point de fusion – Méthode au tube capillaire (2.2.14) : Le point de fusion déterminé par la méthode au tube capillaire correspond à la température à laquelle la dernière particule solide de substance introduite dans un tube en colonne compacte passe à l’état liquide (point de fusion complète). a) Appareillage : L’appareillage est : - Constitué par un bloc chauffant métallique comportant un ou plusieurs compartiments destinés à recevoir les tubes capillaires, ou par un récipient de verre approprié contenant un bain liquide (eau, paraffine liquide ou huile de silicone par exemple), associé à un dispositif approprié d’agitation et de chauffage - Équipé d’une sonde de température ou d’un thermomètre certifié approprié, permettant la lecture à au moins 0,1°C près Les échantillons sont introduits dans l’appareil dans des tubes capillaires en verre dont les dimensions sont choisies conformément aux spécifications du fabricant, typiquement avec un diamètre externe de 1,3-1,5 mm et une épaisseur de paroi de 0,1-0,3 mm. Certains appareils utilisent des lames porte-objet au lieu des tubes capillaires. L'appareil est capable d'assurer le chauffage des échantillons à une vitesse de 1 °C/min ou moins. L'exactitude de l'instrument est d'au moins ± 0,5 °C. La détection peut être visuelle ou instrumentale. Si elle est instrumentale, elle est généralement réalisée par enregistrement puis analyse d'images, ou par un photodétecteur qui mesure la lumière transmise ou réfléchie par l'échantillon. b) Procédé : La substance est préalablement traitée comme décrit dans la monographie. La présence de gros cristaux est à éviter car elle peut fausser les résultats. L'échantillon peut, si nécessaire, être réduit en poudre fine. Sauf indication contraire, desséchez la substance finement pulvérisée sous vide et sur gel de silice anhydre R pendant 24 h. Introduisez dans un tube capillaire une quantité de substance suffisante pour former une colonne compacte telle que décrite par le fabricant de l'instrument (par exemple d'une hauteur de 4-6 mm). Chauffez jusqu'à obtention d'une température d'environ 5 °C inférieure au point de fusion présumé. Laissez la température se stabiliser puis introduisez le tube capillaire dans l'appareil. Réglez enfin la vitesse de chauffage à environ 1 °C/min, sauf indication contraire. Dans le cas d'une détection instrumentale, opérez selon les spécifications du fabricant de l'appareil pour la détermination du point de fusion. Dans le cas d'une détection visuelle, notez la température à laquelle la dernière particule de la substance à examiner passe à l'état liquide. Plusieurs échantillons peuvent être mesurés en parallèle si l'appareil permet l'examen d'échantillons multiples. c) Conformité du système : Effectuez un test de conformité du système avant de procéder aux mesures, par exemple à l'aide d'un matériau de référence approprié ayant un point de fusion proche du point de fusion attendu de la substance à examiner → D’abord s’assurer de la conformité du système avant la conformité des résultats. d) Qualification / Etalonnage de l'appareil : Réalisez des qualifications / étalonnages périodiques, selon les spécifications du fabricant de l'instrument, à l'aide d'au moins 2 matériaux de référence certifiés choisis de façon à couvrir l'intervalle de température utilisé, et avec des tubes capillaires de mêmes dimensions que ceux utilisés pour la mesure effectuée sur l'échantillon. e) Applications : Le point de fusion nous permet : → D’avoir une indication de polymorphisme Polymorphes = formes cristallines différentes Révélation par : - PF ≠ - IR ≠ - Diffraction RX (permet de déterminer % ≠) → De distinguer mélange racémique et énantiomères purs Ex : maléate de chlorphéniramine  PF rac = 130 °C ≠ du PF énantiomère (d ou l) = 110 °C Pouvoir rotatoire a) Principe : → Le pouvoir rotatoire (ou activité optique) est la propriété que présentent les substances chirales d'entraîner une rotation du plan de polarisation de la lumière polarisée rectilignement. Le pouvoir rotatoire est considéré comme positif (+) dans le cas de substances dextrogyres (c’est à-dire entraînant une rotation du plan de polarisation dans le sens des aiguilles d’une montre, l'observateur étant placé face à la source lumineuse) et comme négatif (−) dans le cas de substances lévogyres (c'est-à-dire entraînant une rotation dans le sens contraire des aiguilles d'une montre). /!\ Le pouvoir rotatoire dépend de certains paramètres, par exemple du solvant : le chloramphénicol est dextrogyre dans l’alcool et lévogyre dans l’acétate d’éthyle (dépend aussi de la concentration / de la température / …) → certaines substances changent de sens de rotation avec le solvant ce qui est différent avec la nomenclature R / S qui ne dépend pas des conditions expérimentales (c’est mieux pour caractériser une molécule). Rappel : 3 nomenclatures par rapport à la chiralité : - 1ère nomenclature : dextrogyre / lévogyre - 2ème nomenclature : R / S → à privilégier - 3ème nomenclature : Fischer (d / l) → Substances chirales → on parle de Chiralité → Lumière polarisée → on parle de Polarimétrie b) Chiralité : Rappels : le terme de chiralité tient son étymologie de la main en grec. En effet, deux mains sont des images l'une de l'autre dans un miroir et non superposables. Une molécule est dite chirale si elle a un centre d’asymétrie (carbone le plus souvent, mais peut aussi être un soufre…). Deux molécules images l'une de l'autre dans un miroir sont appelées énantiomères. Les énantiomères ont les mêmes propriétés physiques et chimiques, excepté les réactions où la chiralité entre en jeu, ce qui est le cas dans les mécanismes biologiques. Un exemple tristement célèbre est celui de la thalidomide, un sédatif utilisé dans les années 60. c) Nomenclature : Cahn, Ingold et Prelog (1956) : R et S. Cette convention consiste à caractériser chaque atome asymétrique du terme de Rectus (R) ou Sinister (S), selon une série de règles qui permettent de définir pour chaque atome une configuration absolue. - Rectus (R) = sens des aiguilles d’une montre - Sinister (S) = sens inverse des aiguilles d’une montre ou sens trigonométrique d) Molécules chirales : Les molécules chirales ont la propriété de dévier le plan de polarisation d'une lumière polarisée. On mesure cette propriété au moyen d’une technique analytique appelée la polarimétrie. La polarimétrie est donc basée sur la mesure de la déviation du plan de polarisation d'une lumière polarisée traversant une solution composée d'une ou de plusieurs molécules chirales. e) Lumière polarisée : Une lumière "normale" est composée d'un champ électrique et d'un champ électromagnétique. L’œil est seulement sensible au champ électrique. Ce champ peut prendre n'importe quelle direction. Dans une lumière polarisée, le champ électrique est limité à une seule direction. Cette lumière polarisée s'obtient à l'aide d'un polariseur (ou encore polaroïde), composé d'un polymère filtrant les composantes du champ électrique selon la direction perpendiculaire aux "lignes de polymères". Deux lames polaroïdes placées devant une source de lumière laisseront passer la lumière si celles-ci sont parallèles, seront perpendiculaires. Dans un système à deux lames polaroïdes, le premier polaroïde est appelé polariseur, le deuxième porte le nom d’analyseur. f) Polarimètre : Une molécule chirale possède la propriété de faire dévier le plan de polarisation d'une lumière incidente polarisée. Il suffit donc de placer une solution contenant la substance chirale entre les deux polaroïdes pour vérifier si celle-ci fait dévier le plan de polarisation de la lumière. Si tel est le cas, l'angle pour lequel on obtient l'extinction correspond à l'angle de rotation propre à la substance chirale. La mesure de cet angle est donc une caractéristique de la substance. Le pouvoir rotatoire (2.2.7) : a) Principe : L'angle de rotation optique α d'un liquide est l'angle de rotation du plan de polarisation, exprimé en degrés (°) et mesuré à la longueur d'onde de la raie D du sodium (λ = 589,3 nm), à 20 °C et pour un trajet optique dans le liquide de 1,00 dm. Le pouvoir rotatoire spécifique [α]20D d'une substance en solution est l'angle de rotation optique α, tel que décrit ci-dessus, rapporté à un trajet optique de 1,00 dm et à une concentration de substance à examiner de 1 g/mL. Le pouvoir rotatoire spécifique d'une substance en solution est toujours défini par rapport à un solvant déterminé et à une concentration donnée. b) Equipement : Le polarimètre comprend typiquement : - Une source lumineuse : lampe à vapeur de sodium, diode électroluminescente (LED) ou toute autre source capable de générer un rayonnement de la longueur d'onde voulue (589 nm, sauf indication contraire dans la monographie) ; si la source est polychromatique, un dispositif permettant d'isoler la longueur d'onde requise est nécessaire (filtre optique, par exemple) ; - Un polariseur et un analyseur ; - Une cellule de mesure présentant un trajet optique de 1,00 dm, sauf indication contraire dans la monographie ; - Un système de détection permettant de mesurer l'angle de rotation optique ; il doit permettre la lecture à 0,01° près au moins, sauf indication contraire dans la monographie ; - Un système thermostatique permettant la lecture à 0,1 °C près, il peut être incorporé au polarimètre (élément Peltier, par exemple), ou constitué d'une unité de régulation externe (cryostat par exemple) ; ce système doit également permettre de maintenir la température du liquide à la valeur prescrite, à 0,5 °C près. c) Contrôle des performances de l’équipement : - Contrôle de l’exactitude de l’échelle de l’appareil : au moyen de lames de quartz certifiées ; toutefois, d’autres matériaux de référence certifiés peuvent également convenir (solutions de saccharose, par exemple). Si dosage d'un énantiomère ou détermination d'un rapport énantiomérique, il faut également réaliser le test suivant : - Contrôle de la linéarité : au moyen de solutions de saccharose d) Mode opératoire : Déterminez le zéro du polarimètre et l'angle de rotation optique du liquide à une longueur d'onde de 589 nm et à une température de 20 ± 0,5 °C, sauf indication contraire. Le zéro du polarimètre est déterminé avec la cellule de mesure fermée ; dans le cas des liquides non dilués, utilisez la cellule à vide ; dans le cas des solutions, remplissez la cellule avec le même solvant que celui utilisé pour la solution à examiner, et opérez à la même température. Le mode de préparation des échantillons est décrit dans les monographies. Calculez le pouvoir rotatoire spécifique à la température t et la longueur d'onde λ à l'aide des formules suivantes. - Pour les liquides non dilués (prise en compte de la masse volumique) : - Pour les solutions : Facteur 1000 au numérateur : la concentration au dénominateur est en g/L or le pouvoir rotatoire spécifique est rapporté en g/mL donc besoin d’un facteur 1000 au numérateur. e) Exemples : ADRÉNALINE (TARTRATE D’) Identification A. Dissolvez 5 g de tartrate d’adrénaline dans 50 ml d’une solution de métabisulfite de sodium R à 5 g/l et ajoutez de l’ammoniaque R jusqu’à réaction alcaline. Maintenez à température ambiante pendant au moins 15 min puis filtrez. Réservez le filtrat pour l’identification C. Lavez le précipité avec 3 fois 10 ml de méthanol R. Desséchez à 80 °C. A partir du résidu (adrénaline base), préparez une solution à 20,0 g/l dans l’acide chlorhydrique 0,5 M. Le pouvoir rotatoire spécifique (2.2.7) est de − 53,5 à − 50 (pouvoir rotatoire négatif donc lévogyre). Remarques : - On prend le pouvoir rotatoire de l’adrénaline base et pas du sel ! - L’unité du pouvoir spécifique est sous-entendue - L’identification C : permet de retrouver le tartre d’ammonium dans le filtrat - Métabisulfite utilisé pour empêcher la dégradation de la molécule car l’adrénaline peut s’oxyder (diphénol sensible). SIMVASTATINE Identification A. Pouvoir rotatoire spécifique (voir Essai). B. Spectrophotométrie d’absorption dans l’infrarouge (2.2.24). Comparaison : simvastatine SCR. Essai Pouvoir rotatoire spécifique (2.2.7) : + 285 à + 300 (substance desséchée). Dissolvez 0,125 g de simvastatine dans de l’acétonitrile R et complétez à 25,0 mL avec le même solvant. Exercice : Vous réalisez le contrôle de qualité d’un lot de simvastatine. Ce lot est-il conforme quant à l’identification A ? Données : - Pesée : 0,127 g - Perte à la dessiccation de ce lot de simvastatine : 0,3% - Trajet optique de la cellule de mesure du polarimètre : 2 dm - α : + 2,9° Résultat Norme Conformité d20D = + 286 + 285 à + 300 OK (substance Calcul : desséchée) - Pesée desséchée* : 0,127 g – 0,3% de 0,127g = → Lot conforme 0,126619 g quant à - Conc. solution à examiner = 0,00506476 g / mL l’identification A - 20D = +2,9 / 0,00506476. 2 = 286,291947 *On tient compte de la perte à la dessication : (pesée – perte à la dessication) Chromatographie sur couche mince (CCM) (2.2.27) a) Principe : La CCM est une technique de séparation dans laquelle une phase stationnaire, constituée d'un matériau approprié, est répandue en une couche mince et uniforme sur un support (plaque) de verre, de métal ou de plastique. Des solutions d'analytes sont appliquées sur la plaque avant le développement. La séparation repose sur les mécanismes d'adsorption, de partage ou d'échange d'ions ou sur des combinaisons de ces mécanismes et elle s'effectue par migration (développement) de solutés (solutions d'analytes) dans un solvant ou un mélange de solvants approprié (phase mobile) à travers la couche mince (phase stationnaire). → Il s’agit d’une des premières techniques séparatives. On a un mécanisme d’adsorption si la phase stationnaire est en silice non modifiée tandis que si la silice est greffée, on parle de mécanisme de partage. b) Identification : Par comparaison visuelle - De la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution à examiner - Avec la tache correspondante du chromatogramme obtenu avec la solution témoin → Comparaison de la coloration, des dimensions et du facteur de retardement (RF) respectifs des 2 taches. Rappel : calcul Rf : Rf = DM/DS → distance de migration / distance parcourue sur le front de solvant. Rf est toujours compris entre 0 (substance ne migre pas) et 1 (substance migre comme le co-solvant). c) Exemple : CYPROTÉRONE (ACÉTATE DE) Identification B. Chromatographie sur couche mince (2.2.27). Solution à examiner. Dissolvez 20 mg d’acétate de cyprotérone dans du chlorure de méthylène R et complétez à 10 ml avec le même solvant. Solution témoin. Dissolvez 10 mg d’acétate de cyprotérone SCR dans du chlorure de méthylène R et complétez à 5 ml avec le même solvant. Plaque : plaque au gel de silice F254 pour CCM R. Phase mobile : cyclohexane R, acétate d’éthyle R (50:50 V/V). → Phase mobile apolaire (cyclohexane) et phase stationnaire polaire (silice) donc mode normal. Rappel : mode normal = phase stationnaire polaire et phase mobile apolaire, mode inverse = phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire. Dépôt : 5 μl. Développement : 2 fois sur les 3/4 de la plaque ; laissez sécher la plaque à l’air entre les 2 développements. Séchage : à l’air. → 2 développements pour augmenter la résolution Détection : examinez en lumière ultraviolette à 254 nm. → La cyprotérone absorbe la lumière UV à 254 nm donc tache noire à l’endroit où elle se situe. Résultats : la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution à examiner est semblable quant à sa position et ses dimensions à la tache principale du chromatogramme obtenu avec la solution témoin. Chromatographie liquide (LC) (2.2.29) a) Principe : La chromatographie liquide (CL) est une technique de séparation chromatographique reposant sur la distribution différentielle des espèces entre 2 phases non miscibles, une phase stationnaire contenue dans une colonne et une phase mobile liquide qui traverse, par percolation, cette phase stationnaire. La CL est principalement fondée sur les mécanismes d’adsorption, de distribution de masse, d’échange d’ions, d’exclusion ou d’interaction stéréochimique. Sauf indication contraire, les informations figurant dans ce chapitre sont valables à la fois pour la CL conventionnelle et pour la CL sur colonnes remplies de particules de très faible granulométrie (inférieures à 2,0 µm, par exemple). Cette dernière technique requiert une instrumentation caractérisée par sa capacité à supporter des pressions plus élevées (pouvant typiquement atteindre 100 MPa, soit environ 15 000 psi), de faibles volumes extra-colonne pour diminuer l’élargissement des pics, un système de mélange optimisé en mode gradient et une fréquence d’acquisition accrue des signaux transmis par le système de détection.  Différents mécanismes selon la nature de la phase stationnaire (comme CCM). Travailler avec des molécules de taille < 0,2 µm : l’efficacité augmente → on gagne sur le paramètre C (= résistance au transfert de masse de l’équation de Van-Deemter) → il diminue de manière importante. On va donc plus vite (terme µ augmente) → gain d’efficacité, de séparation et en temps d’analyse. Pour des particules de cette taille, on doit utiliser des systèmes compatibles avec les contre-pressions générées (pouvant atteindre 1000 bar). On n’utilise pas de l’HPLC normale, sinon les pics vont s’élargir. La fréquence d’inquisition du détecteur doit aussi être accrue (ex : détecteur UV). b) Identification : Par comparaison - Du pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution à examiner - Et du pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution témoin → Comparaison du temps de rétention et des dimensions respectifs des 2 pics c) Exemple : ALFACALCIDOL Identification B. Examinez les chromatogrammes obtenus dans l’essai des substances apparentées. Résultats : le pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution à examiner est semblable quant à son temps de rétention et ses dimensions au pic principal du chromatogramme obtenu avec la solution témoin (a). Réactions d’identité des ions et des groupes fonctionnels (2.3.1) (Techniques applicables pour les matières premières, pas toujours applicable pour les produits finis) Sélection de contre-ions retrouvés dans les formes médicamenteuses : bromures, chlorures, iodures, phosphates, sulfates. → Besoin d’identifier le contre-ion quand le produit est sous forme de sel. 1) BROMURES (applicable pour les bromures, iodures et chlorures → c’est le même principe mais en fonction de la nature du contre-ion, on a un précipité différent (Br-, Cl-, I-)) Dissolvez une quantité de la substance à examiner correspondant à 3 mg environ de bromure (Br -) dans 2 ml d’eau R, ou utilisez 2 ml de la solution prescrite. Acidifiez par l’acide nitrique dilué R et ajoutez 0,4 ml de solution de nitrate d’argent R1. Agitez et laissez reposer. Il se forme un précipité caillebotté jaune pâle (= précipité d’AgBr). Centrifugez et lavez 3 fois avec 1 ml d’eau R. Effectuez cette opération rapidement, à l’abri d’une lumière vive, sans tenir compte du fait que le liquide surnageant ne devient pas parfaitement limpide. Mettez le précipité en suspension dans 2 ml d’eau R et ajoutez 1,5 ml d’ammoniaque R. Le précipité se dissout difficilement. Schéma : - PE (prise d’essais) dans H2O ou solution - + HNO3 dil. - + AgNO3 - + NH3 Principe : précipité de AgBr caillebotté jaune pâle en milieu nitrique, qui se dissout difficilement avec NH 3 (>< précipité de AgCl qui se dissout rapidement). → Rapidement et à l’abri de la lumière ? Pour éviter la réduction de Ag + en Ag0 2) CHLORURES (idem bromure mais précipité blanc d’AgCl qui se dissout facilement) Dissolvez une quantité de la substance à examiner correspondant à 2 mg environ de chlorure (Cl –) dans 2 ml d’eau R, ou utilisez 2 ml de la solution prescrite. Acidifiez par l’acide nitrique dilué R. Ajoutez 0,4 ml de solution de nitrate d’argent R1. Agitez et laissez reposer. Il se forme un précipité blanc caillebotté. Centrifugez et lavez 3 fois avec 1 ml d’eau R. Effectuez cette opération rapidement, à l’abri d’une lumière vive, sans tenir compte du fait que le liquide surnageant ne devient pas parfaitement limpide. Mettez le précipité en suspension dans 2 ml d’eau R et ajoutez 1,5 ml d’ammoniaque R. Le précipité se dissout facilement à l’exception d’éventuelles particules importantes qui se dissolvent lentement. Schéma : - PE dans H2O ou solution - + HNO3 dil. - + AgNO3 - + NH3 Principe : précipité d’AgCl blanc caillebotté en milieu nitrique, qui se dissout facilement avec NH3 → Rapidement et à l’abri de la lumière ? Eviter la réduction de Ag+ 3) IODURES (idem bromure mais précipité jaune pâle qui ne se dissout pas avec le NH 3) Dissolvez une quantité de la substance à examiner correspondant à 4 mg environ d’iodure (I -) dans 2 ml d’eau R, ou utilisez 2 ml de la solution prescrite. Acidifiez par l’acide nitrique dilué R et ajoutez 0,4 ml de solution de nitrate d’argent R1. Agitez et laissez reposer. Il se forme un précipité caillebotté jaune pâle. Centrifugez et lavez avec 3 fois 1 ml d’eau R. Effectuez cette opération rapidement, à l’abri d’une lumière vive, sans tenir compte du fait que le liquide surnageant ne devient pas parfaitement limpide. Mettez le précipité en suspension dans 2 ml d’eau R et ajoutez 1,5 ml d’ammoniaque R. Le précipité ne se dissout pas. Schéma : - PE dans H2O ou solution - + HNO3 dil. - + AgNO3 - + NH3 Principe : précipité d’AgI caillebotté jaune pâle en milieu nitrique, qui ne se dissout pas avec NH 3 → Rapidement et à l’abri de la lumière ? Eviter la réduction de Ag+ 4) PHOSPHATES (orthophosphates : PO43-) A 5 ml de la solution prescrite, neutralisée si nécessaire, ajoutez 5 ml de solution de nitrate d’argent R1. Il se forme un précipité jaune dont la coloration n’est pas modifiée par ébullition, et qui se dissout par addition d’ammoniaque R. Schéma : - Solution neutralisée (si nécessaire) - + AgNO3 - + ébullition - + NH3 Principe : précipité d’Ag3PO4 jaune qui se dissout avec NH3 ([Ag(NH3)2]+ complexe stable qui déplace l’équilibre) → Milieu neutre ? Car tous les PO43- sont solubles en milieu acide →Pourquoi ébullition ? Eviter interférence PO33-: précipité d’Ag3PO3 jaune qui noircit par ∆T° 5) SULFATES Dissolvez 45 mg environ de la substance à examiner dans 5 ml d’eau R ou utilisez 5 ml de la solution prescrite. Ajoutez 1 ml d’acide chlorhydrique dilué R et 1 ml de solution de chlorure de baryum R1. Il se forme un précipité blanc. Schéma : - PE dans H2O ou solution - + HCl dil. - + BaCl2 Principe : précipité de BaSO4 blanc 4.3.2. Essai Contrôle des impuretés dans les substances pour usage pharmaceutique (5.10) : La qualité des substances, en ce qui concerne les impuretés, est contrôlée par un ensemble d’essais prescrits dans les monographies. Ces essais visent à couvrir les impuretés organiques et inorganiques pertinentes au vu des sources dont proviennent les substances actives contenues dans les médicaments autorisés. Les exigences de qualité sont établies sur la base de considérations d’ordre scientifique, technique et réglementaire. → Établissement de limites afin de garantir leur innocuité à la teneur maximale autorisée à la dose journalière maximale. On se place dans le pire des cas pour établir la limité des impuretés. Chaque monographie contient typiquement entre 2 et 6 essais complémentaires, sélectionnés pour identifier et contrôler les principales impuretés qui sont connues pour un principe actif, principalement : - Des impuretés organiques qualifiées (substances apparentées) - Des contaminants volatils (solvants, eau) - Des impuretés inorganiques → Méthodes semi-quantitatives (essais limites) - Contrôler que la teneur en impuretés n’excède pas la limite fixée dans la monographie - Essentiellement des cations et anions inorganiques → Méthodes quantitatives - Déterminer la teneur d’une impureté donnée (= limite en impureté) 1 partie pour 1.000.000 parties Expression de la limite → ppm = une partie par million = μg/g 1 g pour 1.000.000 g (= 1 tonne) 1 mg pour 1.000.000 mg (= 1 kg) 1 μg pour 1.000.000 μg (= 1 g) = (quantité d’impuretés tolérée au maximum) / (quantité de substance totale analysée) Expression de la limite → % /!\ Si unités en ppm → facteur de 106 entre unités du numérateur et du dénominateur /!\ Si unités en % → même unité au numérateur et au dénominateur puis x100 Jusque 1000 ppm, tolérance exprimée en ppm. Au-delà de 1000 ppm, tolérance exprimée en %. → 1000 ppm = 0,1% : - 1 ppm = 1μg/1.000.000μg - 1000 ppm = 1.000μg/1.000.000μg = 1mg/1g = 0,001g/1g = 0,1% Aspect de la solution Limpidité et degré d’opalescence des liquides (2.2.1) Degré de coloration des liquides (2.2.2) Recherche des : - Particules - Impuretés insolubles et/ou colorées Solution S : - Préparée par dissolution de la substance à examiner dans un solvant spécifié (H2O, HCl dilué, méthanol, éthanol, CH2Cl2 ou diméthylformamide) - Concentration élevée (typiquement 10 – 200 mg/mL) → Evaluation de la limpidité et du degré d’opalescence par comparaison : - De la solution S - Avec de l’eau R, le solvant utilisé ou la suspension témoin I si la solution S doit être limpide OU - Avec une suspension de référence si la solution S peut être opalescente  Comparaison visuelle des 2 solutions contenues dans 2 tubes → Evaluation du degré de coloration par comparaison : - De la solution S - Avec de l’eau R, le solvant utilisé ou la solution témoin B 9 si la solution S doit être incolore OU - Avec une solution témoin colorée si la solution S peut être colorée  La solution S ne doit pas être plus fortement colorée que la solution témoin Comparaison visuelle des 2 solutions contenues dans 2 tubes selon le procédé I (examen horizontal sur fond blanc) ou le procédé II (examen dans l’axe du tube sur fond blanc). L’intérêt du procédé II est d’ le trajet optique et donc  la sensibilité. Préparation des solutions témoins colorées par dilution de solutions étalons (SE) : - Brun (B) - Jaune-brun (JB) - Jaune (J) - Jaune-vert (JV) - Rouge (R) 7 dilutions successives (ex : J1 à J7), sauf pour le brun, 9 dilutions (B1 à B9) Intérêts du contrôle de l’aspect de la solution ? - Contrôle du soin apporté à la fabrication - Contrôle de la stabilité des solutions - Produits d’oxydation - Produits de charbonnement (H2SO4) Rem : observations avec tubes à fond plat pour faciliter la comparaison. pH, acidité ou alcalinité Recherche des : impuretés acides ou basiques → pH Par potentiométrie (2.2.3) pH-mètre avec électrode de verre / calomel (ou Ag / AgCl) → Acidité ou alcalinité /!\ solution préparée à partir d’eau exempte de dioxyde de carbone. - Pourquoi ? CO2 + H2O entraine une acidification (H2CO3) → peut fausser les résultats - Comment ? on obtient de l’eau exempte de dioxyde de carbone en la faisant bouillir puis en mettant un verre de montre par-dessus lorsqu’elle refroidit pour éviter une réincorporation du CO 2 Détermination potentiométrique du pH (2.2.3) Le pH d’une solution aqueuse est défini comme l’opposé du logarithme de l’activité des ions hydrogène présents, conventionnellement exprimée comme la concentration en ions hydrogène de la solution. Pour des raisons pratiques, sa définition est expérimentale. Le pH d’une solution à examiner s’exprime alors par rapport à celui d’une solution de référence (pHs) suivant l’équation : E est la tension, exprimée en volts, de la cellule renfermant la solution à examiner. Es est la tension, exprimée en volts, de la cellule renfermant la solution de pH connu (pHs). k est la variation de tension par variation d’une unité pH (donc k = variable), exprimée en volts et calculée par l’équation de Nernst. La détermination potentiométrique du pH est effectuée par mesure de la différence de potentiel entre 2 électrodes, convenablement choisies, plongeant dans la solution à examiner ; l’une est une électrode sensible aux ions hydrogène (le plus souvent une électrode de verre), l’autre une électrode de référence (par exemple, une électrode argent-chlorure d’argent). /!\ Correction du pH en fonction de la T° → Mesure du pH à température constante ! k est une variable Appareil : L’appareil de mesure est généralement un voltmètre ayant une résistance d’entrée au moins 100 fois supérieure à celle des électrodes utilisées. Il est habituellement gradué en unités pH et sa sensibilité doit permettre la mesure à au moins 0,05 unité pH ou 0,003 V près. Conditions d’étalonnage et de mesure : Sauf indication contraire dans la monographie, toutes les mesures sont effectuées à la même température que celle utilisée pour l’étalonnage (± 2,5 °C), généralement entre 20 °C et 25 °C. L’étalonnage consiste à déterminer la pente (95-105 pour cent par exemple) et le zéro du système de mesure. La plupart des pH-mètres du commerce comportent des fonctions d’auto-test ou de test à l’allumage qui contrôlent, par exemple, la pente et le potentiel d’asymétrie et les comparent aux spécifications du fabricant. Avec quoi ? 2 tampons de référence, choisis de manière à couvrir la gamme de pH d’intérêt Validation de l’étalonnage : Avec un 3ème tampon de pH intermédiaire, dont on reporte la valeur mesurée dans la droite d’étalonnage. → La mesure ne peut pas s’écarter de plus de 0,05 unité de pH de la valeur correspondant à cette solution Quand ? - Usage régulier (quotidien) → tous les jours avant usage - Usage occasionnel → juste avant usage Intérêt de la mesure du pH ? - Caractérisation du produit - Détection d’impuretés de synthèse (ex : HCl dans un chlorhydrate) ou de dégradation (ex : ester après hydrolyse → fonction carboxylique libre qui confère un caractère plus acide à la solution) Acidité ou alcalinité Titrage semi-quantitatif Dissolution du PA dans de l’eau exempte de dioxyde de carbone + indicateur coloré + base → Changement de couleur + acide → Changement de couleur Ajout de quantités d’acide et de bases juste suffisantes pour entrainer un changement de couleur. Si présence de quantités significatives d’impuretés acides ou basiques → suppression ou perturbation des changements de couleur. Exemple : EPHEDRINE (CHLORHYDRATE D’) Essai Acidité ou alcalinité. A 10 mL de solution S, ajoutez 0,1 mL de solution de rouge de méthyle R et 0,2 mL d’hydroxyde de sodium 0,01 M. La solution est jaune. Après addition de 0,4 mL d’acide chlorhydrique 0,01 M, la solution est rouge. Substances apparentées Recherche des : - Traces de produits de départ utilisés pour la synthèse - Impuretés de synthèse ou de dégradation Utilisation d’une technique séparative : LC, GC, CE (= électrophorèse capillaire) Solution à examiner : concentration du PA relativement élevée afin de pouvoir détecter les impuretés présentes de très faibles concentrations a) Conformité du système : → Vérifier que la séparation requise pour la réalisation de l’essai ou du dosage est obtenue → Paramètres utilisés : - Résolution - Rapport Pic/vallée - Facteur d’asymétrie AS (1 = pic symétrique, < 1= pic qui traine à l’avant, >1 = pic qui traine à l’arrière) - Rapport signal/bruit S/N - Nombre de plateaux théoriques N - … Au niveau de la pharmacopée, on n’utilise pas la résolution mais le rapport pic/vallée. Résolution complète ~1,5 (peut différer selon les monographies). b) Quantification : → Méthode de l’étalon externe  Fonction d’étalonnage - Préparer des solutions témoin contenant différentes quantités graduées d’un étalon de référence du composant à analyser, comprises dans un intervalle sur lequel la linéarité de la réponse a été démontrée - Injecter un volume fixé de ces solutions témoin - A l’aide des chromatogrammes obtenus, tracer une courbe d’étalonnage en portant la surface ou la hauteur des pics en ordonnée et la quantité d’étalon de référence en abscisse. La fonction d’étalonnage est généralement obtenue par régression linéaire - Préparer ensuite une solution de la substance à examiner, comme spécifié dans la monographie, et réaliser la chromatographie dans les mêmes conditions opératoires que celles utilisées pour établir la fonction d’étalonnage - Mesurer la hauteur ou la surface du pic dû au composant à analyser, et déterminez la teneur du composant par lecture à partir de la courbe d’étalonnage ou par calcul à l’aide de la fonction d’étalonnage. → Méthode de l’étalon externe  Etalonnage monopoint - Préparer une solution témoin de concentration comprise dans l’intervalle de linéarité de la fonction d’étalonnage, et une solution de la substance à examiner de concentration proche de celle de la solution témoin. - Réaliser la chromatographie dans des conditions définies afin de déterminer la teneur du composant à analyser par comparaison des réponses obtenues Lorsque l’on utilise cette méthode, toutes les procédures, notamment la procédure d’injection, doivent être réalisées dans des conditions constantes. → Méthode de l’étalon interne  Fonction d’étalonnage - Sélectionner comme étalon interne un composant stable dont le temps de rétention est proche de celui du composant à analyser et dont le pic est complètement séparé de tous les autres pics du chromatogramme. - Préparer plusieurs solutions témoin contenant une quantité fixée de cet étalon interne et différentes quantités graduées d’un étalon de référence du composant à analyser - Injecter un volume fixé des différentes solutions témoin et, à partir des chromatogrammes obtenus, calculer le rapport entre la surface ou la hauteur du pic dû à l’étalon de référence et la surface ou la hauteur du pic dû à l’étalon interne. - Tracer une courbe d’étalonnage en portant ces rapports en ordonnée et la quantité d’étalon de référence (ou le rapport entre la quantité d’étalon de référence et la quantité d’étalon interne) en abscisse. La fonction d’étalonnage est généralement obtenue par régression linéaire. - Préparer ensuite une solution de la substance à examiner contenant la même quantité d’étalon interne que les solutions témoin utilisées pour établir la fonction d’étalonnage, comme spécifié dans la monographie, et réaliser la chromatographie dans les mêmes conditions opératoires que celles utilisées pour établir la fonction d’étalonnage - Calculer le rapport entre la surface ou la hauteur du pic dû au composant à analyser et la surface ou la hauteur du pic dû à l’étalon interne, et déterminer la teneur du composant par lecture à partir de la courbe d’étalonnage ou par calcul à l’aide de la fonction d’étalonnage. On préfère utiliser un étalon interne dont le temps de rétention est inférieur (il s’élue avant) pour raccourcir le temps de l’analyse. En LC, il y a une boucle d’injection calibrée qui permet de connaitre parfaitement le volume injecté et permet la répétabilité de l’injection → pas besoin d’étalon interne contrairement à la GC. Utiliser un étalon interne quand : - Quand on utilise comme détecteur le spectromètre de masse, on doit utiliser un étalon interne car il y a une variabilité au niveau de l’ionisation de la source - Ajouts dosés : pour s’affranchir de la préparation de l’échantillon ou avec une matrice complexe - Dosage en électrophorèse capillaire : petits volumes injectés (ordre du nL) donc manque de répétabilité de l’injection - Pour s’affranchir de problèmes techniques Remarque : on met l’étalon interne dans la solution à examiner et dans le témoin → Méthode de l’étalon interne  Etalonnage monopoint - Préparer une solution témoin de concentration comprise dans l’intervalle de linéarité de la fonction d’étalonnage, et une solution de la substance à examiner de concentration proche de celle de la solution témoin, contenant toutes deux une quantité fixée de l’étalon interne. La chromatographie est réalisée dans des conditions définies afin de déterminer la teneur de composant à analyser par comparaison des rapports obtenus. Si on a le choix, on prend 1 témoin à 1 niveau de concentration. → Procédé de normalisation - Déterminer la teneur pour cent d’un composant de la substance à examiner en calculant le pourcentage que représente la surface du pic correspondant par rapport à la surface totale des pics Sont exclus de ce calcul les pics dus aux solvants ou aux réactifs, ou issus de la phase mobile ou de la matrice de l’échantillon, ainsi que les pics de surface inférieure ou égale au seuil de déclaration. Dans ce cas-là, il n’y a pas d’étalon externe. c) Quantification en électrophorèse capillaire : Utilisation des surfaces corrigées → diviser la surface des pics par le temps de migration correspondant Pourquoi ? - Compenser la dérive du temps de migration d’une analyse à l’autre, donc réduire la variabilité de la réponse - Compenser les différences de réponse entre constituants de l’échantillon possédant des vitesses de migration différentes Utilisation possible du temps de migration relatif par rapport à un étalon interne Pourquoi ? - Éviter les défauts de répétabilité des temps de migration En électrophorèse, on utilise souvent un détecteur UV avec une détection qui se réalise au travers du capillaire. Un composant qui passe vite devant le détecteur aura un petit pic comparé à une substance qui passe lentement devant. On utilise les surfaces corrigées pour pallier à ce problème de différence de vitesses de migration (qui affectent la surface du pic). Remarque : c’est le même principe dans la quantification de principes actifs (contrôle qualité des produits finis, voir plus loin) donc bien comprendre les étalonnages etc pour les matières premières. d) Quantification des impuretés : Réponse du détecteur La sensibilité du détecteur est l’intensité du signal délivré par unité de concentration ou de masse d’une substance dans la phase mobile entrant dans le détecteur. Le facteur de réponse relatif du détecteur (communément appelé « facteur de réponse ») exprime la sensibilité de ce détecteur pour une substance donnée, par rapport à une substance de référence. Le facteur de correction est l’inverse du facteur de réponse. Mesure des pics L’intégration de la surface du pic d’une impureté, lorsqu’il n’est pas complètement séparé du pic principal, s’effectue de préférence par extrapolation de vallée à vallée (arasement tangentiel). Seuil de déclaration Lorsqu’un essai de substances apparentées prescrit une limite pour le total des impuretés, ou la détermination quantitative d’une seule impureté, il est important de choisir un seuil de déclaration approprié et des conditions adéquates pour l’intégration de la surface des pics. Dans ces essais, le seuil de déclaration (la limite au-dessus de laquelle un pic est déclaré) est en général de 0,05 pour cent. Limite d’exclusion Teneur nominale jusqu’à laquelle les pics/signaux ne sont pas pris en compte dans le calcul de la somme des impuretés. La limite d’exclusion et le seuil de déclaration ont généralement la même valeur numérique. → « Valeur seuil » Déclaration : à partir de celle valeur là, on déclare Exclusion : avant cette valeur là on exclut = veulent dire la même chose e) Exemples : THIAMINE (CHLORHYDRATE DE) Essai Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29). Rappels : phase stationnaire apolaire = phase INVERSE. 50% des groupements silanols ne sont pas greffés avec des C18, on les appelle les silanols résiduels. Ils sont embêtants car peuvent s’ioniser et interagir avec une amine chargée positivement en fonction du pH de la phase mobile. Les groupes silanols résiduels ont un pKa = 5 (à partir de pH < pKa-2 : commence à s’ioniser → donc à pH = 3). Ils s’ionisent négativement (SiO-) donc peuvent réagir avec des amines protonées chargées positivement. Ça provoque le tailing des composés basiques, ce qui peut masquer des impuretés (rend la quantification impossible) → pH de la phase mobile avec une silice greffée : stabilité entre pH 2 et pH 8. On cherche à masquer les groupements silanols résiduels en faisant du postgreffage (ex : triméthylchlorosilane) = ENDED-CAPPING = POST-GREFFAGE (permet d’éviter le phénomène de tailing qui est indésirable avec les molécules basiques). - 5µm = taille des particules (sphères homogènes poreuses) - 100 = taille des pores (en angström) - RP = reverse phase - 18 = 18 atomes de carbones - e = end-capped Hexanesulfonate dans la phase mobile est chargé négativement peu importe le pH de la phase mobile : c’est un agent d’appariement d’ion (contre-ion chargé négativement). Il peut former une paire d’ions avec les substances à analyser chargées positivement, des substances basiques (d’où « sulfonate » = chargé – et s’apparie à des formes +). Il y a formation d’une paire d’ion neutre qui va être apolaire (d’où « hexane » = apolaire) → conséquence : on augmente la rétention sur la phase stationnaire apolaire (car phase inverse) et donc la résolution entre les différents pics (meilleure séparation). Concentration de la solution à examiner : 350mg/100mL → 3,5mg/mL Solution témoin (b) : dilution 50x puis dilution 5x → dilution totale de 250 x → 0,014mg/mL Tolérance (concentration de l’impureté dans le témoin) : 0,014 𝑚𝑔/𝑚𝑙 𝑇𝑜𝑙é𝑟𝑎𝑛𝑐𝑒 ∶ 𝑥 100 = 0,4 % 3,5 𝑚𝑔/𝑚𝑙 La solution témoin (b) est donc une dilution de la solution à examiner. Elle nous sert de référence pour quantifier n’importe quelle impureté (on tient donc uniquement compte du facteur de dilution). - Total : 0,4 x 2,5 = 1% - Limite d’exclusion : 0,125 x 0,4 = 0,05% Grâce au témoin (b) : dilution de la solution à examiner → on connait le tR de notre composé. Ensuite, on peut déduire le pic de l’impureté par le témoin (a) puis pareil avec l’essai. /!\ Norme toujours en % ou en ppm (jamais des surfaces). Pour transformer une surface en %, on fait une règle de 3 : Impureté B : 0,4 % 601,561 Impureté A : 0,087 % 130,889 CODEINE (PHOSPHATE DE) L’impureté C absorbe plus que la codéine car c’est un dimère de la codéine. Or, on fait notre quantification par rapport à la codéine (et non par rapport à son dimère, l’impureté C) → il faut utiliser un facteur de correction pour l’impureté C (puisque le dimère absorbe plus que la codéine) → permet d’éviter de surestimer la teneur en impureté C. Le facteur de correction n’intervient pas pour le calcul des tolérances mais bien pour la surface des pics lors du calcul de la teneur en impuretés C. Impureté A : Concentration de la solution à examiner : 0,100g/10mL → 0,01g/mL → 10mg/mL Solution témoin (b) : 5mg/5mL → 1mg/mL Dilution 20x → 0,05mg/mL Tolérance (concentration de l’impureté dans le témoin) : 0,05 𝑚𝑔/𝑚𝑙 𝑇𝑜𝑙é𝑟𝑎𝑛𝑐𝑒 ∶ 𝑥 100 = 0,5 % 10 𝑚𝑔/𝑚𝑙 On tolère « au maximum 2x la surface … » : 0,5 x 2 = 1% /!\ le témoin n’est pas toujours une dilution de la solution à examiner. Perte à la dessication (2.2.32) Recherche des : substances volatiles (H2O ou solvants résiduels) Principe : perte de masse, calculée en % m/m, mesurée après dessication dans des conditions spécifiques : - Dans un four à une T° donnée - Dans un dessiccateur contenant du P2O5 - Sous vide à une T° donnée → Dans une perte à la dessication, on obtient toutes les substances volatiles, on ne va pas déterminer de manière spécifique la teneur d’un solvant résiduel. Pour ça, il y a un test spécial dans la monographie (dosage de l’eau, dosage d’un solvant spécifique). Eau Dans la monographie ça s’écrit : eau (2.5.12) ou (2.5.32). Les noms des méthodes ne sont pas écrits. - 2.5.12 pour la méthode volumétrique - 2.5.32 pour le titrage coulométrique Dosage de l’eau par la méthode de Karl Fischer : Principe : méthode de titrage de l’eau basée sur l’oxydation du dioxyde de soufre par l’iode en milieu non aqueux. Le solvant le plus utilisé pour cette réaction est le méthanol. Pour faire évoluer totalement la réaction vers la droite (consommer toute l’eau), il est nécessaire d’ajouter une substance pour neutraliser l’acide sulfurique et iodhydrique (pyridine, diéthanolamine, imidazole, …) Dosage de l’eau par la méthode de Karl Fischer : - Semi-microdosage de l’eau (2.5.12) : Méthode volumétrique Terme de la réaction : Un faible courant, constant, appelé courant de polarisation (Ipol = 20 µA), est appliqué entre deux électrodes de platine plongée dans le milieu réactionnel. Tant que l’iode ajouté au système réagit avec l’eau, il n’y a pas d’iode moléculaire libre en solution. Par conséquent, une différence de potentiel élevée (voltage élevé) est nécessaire pour maintenir le courant de polarisation spécifique de l’électrode. Une fois que toute l’eau contenue dans l’échantillon analytique est consommée par le réactif, de l’iode moléculaire libre se retrouve en solution. Cet iode favorise la conduction ionique du courant électrique en solution. Par conséquent, la différence de potentiel nécessaire au maintien du courant de polarisation diminue. Lorsque cette différence de potentiel passe sous la barre d’une valeur spécifique, déterminée par l’analyste, le titrage prend fin. Exemples : AMPICILLINE SODIQUE Essai Eau (2.5.12) : au maximum 2,0 pour cent, déterminé sur 0,300 g d'ampicilline sodique. CILAZAPRIL Essai Eau (2.5.12) : 3,5 pour cent à 5,0 pour cent, déterminé sur 0,300 g de cilazapril. → Rem : Il y a un minium de pourcentage car cilazapril est déjà sous forme monohydratée (donc a déjà la présence d’eau, d’où la présence d’un % minimum). - Microdosage de l’eau (2.5.32): Titrage coulométrique Par opposition à la méthode volumétrique (2.5.12. Semi-microdosage de l'eau), l'iode est produit de manière électrochimique dans la cuve, par oxydation d'iodure. L'iode produit au niveau de l'anode réagit immédiatement avec l'eau et le dioxyde de soufre contenus dans la cuve. → C’est le même principe mais l’appareillage est différent. Cendres sulfuriques (2.4.14.) Chauffez un creuset de platine, de porcelaine ou de quartz à 600 ± 50°C pendant 30 min. Laissez refroidir dans un dessiccateur sur du gel de silice et pesez. Dans le creuset, introduisez la prise d’essai et pesez. Humectez la substance à examiner avec un peu d’acide sulfurique R (généralement 1 ml) et chauffez doucement, à une température aussi faible que possible, jusqu’à carbonisation complète de l’échantillon. Après refroidissement, humectez le résidu avec un peu d’acide sulfurique R. Chauffez doucement jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dégagement de fumées blanches, puis calcinez à 600 ± 50°C jusqu’à complète incinération du résidu. Veillez à ce qu’il n’y ait aucune émission de flammes lors du procédé. Laissez refroidir le creuset dans un dessiccateur sur du gel de silice, pesez à nouveau et calculez la masse du résidu. Si la masse du résidu ainsi obtenue dépasse la limite indiquée, poursuivez la calcination comme précédemment jusqu’à obtention d’une masse constante, sauf indication contraire. Schéma : Tarer le creuset après chauffage à 600°C et refroidir dans un dessiccateur sur gel de silice + PE + H2SO4 Chauffage modéré jusqu’à carbonisation complète de la PE + H2SO4 Chauffage modéré jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de dégagement de fumées blanches (= excès d’acide sulfurique) Calcination à 600°C jusqu’à complète incinération du résidu Refroidissement dans un dessiccateur sur gel de silice Utilisation : - Pour les substances organiques synthétiques généralement plus pures que substances naturelles - Méthode plus sensible que les cendres totales Recherche ? Souvent Na+ et K + (destruction de la matière organique avec formation de CO 2 et H2O, il reste souvent des ions : notamment Na et K) H2SO4 ? - Ajout d’acide sulfurique en présence de Na et K → formation de Na2SO4 et K2SO4 - SO42- permet d’augmenter la masse du résidu → pesée plus aisée → Plus sensible (10x) Fumées blanches ? Élimination de l’excès de H2SO4 Cendres totales (2.4.16.) Chauffez au rouge un creuset de silice ou de platine pendant 30 min. Laissez refroidir dans un dessiccateur, puis pesez. Sauf indication contraire, introduisez dans le creuset 1,00 g de substance ou de drogue pulvérisée. Distribuez uniformément la prise d’essai à l’intérieur du creuset. Desséchez pendant 1 h à 100- 105°C, puis incinérez dans un four à moufle, à une température de 600 ± 25°C. L’échantillon ne doit s’enflammer à aucun moment de l’opération. Continuez l’incinération jusqu’à masse constante. Après chaque incinération, laissez refroidir le creuset au dessiccateur. Si les cendres contiennent encore des particules noires, après une incinération prolongée, reprenez-les à l’eau chaude et filtrez sur un filtre sans cendres. Incinérez à nouveau le résidu avec le filtre. Réunissez le filtrat et les cendres, évaporez prudemment à siccité et incinérez jusqu’à masse constante. Schéma : Tarer le creuset après chauffage et refroidissement dans un dessiccateur sur gel de silice + PE (1g) Dessécher pendant 1 h à 100-105°C Incinérer dans un four à moufle (T 0 : dextrogyre) USP Optical Rotation 〈781S〉, Procedures, Specific Rotation Sample solution : Equivalent to 30 mg/mL of anhydrous Levothyroxine Sodium in alcohol and 1 N sodium hydroxide (2:1) Acceptance criteria : −5° to −6° En fonction de la nature des solvants pour préparer la solution, dans un cas la substance est lévogyre et dans l’autre elle est dextrogyre (d’un côté en milieu acide et de l’autre en milieu basique → modification du sens de polarisation de la lumière). Le pouvoir rotatoire est donc influencé par le solvant : dans une solution d’HCl et EtOH → la lévothyroxine est dextrogyre. Pouvoir rotatoire spécifique : unité sous-entendue (on ne la note pas). Critère d’acceptation : unité en degrés. 4.3.3. Dosage Remarque : si on utilise une solution différente pour le dosage et pour les substances apparentées (essai), c’est que la solution pour les substances apparentées est trop concentrée en produit (permet de détecter les impuretés). Ça provoquerait une saturation du détecteur donc des conditions qui ne sont pas appropriées pour un dosage. On prépare donc une autre solution moins concentrée pour réaliser le dosage. Titrages acide-base Avantages Inconvénients - Méthode de dosage absolu (pas besoin de - Peu ou pas spécifique (toutes les substance chimique de référence SCR >< substances à caractères acide ou basique techniques séparatives) vont réagir, donc les impuretés aussi) - Stœchiométrie connue - Quantité de substance mise en œuvre : - Grande précision (limite supérieure relativement importante (0,5 g, 1 g) jusqu’à 101% avec un titrage) Types de titrages acide-base : - Milieu aqueux : si le caractère acide-base est suffisamment marqué. Ex : acide carboxylique - Milieu alcoolique : éthanol ou éthanol + eau. Ex : chlorhydrates de bases organiques (on utilise une base forte pour doser un acide faible). - Milieu non-aqueux : milieu anhydre (rarement tout à fait anhydre). Ex : bases très faibles (on utilise un acide très fort pour doser une base faible). → Quand on demande ce qu’on dose : il faut écrire le nom de la fonction chimique que l’on va doser (important de savoir ce que l’on dose) Détection du terme : Indicateurs colorimétriques Détection potentiométrique - Peu utilisés - Recommandée par la Ph. Eur. - Généralement pas recommandé par la Ph. - Electrode de référence : Ag/AgCl ou Eur. calomel - Electrode indicatrice : électrode à pH (verre) a) Titrages en milieu aqueux - Nivellement des acides forts à la force de H3O+ (acide le + fort en milieu aqueux). HA + H2O → A– + H3O+ - Nivellement des bases fortes à la force de OH - (base la plus forte en milieu aqueux). B + H2O → BH+ + OH– Par conséquent, pour exalter l’acidité, nécessité de passer en milieu non aqueux : → Milieu alcoolique (réservé aux acides) → Milieu anhydre Réactifs titrants : - NaOH (ac. carboxyliques, ac. aromatiques, etc.) - HCl (bicarbonate de sodium, etc.) Limite de pKa pour être titrable en milieu aqueux ? → Impossible de titrer en milieu aqueux quand pKa > 6 (sauf par ex. borax : pKa 9) b) Titrages en milieu alcoolique Raisons : - Substances peu solubles dans l’eau - Pour exalter l’acidité (acides faibles) Limites de pKa pour être titrable en milieu alcoolique ? Pourquoi passer de 11 à 10 ? - Changement de solvant = changement de pKa - pKa EtOH > pKa eau - Perte de 1 unité → pKa < 10 Les acides en milieu éthanoliques sont moins acides (moins forts) donc les pKa en milieu éthanoliques sont plus élevés que les pKa en milieu aqueux. Néanmoins, gain de 4 unités de pKa par rapport à l’eau : Principe : Exemple : PROMETHAZINE CHLORHYDRATE (MM : 320,9) (pKa = 9,1) Dosage Dissolvez 0,250 g de chlorhydrate de prométhazine dans un mélange de 5,0 ml d’acide chlorhydrique 0,01 M et de 50 ml d’éthanol à 96 pour cent R. Titrez par l’hydroxyde de sodium 0,1 M et tracez la courbe potentiométrique (2.2.20). Mesurez le volume d’hydroxyde de sodium 0,1 M utilisé entre les 2 points d’inflexion. 1 ml d’hydroxyde de sodium 0,1 M correspond à 32,09 m g de C17H21ClN2S. Principe : + 5 ml HCl 0,01 M + 50 ml EtOH Titrage par NaOH 0,1 M → Mesurez le volume de NaOH 0,1 M entre les 2 points d’inflexion Titrage avec 2 sauts de pH : - 1e saut = titrage de l’acide + fort - Titrage HCl = V1 ml de NaOH - 2e saut = titrage de l’acide + faible (= amine protonée, BH+) - Titrage des deux acides = V2 ml = Vtotal de NaOH → V2 – V1 =VBH+ mL de NaOH Intérêt du titrage en milieu alcoolique : - Recherche d’impuretés alcalines (X). Dans ce cas une partie du HCl sert à former du XH + : → HCl consommé (< 5 ml) → V1 diminue - Recherche d’impuretés acides (XH+) : → HCl (5 ml) + XH+ → V1 augmente - Garantir que l’on dose l’ensemble du PA : ▪ Si on dosait directement, on ne doserait que BH+ sans tenir compte de la fraction non salifiée du PA ▪ Addition de HCl permet de s’assurer que tout la base est sous forme de BH+ (B + BH+ → BH+) c) Titrages en milieu anhydre Rappel, en milieu aqueux : - Nivellement des acides forts à la force de H3O+ (HA + H2O → A– + H3O+) - Nivellement des bases fortes à la force de OH - (B + H2O → BH+ + OH–) → Cette propriété de nivellement est caractéristique des amphotères. Que peut-on faire quand il s’agit d’une base très faible ? Dosage d’une base très faible : L’ion hydroxonium (H3O+) est un acide de force insuffisante. Il faut donc trouver un milieu amphotère permettant d’obtenir des acides + forts → l’acide acétique qui est également amphotère selon le couple : En milieu acétique : - Nivellement des acides à la force de l’ion acétylium CH3COOH2+ : HClO4 + CH3COOH → ClO4- + CH3COOH2+ pKa de l’ion acétylium < pKa H3O+ → acide + fort - Nivellement des bases fortes à la force de l’ion acétate CH3COO- : B + CH3COOH → BH+ + CH3COO- Remarques : - On peut utiliser l’acide formique comme milieu pour titrer des bases encore plus faibles (à la place de l’acide acétique), on obtient l’ion formylium (acide encore + fort) à la place de l’ion acétylium. - En milieu anhydre, BH+ est neutre dans la réaction (pas de caractère acide par rapport à l’acétylium, il n’intervient pas dans la réaction) → différence avec le milieu alcoolique (où là, on titre BH+). En milieu anhydre : - ClO4- est neutre et n’a pas de rôle (par comparaison à Cl- en milieu aqueux) - BH+ est neutre et n’a pas de rôle (par comparaison à Na+ en milieu aqueux) Applications : Dosage des bases très faibles par un acide très fort Remarque : s’il s’agit de doser un acide très faible, il faudra le faire avec une base forte (butylamine, triéthanolamine) en milieu non aqueux. Ceci est pratiquement impossible car les bases fortes réagissent préférentiellement avec le CO2 atmosphérique. Solution → dosage sous atmosphère d’azote. Application (1) : titrage direct de bases très faibles Exemple : NOSCAPINE (MM : 413,4) Dosage Dissolvez 0,350 g de noscapine dans 40 ml d’acide acétique anhydre R, en chauffant légèrement. Titrez par l’acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 41,34 mg de C 22H23NO7. → Formation d’un ion acétate qui sera dosé par l’ion acétylium (formé précédemment dans la réaction avec l’acide perchlorique). Application (2) : titrage du contre-ion de sels de bases faibles et d’acides faibles Citrates, tartrates, salicylates, maléates,... Phtalate acide de K → Sert à étalonner l’acide perchlorique (HClO4) : HClO4 + CH3–COOH  ClO4- + CH3–COOH2+ A– +CH3–COOH2+ → HA +CH3–COOH → L’ion acétylium est l’espèce titrante en milieu anhydre : il réagit avec le carboxylate du phtalate acide de potassium. Exemples : CITRATE DE TAMOXIFENE (MM : 563,6) Dosage Dissolvez 0,400 g de citrate de tamoxifène dans 75 ml d’acide acétique anhydre R. Titrez par l’acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 56,36 mg de C32H37NO8. → Attention : les molécules sont représentées sur l’image comme (COOH) et (NH2) mais en réalité ce n’est pas comme ça qu’elles sont. En réalité, le N est chargé positivement car un H de l’acide citrique est sur lui ( NH+) et donc l’acide citrique est chargé négativement sur un O ( COO-) → la fonction titrée est le carboxylate (COO-) et non COOH car le proton a réagi avec l’amine aliphatique avant ! TARTRATE D’ADRENALINE (MM : 333,3) Dosage Dissolvez 0,300 g de tartrate d’adrénaline dans 50 ml d’acide acétique anhydre R en chauffant modérément si nécessaire. Titrez par l’acide perchlorique 0,1 M en présence de 0,1 ml de solution de violet cristallisé R jusqu’à virage au vert-bleu. 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 33,33 mg de C 13H19NO9. → Un des H d’une fonction acide carboxylique de l’acide tartrique a été réagir avec l’amine de l’adrénaline, une des fonctions COO- est alors titrée par l’ion acétylium. La molécule contient 2 fonctions COOH donc les deux foncions COO- pourront être titrées par l’ion acétyllium. MALEATE DE BROMPHENIRAMINE (MM : 435,3) Dosage Dissolvez 0,260 g de maléate de bromphéniramine dans 50 ml d’acide acétique anhydre R. Titrez par l’acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 21,77 mg de C20H23BrN2O4. → Ici il y a 2 équivalents : le premier est un carboxylate et le deuxième est la fonction pyridine (azote aromatique). On est en milieu anhydre donc la base très forte peut titrer la base très faible. → À chaque fois, il y a formation d’un carboxylate (le COOH donne un H+ à l’azote, l’azote va former un NH+ qui équivaut au BH+ et qui n’a aucun rôle dans la réaction)  formation d’une base faible (carboxylate). Application (3) : titrage du contre-ion de sels de bases faibles et d’acides plus forts 1e exemple : phosphate de codéine (= sel) → Un proton de l’acide phosphorique a réagi avec l’amine aliphatique de la codéine pour former une amine protonée. Il reste donc H2PO4-. L’ion acétylium (chargé positivement) titre le dihydrogéno- phosphate (chargé négativement). PHOSPHATE DE CODEINE (MM : 406,4) Dosage Dissolvez 0,350 g de substance à examiner dans 50 mL d'acide acétique anhydre R. Titrez par l'acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 39,74 mg de C 18H24NO7P Le phosphate de codéine est hémi-hydraté, la teneur en PA se calcule par rapport à la masse desséchée, il faut donc retirer une demi-molécule d’eau à la MM. Calcul : (406,4 : 1000) : 10 = 40, … or ici on a 39,74 mg → différence due à la présence d’une demi-molécule d’eau. - Divisé par 1000 car 1ml - Divisé par 10 = c’est comme si on faisait x 0,1 (pour 0,1M) Calcul par rapport à la substance desséchée* : MM d’une demi-molécule d’eau = 9 g/mol. (406,4 – 9) = 397,4. 397,4 : 1000 = 0,397,4 : 10 = 0,03974 = 39,74mg Donc, si on refait le même calcul en tenant compte de la substance desséchée, on obtient bien la bonne réponse. *La teneur se calcule via : 1. La substance desséchée 2. La substance anhydre → Retirer l’eau au niveau de la phrase d’équivalence ! 2e exemple : sulfate d’atropine SULFATE D’ATROPINE (MM : 695) Dosage Dissolvez 0,500 g de sulfate d’atropine dans 30 ml d’acide acétique anhydre R en chauffant si nécessaire. Refroidissez la solution. Titrez par l’acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 67,68 mg de C 34H48N2O10S. → Le phosphate de codéine est monohydraté, la teneur en PA se calcule par rapport à la substance desséchée, il faut donc retirer une molécule d’eau à la MM. Calcul : MM d’une molécule d’eau = 18 g/mol 695 – 18 = 677 (MM de la substance desséchée) 677 : 1000 = 0,677 : 10 = 0,0677 = 67,7 mg 3e exemple : sulfate de quinine Explication : → Dans le sulfate de quinine, on a deux molécules de quinine par molécule d’acide sulfurique (qui va libérer ses deux protons : H2SO4 = 2H+ + SO42-). → L’acide sulfurique donne ses 2 protons à 2 molécules de quinine au niveau de l’azote aliphatique (il n’y a pas d’H+ qui réagit avec l’azote quinoléique car il est impliqué dans la résonance). On a donc 1 équivalent en ce qui concerne le sulfate. → L’ion acétylium titre l’acide quinoléique car c’est un acide très fort donc il y arrive.  Comme il y a 2 molécules de quinine par mole de sulfate de quinine (petit 2 en bas à droite des crochets sur la molécule), il y a 2 équivalents + 1 équivalent en ce qui concernait le sulfate, donc en tout on en a 3. En résumé, on a 3 équivalents car : - 1 H2SO4 permet de réagir avec les 2N non quinoléiques (1 H2SO4 peut libérer 2H+) = 1 EQ. - Il faut 2 ions acétyliums car chaque ion acétylium réagit avec 1 N quinoléique (entre crochets avec le 2 entouré en bleu, en tout on en a 2). = 2 EQ.  1 H2SO4 + 2 ions acétyliums = 3 équivalents. SULFATE DE QUININE (MM : 783) Dosage Dissolvez 0,300 g de sulfate de quinine dans un mélange de 10 ml de chloroforme R et de 20 ml d ’ anhydride acétique R. Titrez par l ’ acide perchlorique 0,1 M. Déterminez le point de fin de titrage par potentiométrie (2.2.20). 1 ml d’acide perchlorique 0,1 M correspond à 24,90 mg de C 40H50N4O8S. Calcul en tenant compte des 3 équivalents : 2 molécules d’eau à enlever donc MM pour 2 molécules d’eau = 36g/mol 783 – 36 = 747 747 : 1000 = 0,747 : 10 = 0,0747 = 74,7 mg 74,7 mg : 3 équivalents = 24,9 mg Spectrophotométrie UV/Vis Usage en industrie et en hôpital. → Usage qualitatif = identification d’une substance (voir plus haut) - Soit par comparaison au spectre de la SCR - Soit par un maximum/minimum d’absorption (ou plusieurs) - Soit par calcul de A1% 1cm → Usage quantitatif = dosage d’une substance - Au moyen du A1% 1cm Exemple : RIBOFLAVINE (PHOSPHATE SODIQUE DE) HYDRATÉ Dosage Effectuez le dosage à l’abri de la lumière. Dissolvez 0,100 g de substance à examiner dans 150 ml d’eau R, ajoutez 2 ml d’acide acétique glacial R et complétez à 1000,0 ml avec de l’eau R. A 10,0 ml de solution, ajoutez 3,5 ml d’une solution à 14 g/L d’acétate de sodium R et complétez à 50,0 ml avec de l’eau R. Mesurez l’absorbance (2.2.25) au maximum d’absorption à 444 nm. Calculez la teneur en C17H20N4O6 en prenant 328 comme valeur de l’absorbance spécifique. Techniques séparatives : LC/GC/CE Procédure : quantification - Méthode de l’étalon externe → Fonction d’étalonnage → Étalonnage monopoint - Méthode de l’étalon interne → Fonction d’étalonnage → Étalonnage monopoint 4.3.4. Étude de cas CODEINE (PHOSPHATE DE) HEMIHYDRATE Résultats : IDENTIFICATION Première identification : B, E, F. - Identification B : IR Les minimums de transmission du spectre obtenu avec la substance à examiner correspondent en position et en dimensions relatives à ceux du spectre de référence → Conforme ! On mesure le spectre de la codéine et non du phosphate de codéine. - Identification E : perte à la dessiccation (voir Essai) Tare : 25,3548 g Tare + essai : 26,3552 g Tare + essai après dessiccation : 26,3349 g Résultat : 2,0% (2,03%) * Normes : 1,5% à 3,0% (il y a un minimum de 1,5% d’eau car c’est une molécule hémi-hydratée donc doit contenir un minimum d’eau) → Conforme * s’entrainer à faire les calculs pour trouver le résultat. Le résultat doit avoir le même nombre de chiffres significatifs que la norme !!! - Identification F : La solution S donne la réaction (a) des phosphates (2.3.1). a) A 5 ml de la solution prescrite, neutralisée si nécessaire, ajoutez 5 ml de solution de nitrate d’argent R1. Il se forme un précipité jaune dont la coloration n’est pas modifiée par ébullition, et qui se dissout par addition d’ammoniaque R. → Conforme ESSAI pH (2.2.3) - Résultat : 4,4 (4,43) - Normes : 4,0 à 5,0 → Conforme Pouvoir rotatoire spécifique (2.2.7) - Pesée : 1,0010 g Pesée (substance desséchée) : 0,9807 g → Concentration : 0,019614 g/mL. Le pouvoir rotatoire se calcule par rapport à la substance desséchée (on doit faire le calcul pour trouver la pesée de substance desséchée par rapport à la pesée initiale) + Tenir compte de la perte à la dessication lors du calcul de la concentration - α = - 3,88° - Trajet optique de la cellule de mesure du polarimètre : 2 dm - [α ]20 D = -99 (-98,91)* - Normes : -98 à -102 (substance desséchée) → Conforme * s’entrainer à faire les calculs pour trouver le résultat. Substances apparentées Conformité du système (solution témoin (d) : Résolution codéine/impureté A : 12 (11,57) Normes : ≥ 3 → Conforme Limites : - Limite d’exclusion : 0,5 x 29,86599* = 14,932995 Seule 1 impureté est supérieure à la limite d’exclusion : - Impureté A : 35,49682 ≤ 2 x 209,32103** → 35,49682 ≤ 418,64206 Normes : ≤ 1,0% → Conforme - Somme des impuretés B et E : < limite d’exclusion Normes : ≤ 0,4% → Conforme - Impuretés C, D : < limite d’exclusion Normes : chaque impureté ≤ 0,2% → Conforme - Impuretés non spécifiées : < limite d’exclusion Normes : chaque impureté ≤ 0,10% → Conforme - Somme des impuretés autres que A : < limite d’exclusion Normes : ≤ 1,0% → Conforme Essai → Conforme *Surface pic témoin (c) **Surface pic témoin (b) Remarque : on doit noter tous les items dans notre rapport même si les impuretés ne sont pas présentes. Sulfates (2.4.13) Prélevez 5 mL de solution S et complétez à 20 mL avec de l’eau distillée R. Toutes les solutions utilisées dans cet essai doivent être préparées à partir d’eau distillée R. A 4,5 mL de solution à 10 ppm de sulfate (SO4) R1, ajoutez 3 mL d’une solution de chlorure de baryum R à 250 g/L. Agitez et laissez reposer pendant 1 min. A 2,5 mL de cette suspension, ajoutez 15 mL de solution prescrite et 0,5 mL d’acide acétique R. Préparez le témoin dans les mêmes conditions en utilisant 15 mL de solution à 10 ppm de sulfate (SO4) R au lieu de la solution prescrite. Après 5 min, si la solution à examiner présente une opalescence, celle-ci n’est pas plus prononcée que celle du témoin. E

Chapitre 4 : Contrôle qualitatif et quantitatif des médicaments PDF

Document Details

Tags

Related

Summary

Full Transcript

Upgrade to continue